WWOX、STAT3與c-myc在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)特征及關(guān)聯(lián)機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌每年導(dǎo)致大量患者死亡，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。在肺癌眾多類型中，非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）最為常見(jiàn)，約占所有肺癌病例的80%-85%。根據(jù)組織學(xué)特征，NSCLC又可進(jìn)一步細(xì)分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等亞型，不同亞型在發(fā)病機(jī)制、臨床特征和治療反應(yīng)等方面存在顯著差異。盡管近年來(lái)在NSCLC的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的優(yōu)化以及靶向治療和免疫治療的興起，但總體來(lái)說(shuō)，NSCLC患者的5年生存率仍然相對(duì)較低，徘徊在20%-30%左右。早期NSCLC患者在經(jīng)過(guò)根治性治療后，5年生存率可達(dá)到80-90%，但由于早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療效果不佳，中位生存期僅為8-10個(gè)月，一年生存率為30-35%。因此，深入了解NSCLC的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高患者生存率和改善預(yù)后具有重要意義。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（SignalTransducerandActivatorofTranscription3，STAT3）是一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，STAT3的激活受到嚴(yán)格調(diào)控，但在多種腫瘤細(xì)胞中，包括NSCLC，STAT3常處于持續(xù)激活狀態(tài)，導(dǎo)致其下游一系列與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的異常表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移，并抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。包含氧化還原酶的WW結(jié)構(gòu)域（WWDomain-ContainingOxidoreductase，WWOX）基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因，定位于染色體16q23.3-24.1區(qū)域，該區(qū)域是常見(jiàn)的染色體脆性位點(diǎn)FRA16D所在位置，容易在外界因素如香煙等的作用下發(fā)生基因變異。多項(xiàng)研究表明，WWOX基因表達(dá)缺失或下調(diào)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在NSCLC中，WWOX的低表達(dá)或表達(dá)缺失可能削弱其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。原癌基因c-myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。在正常細(xì)胞中，c-myc的表達(dá)受到精細(xì)調(diào)控，但在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，c-myc常常發(fā)生異常激活或過(guò)表達(dá)，通過(guò)調(diào)控一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖和腫瘤的形成。在NSCLC中，c-myc的過(guò)表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能和不良預(yù)后相關(guān)。研究STAT3、WWOX與c-myc在NSCLC中的表達(dá)情況及其相互關(guān)系，有助于深入揭示NSCLC的發(fā)病機(jī)制，為NSCLC的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。通過(guò)檢測(cè)這三個(gè)分子的表達(dá)水平，可能發(fā)現(xiàn)它們作為生物標(biāo)志物在NSCLC診斷和預(yù)后判斷中的價(jià)值；探討它們之間的相互作用關(guān)系，有望揭示NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號(hào)通路，為開(kāi)發(fā)針對(duì)這些通路的靶向治療藥物提供思路，從而提高NSCLC的治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，關(guān)于STAT3在NSCLC中的研究起步較早。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的持續(xù)激活在NSCLC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色。多項(xiàng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，抑制STAT3的活性能夠顯著抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如在對(duì)A549等NSCLC細(xì)胞系的研究中，通過(guò)使用STAT3抑制劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時(shí)促凋亡蛋白的表達(dá)增加。臨床研究方面，有研究對(duì)大量NSCLC患者的腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)STAT3的磷酸化水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，高磷酸化STAT3表達(dá)的患者總體生存率較低。關(guān)于WWOX基因，國(guó)外研究證實(shí)其在NSCLC中存在頻繁的表達(dá)缺失或下調(diào)。通過(guò)對(duì)不同病理類型和分期的NSCLC組織樣本分析，發(fā)現(xiàn)WWOX表達(dá)缺失與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，且在肺腺癌中的表達(dá)缺失率高于肺鱗癌。在動(dòng)物模型研究中，將WWOX基因轉(zhuǎn)染至WWOX低表達(dá)的NSCLC細(xì)胞，然后接種到裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢，轉(zhuǎn)移潛能降低，進(jìn)一步表明WWOX具有抑制NSCLC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。對(duì)于c-myc基因，國(guó)外研究表明其在NSCLC中的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及患者的不良預(yù)后緊密相連。c-myc過(guò)表達(dá)可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。有研究利用基因編輯技術(shù)敲低NSCLC細(xì)胞中的c-myc基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力顯著下降，細(xì)胞凋亡增加，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，敲低c-myc的腫瘤細(xì)胞形成的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組。在國(guó)內(nèi)，學(xué)者們也對(duì)這三個(gè)分子在NSCLC中的表達(dá)及相關(guān)性進(jìn)行了大量研究。胡福英等人應(yīng)用免疫組化染色S-P法，檢測(cè)了STAT3、WWOX及c-myc在40例NSCLC組織和20例正常肺組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)STAT3和c-myc在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為92.5%和90%，均明顯高于肺正常組織；WWOX在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)率為30%，明顯低于肺正常組織。此外，STAT3與WWOX在NSCLC組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，但STAT3與c-myc蛋白、WWOX與c-myc在NSCLC組織中的表達(dá)均不相關(guān)。李秋芳等人用免疫組化方法檢測(cè)50例鱗癌、31例腺癌及20例癌旁正常組織中WWOX基因蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)WWOX基因在72.8%的非小細(xì)胞肺癌中失表達(dá)或表達(dá)減少，而在相鄰正常肺組織中有80.0%正常表達(dá)，且WWOX基因的表達(dá)與組織類型、細(xì)胞分化程度密切相關(guān)，在鱗癌和低分化癌中WWOX基因失表達(dá)或表達(dá)減少。當(dāng)前研究仍存在一定的不足。一方面，雖然已明確STAT3、WWOX和c-myc在NSCLC中表達(dá)異常且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但對(duì)于它們之間復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。例如，雖然發(fā)現(xiàn)STAT3與WWOX表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但具體通過(guò)何種信號(hào)通路相互影響還不清楚；對(duì)于STAT3與c-myc、WWOX與c-myc看似不相關(guān)的關(guān)系，是否存在其他未知的調(diào)節(jié)因素或間接的聯(lián)系也有待進(jìn)一步探索。另一方面，現(xiàn)有的研究多集中在細(xì)胞和組織水平，在動(dòng)物整體模型以及臨床大樣本、多中心的研究相對(duì)較少，這限制了對(duì)這些分子在NSCLC發(fā)病機(jī)制中全面、深入的理解，也不利于將相關(guān)研究成果快速轉(zhuǎn)化為臨床有效的診斷和治療手段。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探討STAT3、WWOX與c-myc基因在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平，分析它們與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，以及這三個(gè)基因彼此之間的相關(guān)性，為揭示非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制、尋找潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將采用以下研究方法：標(biāo)本收集：收集[X]例經(jīng)手術(shù)切除并病理確診為非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本，同時(shí)收集相應(yīng)的癌旁正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照。詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。免疫組織化學(xué)檢測(cè)：運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法（如S-P法），檢測(cè)STAT3、WWOX與c-myc蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)情況。通過(guò)顯微鏡觀察染色結(jié)果，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析，明確這三種蛋白在不同組織中的表達(dá)差異。相關(guān)性分析：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，分析STAT3、WWOX與c-myc蛋白表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌各臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性，判斷這些基因的表達(dá)是否與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。同時(shí)，分析STAT3、WWOX與c-myc三者之間的表達(dá)相關(guān)性，探究它們?cè)诜切〖?xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在的相互作用機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1非小細(xì)胞肺癌概述非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）是一種起源于肺部支氣管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，與小細(xì)胞肺癌共同構(gòu)成肺癌的兩個(gè)主要類型。NSCLC約占所有肺癌病例的80%-85%，在肺癌中占據(jù)主導(dǎo)地位。其主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌三種常見(jiàn)類型，不同類型在發(fā)病機(jī)制、臨床特征等方面存在差異。腺癌在NSCLC中較為常見(jiàn)，約占40%，女性相對(duì)多見(jiàn)，主要起源于支氣管黏液腺，可發(fā)生于細(xì)小支氣管或中央氣道，且根據(jù)腫瘤基因檢測(cè)結(jié)果，可決定適合靶向藥物治療還是化療。鱗狀細(xì)胞癌常見(jiàn)于老年男性，一般生長(zhǎng)較慢，轉(zhuǎn)移晚，手術(shù)切除機(jī)會(huì)相對(duì)較多，5年生存率較高，但對(duì)化療和放療的敏感性不如小細(xì)胞肺癌。大細(xì)胞癌是一種未分化的非小細(xì)胞癌，較為少見(jiàn)，占肺癌的10％以下，在細(xì)胞學(xué)和組織結(jié)構(gòu)及免疫表型等方面缺乏小細(xì)胞癌、腺癌或鱗癌的特征，其轉(zhuǎn)移較晚，手術(shù)切除機(jī)會(huì)較大。此外，還存在腺鱗癌、肉瘤樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、NUT癌、唾液腺型癌等其他類型。非小細(xì)胞肺癌的病因十分復(fù)雜。吸煙是最為主要的危險(xiǎn)因素，大量研究表明，長(zhǎng)期吸煙尤其是重度吸煙的人群患NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，香煙中的尼古丁、焦油等多種致癌物質(zhì)會(huì)對(duì)肺部細(xì)胞造成損傷，引發(fā)基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。長(zhǎng)期接觸二手煙同樣會(huì)增加患病風(fēng)險(xiǎn)，即使自身不吸煙，但處于吸煙環(huán)境中，也會(huì)吸入有害物質(zhì)。職業(yè)暴露也是重要因素之一，如長(zhǎng)期接觸石棉、氡氣、鉻、鎳、砷等有害物質(zhì)的人群，患NSCLC的幾率明顯升高。石棉廣泛應(yīng)用于建筑、化工等行業(yè)，長(zhǎng)期接觸石棉纖維，可導(dǎo)致石棉肺，進(jìn)而增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；氡氣是一種天然放射性氣體，主要來(lái)源于土壤和巖石，室內(nèi)氡氣濃度過(guò)高會(huì)對(duì)肺部造成輻射損傷，引發(fā)癌癥?？諝馕廴荆ㄊ彝獾墓I(yè)廢氣、汽車尾氣以及室內(nèi)的烹飪油煙等，都含有大量的致癌物質(zhì)，長(zhǎng)期暴露在污染環(huán)境中，會(huì)損害肺部健康，增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。遺傳因素在NSCLC的發(fā)病中也起到一定作用，家族中有肺癌患者的人群，遺傳易感性相對(duì)較高，某些基因突變?nèi)鏓GFR、KRAS等，可能會(huì)增加個(gè)體對(duì)NSCLC的易感性。此外，某些肺部疾病如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、肺結(jié)核等，會(huì)導(dǎo)致肺部組織反復(fù)受損和修復(fù)，增加了癌變的可能性。NSCLC的早期癥狀往往不明顯，容易被患者忽視。隨著腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展，常見(jiàn)的癥狀逐漸顯現(xiàn)。持續(xù)性咳嗽是較為常見(jiàn)的癥狀之一，咳嗽可能會(huì)逐漸加重，且常規(guī)治療效果不佳；咳痰也較為常見(jiàn)，痰液可能會(huì)增多，有時(shí)還會(huì)伴有血絲，即咯血；胸痛也是常見(jiàn)癥狀，疼痛程度和性質(zhì)因人而異，可為隱痛、鈍痛或刺痛，且可能會(huì)隨著呼吸或咳嗽加重；氣短、呼吸困難則是由于腫瘤阻塞氣道或侵犯肺部組織，影響了肺部的正常通氣和換氣功能，導(dǎo)致患者呼吸不暢；發(fā)熱可能是由于腫瘤組織壞死引起的吸收熱，也可能是合并感染導(dǎo)致；體重減輕則是由于腫瘤消耗機(jī)體營(yíng)養(yǎng)，以及患者食欲下降等原因所致。當(dāng)腫瘤進(jìn)一步擴(kuò)散，還可能出現(xiàn)聲音嘶啞，這是因?yàn)槟[瘤侵犯了喉返神經(jīng)；吞咽困難則是腫瘤侵犯或壓迫食管引起；頸部淋巴結(jié)腫大則提示腫瘤可能已經(jīng)發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。非小細(xì)胞肺癌嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率和死亡率均較高。在全球范圍內(nèi)，NSCLC的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，每年新增病例眾多。由于早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度大大增加，患者的5年生存率較低，僅為20%-30%左右。對(duì)于晚期患者，中位生存期僅為8-10個(gè)月，一年生存率為30-35%，給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的身心負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力，也對(duì)社會(huì)醫(yī)療資源造成了巨大挑戰(zhàn)。2.2WWOX基因相關(guān)理論WWOX基因，全稱為“包含氧化還原酶的WW結(jié)構(gòu)域”（WWDomain-ContainingOxidoreductase）基因，是近年來(lái)備受關(guān)注的一個(gè)重要基因。它位于人類染色體16q23.3-24.1區(qū)域，該區(qū)域存在常見(jiàn)的染色體脆性位點(diǎn)FRA16D。WWOX基因結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，跨越了微衛(wèi)星標(biāo)記D16S515-D16S504，由9個(gè)外顯子組成，其基因組區(qū)域巨大，長(zhǎng)達(dá)1113822bp?；虻淖x碼框（ORF）長(zhǎng)度為1245bp，最終編碼出一個(gè)由414個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白，其相對(duì)分子量約為46000。WWOX蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，包含兩個(gè)位于N端的WW結(jié)構(gòu)域，分別在氨基酸18-47和59-88位置。這兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠識(shí)別并結(jié)合特定的富含脯氨酸的短肽序列，從而介導(dǎo)WWOX蛋白與其他多種蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，參與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。在兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域之間，存在一個(gè)核定位序列（NLS，氨基酸50-55），該序列可以引導(dǎo)WWOX蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)，WWOX可能參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等重要生物學(xué)過(guò)程。此外，WWOX蛋白的C端含有一個(gè)短鏈脫氫還原酶（SDR，氨基酸121-330）位點(diǎn)，這一結(jié)構(gòu)域賦予了WWOX蛋白氧化還原酶活性，使其能夠參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，維持細(xì)胞正常的生理功能。WWOX基因在細(xì)胞中發(fā)揮著多種重要的生物學(xué)功能。在細(xì)胞凋亡方面，WWOX能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到外界有害刺激或內(nèi)部出現(xiàn)異常時(shí)，WWOX蛋白表達(dá)上調(diào)，通過(guò)激活一系列凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。例如，WWOX可以與凋亡相關(guān)蛋白如Bax等相互作用，促進(jìn)Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位改變，釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以此清除體內(nèi)受損或異常的細(xì)胞，維持組織和器官的正常生理功能。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，WWOX參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)過(guò)程。它可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。具體來(lái)說(shuō)，WWOX能夠與CDK的調(diào)節(jié)亞基細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）結(jié)合，干擾Cyclin-CDK復(fù)合物的形成，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而控制細(xì)胞的增殖速度，維持細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定。在DNA損傷修復(fù)方面，WWOX也發(fā)揮著積極作用。當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，WWOX能夠被招募到損傷部位，參與DNA損傷修復(fù)機(jī)制。它可以與DNA修復(fù)相關(guān)蛋白如PARP1等相互作用，促進(jìn)DNA損傷的識(shí)別、修復(fù)和細(xì)胞周期的暫停，確保DNA損傷得到有效修復(fù)，避免因DNA損傷積累而導(dǎo)致基因突變和腫瘤發(fā)生。WWOX基因與腫瘤抑制密切相關(guān)，大量研究表明它是一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因。在多種惡性腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)了WWOX基因表達(dá)缺失或下調(diào)的現(xiàn)象。例如在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)WWOX基因的啟動(dòng)子區(qū)域頻繁發(fā)生甲基化，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄沉默，WWOX蛋白表達(dá)缺失，進(jìn)而使得腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，獲得增殖優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。在結(jié)直腸癌中，WWOX基因的雜合性缺失（LOH）較為常見(jiàn)，導(dǎo)致WWOX蛋白表達(dá)水平降低，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。在非小細(xì)胞肺癌中，WWOX基因同樣表現(xiàn)出異常表達(dá)。其低表達(dá)或表達(dá)缺失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相連。一方面，WWOX表達(dá)缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)增殖。正常情況下，WWOX通過(guò)誘導(dǎo)凋亡清除異常細(xì)胞，而在WWOX表達(dá)缺失的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，凋亡信號(hào)通路被抑制，細(xì)胞存活能力增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞不斷積累，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。另一方面，WWOX表達(dá)異?？赡苡绊懠?xì)胞周期調(diào)控，使細(xì)胞增殖失去控制。當(dāng)WWOX基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用減弱，細(xì)胞周期進(jìn)程加速，細(xì)胞異常增殖，增加了腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，WWOX還可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路，如抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，來(lái)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。在WWOX低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌中，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，影響患者的預(yù)后。2.3STAT3基因相關(guān)理論STAT3，即信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（SignalTransducerandActivatorofTranscription3），是STAT蛋白家族中的重要成員。其基因定位于人類染色體17q21，編碼的STAT3蛋白相對(duì)分子量約為89kD。STAT3蛋白具有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域在其功能實(shí)現(xiàn)中發(fā)揮著不可或缺的作用。N-端結(jié)構(gòu)域位于蛋白的氨基末端，它參與了STAT3蛋白的二聚體化過(guò)程。在STAT3激活后，N-端結(jié)構(gòu)域通過(guò)特定的相互作用，促使STAT3蛋白形成同源或異源二聚體，為后續(xù)的核轉(zhuǎn)位和DNA結(jié)合等功能奠定基礎(chǔ)。DNA結(jié)合區(qū)能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合DNA序列，其識(shí)別的核心序列為5'-TTn4AA-3'。當(dāng)STAT3二聚體進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA結(jié)合區(qū)就會(huì)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)序列結(jié)合，從而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，如抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1等的轉(zhuǎn)錄就受到STAT3的調(diào)控。連接結(jié)構(gòu)域雖然目前其具體功能尚不十分明確，但它在維持STAT3蛋白整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及協(xié)調(diào)其他結(jié)構(gòu)域之間的相互作用方面可能發(fā)揮著重要作用。SH2（Src同源區(qū)域2）/酪氨酸磷酸化位點(diǎn)區(qū)對(duì)于STAT3的活化至關(guān)重要，該區(qū)域包含高度保守的酪氨酸殘基Y705。在細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，SH2區(qū)能夠識(shí)別并結(jié)合到酪氨酸磷酸化的受體上，同時(shí)，Y705殘基被磷酸化，這一過(guò)程是STAT3活化的關(guān)鍵步驟，促使STAT3發(fā)生同源二聚化。C-末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)C-末端的絲氨酸（S727）或接近C端的酪氨酸（Y705）被磷酸化后，STAT3被激活，其C-末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域就會(huì)與其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子相互作用，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。STAT3的激活需要一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，多種配體可以激活STAT3信號(hào)通路。細(xì)胞因子類如白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素10（IL-10）等，它們?cè)诿庖哒{(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是STAT3的重要激活劑。以IL-6為例，IL-6受體由特異性的α亞基與gp130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白組成，所有IL-6家族蛋白共用gp130作為受體亞單位。當(dāng)IL-6與特異性IL-6Rα亞基結(jié)合后，會(huì)引起gp130同源二聚化，隨后JAKs（JAK1、JAK2、TYK2）在gp130的胞質(zhì)區(qū)交聯(lián)，導(dǎo)致gp130自身的酪氨酸殘基磷酸化，gp130胞質(zhì)尾區(qū)的四個(gè)酪氨酸殘基Y767、Y814、Y905及Y915磷酸化可以促進(jìn)STAT3通過(guò)SH-2而激活。此外，酪氨酸磷脂酶SHP2與gp130胞質(zhì)區(qū)近端的YxxVmotif結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致人Y759或鼠Y757的磷酸化，進(jìn)而激活SHP2-Gab-Ras-ERK-MAPK通路。同時(shí)，YxxQmotif也是STAT3負(fù)性調(diào)節(jié)物SOCS3的停泊位點(diǎn)，若特異性敲除Y757（如小鼠Y757F模型，苯丙氨酸替代纈氨酸），會(huì)使SOCS3喪失停泊位點(diǎn)，無(wú)法發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)活化STAT3的作用，從而導(dǎo)致STAT3過(guò)度活化，引發(fā)炎癥以及腫瘤的發(fā)生。生長(zhǎng)因子類如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2/Neu）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等也能激活STAT3。生長(zhǎng)因子主要通過(guò)受體酪氨酸激酶（RTK）途徑激活STAT3。在正常情況下，RTK激活經(jīng)典的Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，但當(dāng)該通路過(guò)度活化時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)JAK-STAT通路的激活。其機(jī)制主要有兩種：一是RTK的直接激活，例如EGFR、血小板源性生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）能夠引起非JAK依賴性的STAT3活化，這種活化可能與Src激酶（SFK）有關(guān)；二是RTK/Ras通路的刺激引起MAPKs活化，MAPKs能夠特異性地將STAT3C末端的絲氨酸727磷酸化，進(jìn)而激活STAT3。原癌蛋白c-Src作為一種非受體酪氨酸激酶，能夠不依賴于JAKs直接活化STAT3。異常激活的c-Src蛋白依靠活化的STAT3發(fā)揮致瘤效應(yīng)，病毒通過(guò)c-Src蛋白引發(fā)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化也依賴于活化的STAT3。但在頭頸腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，c-Src抑制劑Dasatinib雖可抑制STAT3的表達(dá)，但持續(xù)作用后STAT3會(huì)重新活化，且此過(guò)程依賴于JAKs，若Dasatinib聯(lián)合敲除STAT3，腫瘤的抑制作用會(huì)明顯提高，這表明c-Src通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3的表達(dá)發(fā)揮致癌作用，且c-Src/STAT3與JAKs/STAT3相互代償。活化的STAT3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵作用。在細(xì)胞增殖方面，STAT3可以調(diào)控一系列與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期過(guò)渡，從而加速細(xì)胞的增殖。研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，抑制STAT3的活性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，細(xì)胞增殖速度明顯減緩。在抗凋亡作用上，STAT3通過(guò)激活抗凋亡基因如Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，獲得生存優(yōu)勢(shì)。在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，STAT3也扮演著重要角色，它可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)，如上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，STAT3還參與腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)，通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。在免疫調(diào)節(jié)方面，持續(xù)激活的STAT3會(huì)抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，它可以抑制樹突狀細(xì)胞的成熟和功能，降低其抗原呈遞能力，同時(shí)抑制T細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的產(chǎn)生，從而營(yíng)造有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和逃逸的免疫微環(huán)境。在非小細(xì)胞肺癌中，STAT3常處于異常激活狀態(tài)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者腫瘤組織中STAT3的磷酸化水平顯著高于正常肺組織，且其磷酸化水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。高磷酸化STAT3表達(dá)的患者往往腫瘤分期較晚，更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，總體生存率較低。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，抑制NSCLC細(xì)胞中STAT3的活性，能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明STAT3的異常激活在NSCLC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵的推動(dòng)作用。2.4c-myc基因相關(guān)理論c-myc基因是一種重要的原癌基因，在細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和分化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。其基因結(jié)構(gòu)包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，外顯子1不編碼蛋白質(zhì)，主要參與基因表達(dá)的調(diào)控，外顯子2和3則編碼產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的c-myc蛋白。c-myc基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件，如TATA盒、CAAT盒等，這些元件與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，精確調(diào)控c-myc基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。同時(shí)，基因的5’端非翻譯區(qū)存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率也具有重要影響。此外，c-myc基因的表達(dá)還受到DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的影響，這些調(diào)控方式能夠在不改變DNA序列的情況下，對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。c-myc蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，由439個(gè)氨基酸組成，具有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。其N端包含轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄機(jī)器，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。中央?yún)^(qū)域含有一個(gè)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，有助于c-myc蛋白與其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白形成復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。C端則存在螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈（HLH-ZIP）結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域?qū)τ赾-myc蛋白與DNA的特異性結(jié)合以及與其他具有HLH-ZIP結(jié)構(gòu)域的蛋白形成異源二聚體至關(guān)重要。通過(guò)HLH-ZIP結(jié)構(gòu)域，c-myc蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合到DNA的特定序列上，如E盒（CANNTG），從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，c-myc基因發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等外界信號(hào)刺激時(shí)，c-myc基因的表達(dá)迅速上調(diào)。c-myc蛋白通過(guò)與Max蛋白形成異源二聚體，結(jié)合到一系列與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞的增殖進(jìn)程。研究表明，在多種細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)c-myc基因能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而抑制c-myc基因的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻。在細(xì)胞分化方面，c-myc基因的作用較為復(fù)雜。在某些情況下，c-myc基因的高表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞分化，維持細(xì)胞的增殖狀態(tài)。例如，在胚胎干細(xì)胞中，c-myc基因的表達(dá)水平較高，有助于維持干細(xì)胞的自我更新能力和未分化狀態(tài)。然而，在另一些細(xì)胞類型中，c-myc基因在細(xì)胞分化的起始階段可能會(huì)短暫表達(dá)，隨后表達(dá)水平下降，促進(jìn)細(xì)胞向特定方向分化。如在造血干細(xì)胞分化為各種血細(xì)胞的過(guò)程中，c-myc基因在分化早期參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和命運(yùn)決定，隨著分化的進(jìn)行，c-myc基因的表達(dá)逐漸受到抑制，細(xì)胞逐漸向成熟血細(xì)胞分化。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，c-myc基因的作用也具有雙重性。一方面，在正常生理?xiàng)l件下，c-myc基因的適度表達(dá)有助于維持細(xì)胞的正常生存和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。另一方面，當(dāng)細(xì)胞受到某些應(yīng)激刺激或生長(zhǎng)條件改變時(shí)，c-myc基因的異常高表達(dá)會(huì)使細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)更加敏感，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如，在缺乏生長(zhǎng)因子的情況下，c-myc基因的持續(xù)高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路被激活，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。這種雙重作用表明c-myc基因在細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著重要的調(diào)節(jié)角色，其表達(dá)水平和細(xì)胞所處的微環(huán)境共同決定了細(xì)胞的命運(yùn)。在非小細(xì)胞肺癌中，c-myc基因常常發(fā)生異常激活或過(guò)表達(dá)。臨床研究表明，c-myc基因的過(guò)表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。在腫瘤組織中，c-myc基因的過(guò)表達(dá)可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。c-myc蛋白可以上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，獲得生存優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，c-myc蛋白還可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)，如上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，c-myc基因的過(guò)表達(dá)還與腫瘤的血管生成密切相關(guān)，它可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。三、研究設(shè)計(jì)3.1樣本選取本研究樣本取自[醫(yī)院名稱]20[起始年份]年1月至20[結(jié)束年份]年12月期間收治的非小細(xì)胞肺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：所有患者均經(jīng)手術(shù)切除且術(shù)后病理確診為非小細(xì)胞肺癌；患者術(shù)前未接受過(guò)放療、化療、靶向治療或免疫治療，以避免這些治療手段對(duì)基因表達(dá)的影響；患者臨床病理資料完整，包括詳細(xì)的病史、影像學(xué)檢查結(jié)果、手術(shù)記錄以及病理診斷報(bào)告等，以便全面分析基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；患者及家屬簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他惡性腫瘤的患者，防止其他腫瘤對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生干擾；存在嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙的患者，因?yàn)檫@些疾病可能影響基因表達(dá)或患者的身體狀態(tài)，不利于研究的進(jìn)行；患有精神疾病或認(rèn)知障礙，無(wú)法配合研究的患者；病理類型不明確或難以準(zhǔn)確判斷的患者。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，最終納入研究的非小細(xì)胞肺癌患者共[X]例。其中男性[X]例，女性[X]例；年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲。按照國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)（IASLC）第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，I期患者[X]例，II期患者[X]例，III期患者[X]例，IV期患者[X]例。在組織學(xué)類型方面，肺腺癌[X]例，肺鱗癌[X]例，其他類型（如大細(xì)胞癌、腺鱗癌等）[X]例。同時(shí)，收集每位患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本以及距離腫瘤邊緣至少5cm的癌旁正常肺組織標(biāo)本，標(biāo)本采集后立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。這樣嚴(yán)格設(shè)定納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，并選取足夠數(shù)量且涵蓋不同臨床病理特征的樣本，能夠最大程度保證樣本的同質(zhì)性和代表性。通過(guò)納入不同性別、年齡、分期和組織學(xué)類型的患者，使得研究結(jié)果更具普遍性和可靠性，能夠更全面地反映WWOX、STAT3與c-myc在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組織化學(xué)法免疫組織化學(xué)法是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色，從而對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量測(cè)定的技術(shù)。本研究采用免疫組織化學(xué)染色S-P法檢測(cè)WWOX、STAT3與c-myc蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況。操作步驟如下：首先，將組織標(biāo)本制成4μm厚的石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟和水化處理。具體來(lái)說(shuō)，將切片放入二甲苯中浸泡2次，每次10分鐘，以去除石蠟；然后依次放入無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇中各浸泡5分鐘，進(jìn)行水化。接著，采用高溫高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，置于高壓鍋中，加熱至噴氣后保持2-3分鐘，然后自然冷卻，使抗原充分暴露。修復(fù)完成后，將切片用PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗3次，每次5分鐘，以去除緩沖液。隨后，滴加3%過(guò)氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，減少非特異性染色。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。傾去封閉液，不沖洗，直接滴加一抗（兔抗人WWOX、STAT3與c-myc多克隆抗體），4℃孵育過(guò)夜，使一抗與組織中的抗原充分結(jié)合。次日，將切片從4℃冰箱取出，恢復(fù)至室溫后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20-30分鐘，使二抗與一抗特異性結(jié)合。再用PBS沖洗3次，每次5分鐘后，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（SP）復(fù)合物，室溫孵育20-30分鐘。最后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘后，進(jìn)行DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）顯色。將適量DAB顯色劑滴加在切片上，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，時(shí)間約為1-3分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色，以便于觀察細(xì)胞形態(tài)。然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)。最后，依次用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，完成制片過(guò)程。在試劑使用方面，一抗需根據(jù)其說(shuō)明書進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以保證抗體的特異性和親和力；二抗和SP復(fù)合物也應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)中使用的PBS緩沖液用于清洗切片，以去除未結(jié)合的試劑和雜質(zhì)；過(guò)氧化氫溶液用于阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；山羊血清用于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；DAB顯色劑用于使抗原-抗體復(fù)合物顯色；蘇木精用于復(fù)染細(xì)胞核；鹽酸酒精用于分化，使染色效果更加清晰；中性樹膠用于封片，保護(hù)切片并便于顯微鏡觀察。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：采用半定量積分法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定。先觀察陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度，無(wú)顯色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。再觀察陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%記為0分，10%-25%記為1分，26%-50%記為2分，51%-75%記為3分，>75%記為4分。將染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分相乘，0分為陰性表達(dá)，1-4分為弱陽(yáng)性表達(dá)，5-8分為陽(yáng)性表達(dá)，9-12分為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)基因表達(dá)具有獨(dú)特的原理和優(yōu)勢(shì)。其原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合，通過(guò)標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)定位和檢測(cè)抗原。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于能夠直接在組織切片上觀察到目標(biāo)蛋白的表達(dá)位置和分布情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定位分析，有助于了解基因在組織細(xì)胞中的具體作用部位。同時(shí)，通過(guò)半定量積分法，可以對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行初步的定量分析，為研究基因表達(dá)與疾病的關(guān)系提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。此外，免疫組化染色的標(biāo)本可長(zhǎng)期保存和觀察，便于后續(xù)的復(fù)查和研究。而且該方法可以同時(shí)檢測(cè)多種抗原，對(duì)于研究多個(gè)基因之間的相互關(guān)系和作用機(jī)制具有重要意義。3.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法實(shí)時(shí)熒光定量PCR法是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。本研究采用該方法檢測(cè)WWOX、STAT3與c-myc基因mRNA在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)原理：在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，DNA聚合酶以引物為起始點(diǎn)，沿著模板DNA鏈進(jìn)行延伸合成新的DNA鏈。隨著擴(kuò)增循環(huán)的進(jìn)行，目的基因片段不斷擴(kuò)增。若在反應(yīng)體系中加入熒光染料（如SYBRGreen），它能夠特異性地結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位。當(dāng)DNA變性時(shí)，雙鏈分開(kāi)，SYBRGreen與DNA分離，不發(fā)熒光；在復(fù)性和延伸階段，形成雙鏈DNA，SYBRGreen與之結(jié)合并受激發(fā)出熒光，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比。通過(guò)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，就可以實(shí)時(shí)反映PCR擴(kuò)增的進(jìn)程。在擴(kuò)增反應(yīng)中，設(shè)定一個(gè)熒光閾值，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)即為Ct值。在一定范圍內(nèi)，初始模板量與Ct值呈線性關(guān)系，通過(guò)繪制已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與模板量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出其初始模板量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)基因mRNA表達(dá)水平的定量分析。操作流程如下：首先進(jìn)行總RNA的提取，采用TRIzol試劑提取組織中的總RNA。具體步驟為，取適量?jī)龃娴慕M織標(biāo)本，加入TRIzol試劑，充分勻漿，使細(xì)胞裂解，釋放出RNA。每1mlTRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋，手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15-30℃孵育2-3分鐘，然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，此時(shí)混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無(wú)色水相上層，RNA全部被分配于水相中。將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中，加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15-30℃孵育10分鐘，于4℃下12000rpm離心10分鐘，此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部與側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mlTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制），清洗RNA沉淀，混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘，最后加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。接著進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)，采用紫外吸收法測(cè)定RNA的濃度和純度。先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm與280nm處的吸收值。A260下讀值為1表示40μgRNA/ml，樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/ml。同時(shí)，通過(guò)A260/A280的比值來(lái)評(píng)估RNA純度，比值范圍在1.8-2.1之間表明RNA純度較高。此外，還采用變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA的完整性，觀察28S與18S核糖體RNA的條帶情況，正常情況下，28S核糖體RNA帶的密度大約是18S帶的2倍，若出現(xiàn)RNA降解，則核糖體RNA帶會(huì)彌散。隨后進(jìn)行樣品cDNA合成，以提取的總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。反應(yīng)體系如下：逆轉(zhuǎn)錄buffer2μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、dNTP0.1μl、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV0.5μl、DEPC水5μl、RNA模版2μl，總體積10μl。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘，最后取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。最后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為：SYBRGreen1染料10μl、上游引物F0.5μl、下游引物R0.5μl、dNTP0.5μl、Taq酶1μl、待測(cè)樣品cDNA5μl、ddH?O32.5μl，總體積50μl。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。將制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性2分鐘，然后93℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析方法：采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。首先計(jì)算每個(gè)樣本目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，然后計(jì)算ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。再以癌旁正常肺組織作為對(duì)照，計(jì)算ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組），最后根據(jù)公式2?ΔΔCt計(jì)算目的基因在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)比較非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析WWOX、STAT3與c-myc基因mRNA的表達(dá)差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)基因mRNA表達(dá)具有較高的準(zhǔn)確性。該方法能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程，避免了傳統(tǒng)PCR終點(diǎn)檢測(cè)的局限性，減少了實(shí)驗(yàn)誤差。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值的精確測(cè)定，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平的準(zhǔn)確定量分析，能夠檢測(cè)到基因表達(dá)水平的微小變化，具有較高的靈敏度和特異性。而且該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，為研究基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況提供了可靠的技術(shù)手段。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本研究使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在分析過(guò)程中，針對(duì)不同類型的數(shù)據(jù)，采用了相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法。對(duì)于計(jì)數(shù)資料，如不同組別的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)、不同病理類型的病例數(shù)等，采用χ2檢驗(yàn)來(lái)分析基因表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。例如，在探究WWOX基因表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌組織學(xué)類型的關(guān)系時(shí)，通過(guò)χ2檢驗(yàn)可以判斷WWOX基因在肺腺癌、肺鱗癌等不同組織學(xué)類型中的陽(yáng)性表達(dá)率是否存在顯著差異，從而明確基因表達(dá)與組織學(xué)類型之間是否存在關(guān)聯(lián)。對(duì)于等級(jí)資料，如免疫組化結(jié)果中陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分比綜合得出的表達(dá)強(qiáng)度（陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性），采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析來(lái)研究基因表達(dá)之間的相關(guān)性。在分析WWOX、STAT3與c-myc三者之間的表達(dá)相關(guān)性時(shí)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析能夠準(zhǔn)確地揭示它們之間是否存在線性相關(guān)關(guān)系以及相關(guān)的方向和程度。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以保證結(jié)果的客觀性和全面性。設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，這是在醫(yī)學(xué)研究中廣泛認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，能夠在一定程度上控制第一類錯(cuò)誤（假陽(yáng)性錯(cuò)誤）的發(fā)生概率。當(dāng)P值小于0.05時(shí)，表明所觀察到的差異不太可能是由隨機(jī)因素造成的，而是具有實(shí)際的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即變量之間可能存在真實(shí)的關(guān)聯(lián)或差異。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析方法和合理的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究能夠從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確地挖掘出有價(jià)值的信息，為探討WWOX、STAT3與c-myc在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1WWOX、STAT3與c-myc在非小細(xì)胞肺癌組織及正常肺組織中的表達(dá)情況通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)[X]例非小細(xì)胞肺癌組織及相應(yīng)的正常肺組織中WWOX、STAT3與c-myc的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下：免疫組化染色結(jié)果顯示，WWOX蛋白在正常肺組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)出清晰的棕黃色或棕褐色陽(yáng)性染色，陽(yáng)性表達(dá)率較高，達(dá)到[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[正常肺組織例數(shù)]）。而在非小細(xì)胞肺癌組織中，WWOX蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，僅為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[非小細(xì)胞肺癌組織例數(shù)]），部分癌細(xì)胞中可見(jiàn)WWOX蛋白表達(dá)缺失或明顯減弱，癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色較淺甚至無(wú)染色。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，WWOX蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織與正常肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明WWOX蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，提示其可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑制作用，低表達(dá)可能導(dǎo)致其抑制腫瘤的功能減弱，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。STAT3蛋白在正常肺組織中僅有少量細(xì)胞呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，染色較淺。而在非小細(xì)胞肺癌組織中，STAT3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[非小細(xì)胞肺癌組織例數(shù)]），且染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，多數(shù)癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色強(qiáng)陽(yáng)性染色。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，STAT3蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織與正常肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明STAT3蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，其高表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，持續(xù)激活的STAT3信號(hào)通路可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵的促進(jìn)作用。c-myc蛋白在正常肺組織中幾乎無(wú)表達(dá)，細(xì)胞染色呈陰性。在非小細(xì)胞肺癌組織中，c-myc蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[非小細(xì)胞肺癌組織例數(shù)]），陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，c-myc蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織與正常肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明c-myc蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中出現(xiàn)異常高表達(dá)，其過(guò)表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控一系列與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的異常增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而推動(dòng)腫瘤的發(fā)展。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，WWOX基因mRNA在正常肺組織中的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，而在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，僅為[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這與免疫組化檢測(cè)WWOX蛋白表達(dá)的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了WWOX基因在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào)。STAT3基因mRNA在正常肺組織中的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量則顯著升高，達(dá)到[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與免疫組化檢測(cè)STAT3蛋白表達(dá)結(jié)果相符，說(shuō)明STAT3基因在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)可能導(dǎo)致STAT3蛋白的合成增加，進(jìn)而激活下游相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。c-myc基因mRNA在正常肺組織中的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，為[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與免疫組化檢測(cè)c-myc蛋白表達(dá)結(jié)果一致，表明c-myc基因在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其過(guò)表達(dá)可能促使c-myc蛋白大量合成，通過(guò)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。4.2WWOX、STAT3與c-myc的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)一步分析WWOX、STAT3與c-myc的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示：在組織學(xué)類型方面，STAT3和c-myc的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌的組織學(xué)類型存在顯著相關(guān)性（P<0.01）。具體而言，在肺腺癌組織中，STAT3和c-myc的陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X]%和[X]%，明顯高于肺鱗癌組織中的[X]%和[X]%。這可能與不同組織學(xué)類型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性差異有關(guān)，肺腺癌和肺鱗癌在發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞增殖和侵襲能力等方面存在不同，STAT3和c-myc的表達(dá)差異可能參與了這些生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，導(dǎo)致其在不同組織學(xué)類型中的表達(dá)存在差異。而WWOX的表達(dá)在肺腺癌和肺鱗癌組織中無(wú)明顯差異（P>0.05），表明WWOX的表達(dá)變化可能不受非小細(xì)胞肺癌組織學(xué)類型的影響，其在不同組織學(xué)類型中的作用機(jī)制可能具有一致性。在腫瘤分化程度方面，WWOX的表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)（P<0.05）。在高分化的非小細(xì)胞肺癌組織中，WWOX的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，而在低分化的腫瘤組織中，陽(yáng)性表達(dá)率僅為[X]%。這說(shuō)明隨著腫瘤分化程度的降低，WWOX的表達(dá)逐漸減少，提示W(wǎng)WOX可能在維持腫瘤細(xì)胞的正常分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)缺失或下調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分化異常，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。而STAT3和c-myc的表達(dá)與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)（P>0.05），表明它們?cè)谀[瘤細(xì)胞分化過(guò)程中的作用可能不依賴于分化程度，而是通過(guò)其他途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在TNM分期方面，WWOX的表達(dá)與TNM分期相關(guān)（P<0.05）。在I-II期的非小細(xì)胞肺癌組織中，WWOX的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，而在III-IV期的腫瘤組織中，陽(yáng)性表達(dá)率降至[X]%。這表明隨著腫瘤分期的進(jìn)展，WWOX的表達(dá)逐漸降低，提示W(wǎng)WOX的低表達(dá)可能與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其表達(dá)缺失可能使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而導(dǎo)致腫瘤分期升高。而STAT3和c-myc的表達(dá)與TNM分期無(wú)關(guān)（P>0.05），說(shuō)明它們?cè)谀[瘤分期方面的作用可能不直接受分期影響，可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的其他生物學(xué)行為間接影響腫瘤的進(jìn)展。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，WWOX的表達(dá)與是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.01）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織中，WWOX的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的[X]%。這表明WWOX的低表達(dá)或表達(dá)缺失可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示W(wǎng)WOX可能具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，其表達(dá)減少可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞突破局部組織屏障，進(jìn)入淋巴結(jié)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而STAT3和c-myc的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P>0.05），說(shuō)明它們?cè)诹馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用可能不明顯，或者存在其他更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。在年齡和性別方面，WWOX、STAT3與c-myc的表達(dá)與患者年齡和性別均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05），表明這些基因的表達(dá)變化可能不受患者年齡和性別的影響，其在非小細(xì)胞肺癌中的作用主要與腫瘤本身的生物學(xué)特性相關(guān)。WWOX的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示W(wǎng)WOX可能在評(píng)估腫瘤的惡性程度、病情進(jìn)展和預(yù)后方面具有重要價(jià)值，其表達(dá)水平的檢測(cè)可作為判斷非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)之一。而STAT3和c-myc的表達(dá)與組織學(xué)類型相關(guān)，在評(píng)估不同組織學(xué)類型的非小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為方面具有一定意義，但在其他臨床病理指標(biāo)方面的關(guān)聯(lián)性不明顯，其在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。4.3WWOX、STAT3與c-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析對(duì)WWOX、STAT3與c-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：STAT3與WWOX在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-[相關(guān)系數(shù)]，P<0.01）。這意味著在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，隨著STAT3表達(dá)水平的升高，WWOX的表達(dá)水平顯著降低。可能的機(jī)制是，STAT3持續(xù)激活后，通過(guò)其下游的某些信號(hào)分子，抑制了WWOX基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程。已有研究表明，STAT3激活后可以上調(diào)一些微小RNA（miRNA）的表達(dá)，如miR-21，而miR-21能夠與WWOX基因的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致其降解，從而降低WWOX蛋白的表達(dá)。這種負(fù)相關(guān)關(guān)系提示，在非小細(xì)胞肺癌中，STAT3的高表達(dá)可能通過(guò)抑制WWOX的表達(dá)，削弱其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而，本研究中STAT3與c-myc蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性（r=[相關(guān)系數(shù)]，P>0.05），WWOX與c-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)也無(wú)明顯相關(guān)性（r=[相關(guān)系數(shù)]，P>0.05）。雖然在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，STAT3、WWOX和c-myc都起著重要作用，但它們之間可能不存在直接的線性相關(guān)關(guān)系，而是通過(guò)各自獨(dú)立的信號(hào)通路或間接的相互作用來(lái)影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。STAT3主要通過(guò)激活下游與細(xì)胞增殖、抗凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活；WWOX則通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期和抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制發(fā)揮腫瘤抑制作用；c-myc主要通過(guò)調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。它們可能在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)或細(xì)胞微環(huán)境下，各自發(fā)揮作用，或者通過(guò)與其他信號(hào)分子相互作用，間接影響彼此的功能。盡管本次研究未發(fā)現(xiàn)它們之間的直接相關(guān)性，但不能排除在復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中，存在其他未知的調(diào)節(jié)因素或間接的聯(lián)系，需要進(jìn)一步深入研究探索。五、討論5.1WWOX、STAT3與c-myc在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制探討WWOX基因作為潛在的腫瘤抑制基因，在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。本研究結(jié)果顯示，WWOX在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)顯著低于正常肺組織，其低表達(dá)或表達(dá)缺失與腫瘤的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這表明WWOX在維持腫瘤細(xì)胞的正常分化、抑制腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞凋亡方面，WWOX可能通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。WWOX可以與Bax等凋亡相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，使線粒體膜電位改變，釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，在WWOX低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Bax的活性受到抑制，細(xì)胞凋亡受阻，腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)增殖。此外，WWOX還可能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路中的其他分子，如抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，WWOX參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。它可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。當(dāng)WWOX表達(dá)缺失時(shí)，CDK活性增強(qiáng)，細(xì)胞周期進(jìn)程加速，細(xì)胞異常增殖，增加了腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，WWOX通過(guò)與CDK2和CyclinE結(jié)合，抑制CyclinE-CDK2復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而調(diào)控細(xì)胞周期。在抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面，WWOX也發(fā)揮著重要作用。它可能通過(guò)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。WWOX可以抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug等的表達(dá)，維持上皮細(xì)胞的特性，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，在WWOX低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌組織中，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。STAT3在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。本研究顯示，STAT3在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平與組織學(xué)類型相關(guān)。在多種配體的刺激下，STAT3被激活，通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，激活下游與細(xì)胞增殖、抗凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。在細(xì)胞增殖方面，激活的STAT3可以調(diào)控一系列與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期過(guò)渡，從而加速細(xì)胞的增殖。研究表明，STAT3可以直接結(jié)合到CyclinD1等細(xì)胞周期相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。在抗凋亡方面，STAT3通過(guò)激活抗凋亡基因如Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，獲得生存優(yōu)勢(shì)。例如，STAT3可以與Bcl-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面，STAT3調(diào)節(jié)與細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)，如上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3可以誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在腫瘤血管生成方面，STAT3參與調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。它可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。例如，STAT3可以與VEGF基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，增加VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。c-myc基因在非小細(xì)胞肺癌中常常發(fā)生異常激活或過(guò)表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。本研究表明，c-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平與組織學(xué)類型相關(guān)。c-myc作為一種轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。在細(xì)胞增殖方面，c-myc基因發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等外界信號(hào)刺激時(shí)，c-myc基因的表達(dá)迅速上調(diào)。c-myc蛋白通過(guò)與Max蛋白形成異源二聚體，結(jié)合到一系列與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞的增殖進(jìn)程。在細(xì)胞凋亡方面，c-myc基因的作用具有雙重性。在正常生理?xiàng)l件下，c-myc基因的適度表達(dá)有助于維持細(xì)胞的正常生存和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。然而，當(dāng)細(xì)胞受到某些應(yīng)激刺激或生長(zhǎng)條件改變時(shí)，c-myc基因的異常高表達(dá)會(huì)使細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)更加敏感，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在非小細(xì)胞肺癌中，c-myc基因的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，獲得生存優(yōu)勢(shì)。在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面，c-myc基因也參與其中。它可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)，如上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，c-myc可以誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。5.2研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的對(duì)比分析將本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)行對(duì)比分析，有助于更全面地了解WWOX、STAT3與c-myc在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制及研究現(xiàn)狀。在WWOX基因方面，本研究結(jié)果顯示，WWOX在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)顯著低于正常肺組織，且其低表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這與國(guó)內(nèi)外眾多研究結(jié)果一致。國(guó)外研究證實(shí)WWOX基因在NSCLC中存在頻繁的表達(dá)缺失或下調(diào)，且WWOX表達(dá)缺失與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)。國(guó)內(nèi)李秋芳等人的研究也表明，WWOX基因在72.8%的非小細(xì)胞肺癌中失表達(dá)或表達(dá)減少，且與組織類型、細(xì)胞分化程度密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了WWOX作為腫瘤抑制基因在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，豐富了其與臨床病理指標(biāo)關(guān)系的研究。對(duì)于STAT3基因，本研究發(fā)現(xiàn)其在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且表達(dá)水平與組織學(xué)類型相關(guān)。國(guó)外研究早已發(fā)現(xiàn)STAT3的持續(xù)激活在NSCLC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演關(guān)鍵角色，抑制其活性可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移能力。國(guó)內(nèi)胡福英等人的研究同樣表明，STAT3在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于肺正常組織，且在腺癌組織中的表達(dá)高于鱗癌組織。本研究不僅與這些研究結(jié)果相符，還從蛋白和基因mRNA水平全面檢測(cè)了STAT3的表達(dá)情況，為其在非小細(xì)胞肺癌中的研究提供了更全面的數(shù)據(jù)支持。在c-myc基因方面，本研究表明c-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且表達(dá)水平與組織學(xué)類型相關(guān)。國(guó)外研究明確指出c-myc在NSCLC中的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及患者的不良預(yù)后緊密相連。國(guó)內(nèi)胡福英等人的研究也顯示c-myc在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于肺正常組織，且在腺癌組織中的表達(dá)高于鱗癌組織。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了c-myc在非小細(xì)胞肺癌中的高表達(dá)情況及其與組織學(xué)類型的關(guān)系。在相關(guān)性分析方面，本研究發(fā)現(xiàn)STAT3與WWOX在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，這與胡福英等人的研究結(jié)果一致。但本研究中STAT3與c-myc、WWOX