1、主講學(xué)生: 許文強(qiáng)蘭州大學(xué) 神經(jīng)科學(xué)研究所Neuroscience Research Institute, LanzhouUniversityEmail: 雙皮質(zhì)素DCX一、DCX（doublecortin，雙皮質(zhì)素）是一種微管相關(guān)蛋白，在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中廣泛地表達(dá)，而且是神經(jīng)元遷移和分化所必需的，其抗體可用來(lái)特異性標(biāo)記新生神經(jīng)元的胞質(zhì)和突起。dcx: 雙皮質(zhì)素; X 連鎖(雙皮質(zhì)素) doublecortex; lissencephaly, X-linked (doublecortin)分布: 細(xì)胞骨架|微管關(guān)聯(lián)復(fù)合體(microtubule associated complex)

2、活性: 微管結(jié)合 參與: 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)|中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育|細(xì)胞分化 病變: 無(wú)腦回畸形(平滑腦), X 連鎖|皮層下層狀發(fā)育異常,Xq22.3-q23（X染色體長(zhǎng)臂上2區(qū)2帶3亞帶到3帶）摘自人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃 微管相關(guān)蛋白（microtubule associated proteins MAPs）分子至少包含一個(gè)結(jié)合微管的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)向外突出的結(jié)構(gòu)域。突出部位伸到微管外與其它細(xì)胞組分（如微管束、中間纖維、質(zhì)膜）結(jié)合。MAP的主要功能是：促進(jìn)微管聚集成束；增加微管穩(wěn)定性或強(qiáng)度； 促進(jìn)微管組裝。 神經(jīng)元的遷移（輻射遷移） 哺乳動(dòng)物的腦在發(fā)育過(guò)程中發(fā)生顯著的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，通過(guò)有絲分

3、裂，神經(jīng)元前體細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元，新生神經(jīng)元接受外部刺激信號(hào)，通過(guò)胞內(nèi)分子的信號(hào)傳遞，最終將信號(hào)匯集于細(xì)胞骨架上，通過(guò)細(xì)胞骨架網(wǎng)格成分如微管蛋白和動(dòng)力蛋白絲的動(dòng)力學(xué)重組來(lái)完成微絲和微管的動(dòng)態(tài)變化，引起細(xì)胞有利于遷移的形態(tài)轉(zhuǎn)變，最終沿著特定的路徑遷移很長(zhǎng)的距離，到達(dá)它們的終點(diǎn)位置。 大腦皮質(zhì)從內(nèi)向外的發(fā)育：較早分化的較大神經(jīng)元先遷移并形成最內(nèi)層，依次順序向外；而較晚分化的較小神經(jīng)元?jiǎng)t通過(guò)已形成的層次遷移并形成其外側(cè)新的層次；故不論皮質(zhì)的什么區(qū)域，其最內(nèi)層總是最早分化，而最外層則最后分化。2. 神經(jīng)元分化 新生神經(jīng)元的遷移越過(guò)了外層已形成的層次，到達(dá)特定位置后，神經(jīng)元特化出軸突和樹(shù)突，神經(jīng)元胞體兩端生

4、長(zhǎng)出樹(shù)突及軸突，軸突定向生長(zhǎng)延伸至靶細(xì)胞部位，末端與靶細(xì)胞形成突觸連接，樹(shù)突發(fā)生分支，最終，新生神經(jīng)元從形態(tài)及功能上發(fā)育分化成熟,并形成外側(cè)新的層次。3. 神經(jīng)元遷移的細(xì)胞機(jī)制 神經(jīng)元遷移：微管軌道，微管相關(guān)蛋白促進(jìn)重建和穩(wěn)定，動(dòng)力蛋白復(fù)合體卡車，細(xì)胞核沿著微管向前運(yùn)動(dòng)。 盡管神經(jīng)元遷移有不同的方式和路徑，然而所有遷移神經(jīng)元的都要經(jīng)歷三個(gè)基本的細(xì)胞學(xué)事件。遷移神經(jīng)元經(jīng)歷的三個(gè)基本的細(xì)胞學(xué)事件 2）DCX蛋白結(jié)合到微管上并刺激微管蛋白聚合發(fā)生。 dcx基因編碼的微管相關(guān)蛋白雙皮質(zhì)素，它的表達(dá)主要發(fā)生在皮質(zhì)發(fā)育期處于有絲分裂期后的神經(jīng)元中（新生神經(jīng)元），及遷移的神經(jīng)元和軸突結(jié)構(gòu)中。3）DCX基因中

5、的錯(cuò)義突變會(huì)影響相關(guān)蛋白與微管的正確結(jié)合，故對(duì)于神經(jīng)元遷移和軸突伸長(zhǎng)非常重要。 DCX基因突變會(huì)導(dǎo)致X相關(guān)聯(lián)的無(wú)腦回畸形（癥狀：皮層光滑，厚實(shí)，精神緩慢遲鈍，痙攣，壽命短等）。三、DCX與成體神經(jīng)發(fā)生在哺乳動(dòng)物成體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，有2個(gè)區(qū)域已被證明存在神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖： 1）側(cè)腦室的亞室?guī)?SVZ) 2）齒狀回顆粒細(xì)胞層下區(qū)(SGZ) 在這兩個(gè)區(qū)域新生的神經(jīng)元都要經(jīng)過(guò)遷移到達(dá)特定位置，然后分化為成熟神經(jīng)元，并與周圍神經(jīng)組織功能性的整合。以前，對(duì)于成體神經(jīng)發(fā)生的研究主要靠一些標(biāo)記增殖細(xì)胞的技術(shù)來(lái)完成，如有絲分裂的標(biāo)記物Ki-67 或PCNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，和核苷酸類似物的應(yīng)用，像溴脫氧尿

6、苷（BrdU）。在這些技術(shù)中，系統(tǒng)的BrdU處理是神經(jīng)發(fā)生中應(yīng)用的最廣泛的，然而這個(gè)技術(shù)存在著一些缺陷：1）隨著細(xì)胞的連續(xù)分裂，BrdU的濃度被稀釋，標(biāo)記就會(huì)效果下降；2）高劑量的BrdU會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生毒性，過(guò)低劑量的BrdU又會(huì)導(dǎo)致不完全標(biāo)記；3）反轉(zhuǎn)錄病毒和BrdU標(biāo)記技術(shù)都要求在活體內(nèi)對(duì)增殖細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，而不能體外標(biāo)記。5）DCX表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量可以表示齒狀回中細(xì)胞增殖水平，而且，在外界因子的刺激下，仍可以通過(guò)DCX表達(dá)細(xì)胞的增加或減少來(lái)體現(xiàn)細(xì)胞增殖水平；6）它不需要預(yù)先對(duì)活體內(nèi)的增殖細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，可以直接在體外對(duì)DCX抗原進(jìn)行定位、定量標(biāo)記；7）DCX可被用于分析特定區(qū)域、以及在正常和病理

7、條件下的神經(jīng)發(fā)生的水平。在成體動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)生中，DCX的表達(dá)始于成神經(jīng)細(xì)胞的產(chǎn)生，在第二周達(dá)到最大，并隨著神經(jīng)元的成熟其表達(dá)被抑制。五、DCX免疫組化染色1. 剝瓊脂 體式顯微鏡下，左手執(zhí)手術(shù)刀，右手執(zhí)小畫(huà)筆，剝時(shí)盡量使海馬完整，通常情況下，留下部分海馬外圍的腦皮質(zhì)及腦干部分。但片子不能太大以免相互重疊而影響后面的抗體結(jié)合。2. 3%H2O2 封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，30-50min，用30%的H2O2 和0.1MPB配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，注意30%原液不可在高溫、強(qiáng)光環(huán)境下長(zhǎng)久暴露，以免發(fā)生分解反應(yīng)。用完后盡快放回-20冰箱保持。一般情況下每孔500微升。3. PB 610min，將H2O2吸去，加

8、0.1MPB洗6個(gè)10分鐘。4. 加入1AK：goat-anti-DCX，通常情況下，用1AK原液（原液是純凈物比例為1）加1AK稀釋液配制，比例為1:1000。一般情況下每孔500微升。4搖床過(guò)夜（12小時(shí)），注意加封口膜，以防抗體揮發(fā)。5. 回收1AK：goat-anti-DCX后，用PB洗330min6. 加入2AK：Rabbit-anti-goat-biotin 通常情況下，用2AK原液（原液是純凈物比例為1）加2AK稀釋液配制，比例為1:200400，濃度大于1AK液。一般情況下每孔500微升。4搖床過(guò)夜（12小時(shí)）或者室溫?fù)u床4小時(shí)，注意加封口膜，以防抗體揮發(fā)。7. 回收2AK：用PB洗330min 8. Streptavidin（連霉親和素）孵育， 室溫?fù)u床1h至1.5h 原液為純液，一般配制比例1:200500，每孔500微升。9. PB 330min 25min10. 室溫下DAB孵育10min 現(xiàn)用現(xiàn)配，用0.1MPB配制：比例為100l（DAB）：7ml （0.1MPB）= V ：n ml，（若每孔加1ml配制好的DAB，則n表示n個(gè)孔）。注意，DA