I文獻(xiàn)綜述1.1菊芋醬菜的概述及研究意義1.1.1菊芋的概述菊芋（HelianthustuberosusL.）是一種菊科植物，也稱(chēng)為五星草，發(fā)源于北美洲，20世紀(jì)初成為歐洲一種普遍的農(nóng)作物[[]陳銘達(dá),劉兆普.菊芋的加工及開(kāi)發(fā)利用[J].中國(guó)林副特產(chǎn),2004(04):35-36.]。目前，菊芋在我國(guó)多地皆有種植菊芋高度可達(dá)2米左右，有分枝，葉子形狀為橢圓形，花瓣為淺黃色。菊芋一般在初秋開(kāi)花，花形似菊，具有一定的觀賞價(jià)值。其地下根部塊莖可食用，大小不均，性狀近似于生姜，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同于生姜有太多的纖維結(jié)構(gòu)。菊芋的塊莖富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[[]JudprasongK,ArcheepsudcharitN,ChantapiriyapoonK,etal.NutrientsandnaturaltoxicsubstancesincommonlyconsumedJerusalemartichoke(HelianthustuberosusL.)tuber[J].FoodChemistry,2016,238:173.]，有部分企業(yè)利用菊芋制成菊粉飲品、菊芋酒等，對(duì)人體具有活血化瘀的功效[[]菊芋的功效及做法[J].北方園藝,2016(22):74.]。菊芋對(duì)生存條件要求不高[[]陳銘達(dá),劉兆普.菊芋的加工及開(kāi)發(fā)利用[J].中國(guó)林副特產(chǎn),2004(04):35-36.[]JudprasongK,ArcheepsudcharitN,ChantapiriyapoonK,etal.NutrientsandnaturaltoxicsubstancesincommonlyconsumedJerusalemartichoke(HelianthustuberosusL.)tuber[J].FoodChemistry,2016,238:173.[]菊芋的功效及做法[J].北方園藝,2016(22):74.[]劉燕,陳小銀,楊麗麗,謝瑞,何楠,張繼.響應(yīng)面優(yōu)化菊芋菊糖的提取工藝研究[J].植物研究,2016,36(04):627-633.[]邱鵬程,杜永春,余奕東,宋滿(mǎn)剛,孔國(guó)東,倪苗.菊芋耐鹽堿及耐旱研究進(jìn)展[J].北方園藝,2018(12):168-171.菊芋最主要的食用價(jià)值在醬菜方面得到了極大的發(fā)揮。以菊芋的塊莖制成的泡菜、醬菜口感脆爽鮮香，深受人們的喜愛(ài)。并且菊芋產(chǎn)量大，貯存簡(jiǎn)便，從制作醬菜的層次上來(lái)講，菊芋的發(fā)展空間有待拓展。本次課題使用的原材料來(lái)源于江蘇鹽城自產(chǎn)的菊芋，該品種的菊芋富含菊糖[[][]Reddy,B.Effectofdietaryoligofructoseandinulinoncolonicpreneoplasticaberrantcryptfociinhibition[J].Carcinogenesis,1997,18(7):1371-13醬菜的概述及發(fā)展醬菜是以各類(lèi)新鮮蔬菜為原料，經(jīng)食鹽腌制，浸泡，在密封條件下由乳酸菌和酵母菌發(fā)酵，最后加以不同醬類(lèi)[[]李里特，李風(fēng)娟，王卉，等．傳統(tǒng)發(fā)酵食品的機(jī)遇和創(chuàng)新[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版），2009（8）：61．]所形成的風(fēng)味菜系[[]HansenE.B.Commercialbacterialstarterculturesforfermentedfoodsofthefuture[J].IntJFoodMicrobiol,2002(78):119-131.]。醬菜作為我國(guó)傳統(tǒng)腌制菜系，有著十分悠久的歷史，早在漢朝時(shí)期人們就通過(guò)用食鹽腌制蔬菜的方法來(lái)保存食物，經(jīng)過(guò)千百年的演變，醬菜文化逐漸發(fā)展壯大，在盛唐時(shí)期，醬菜腌制工藝隨遣唐使傳入日本，后又傳入韓國(guó)，直至今日，醬菜以多樣的形式，如韓國(guó)泡菜、日本漬菜[]李里特，李風(fēng)娟，王卉，等．傳統(tǒng)發(fā)酵食品的機(jī)遇和創(chuàng)新[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版），2009（8）：61．[]HansenE.B.Commercialbacterialstarterculturesforfermentedfoodsofthefuture[J].IntJFoodMicrobiol,2002(78):119-131.[]盧沿鋼,董全.中、日、韓三國(guó)泡菜加工工藝的對(duì)比[J].食品與發(fā)酵科技,2011,47(04):5-9.據(jù)科學(xué)研究表明，醬菜中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如乳酸、無(wú)機(jī)鹽、纖維素、維生素等。在醬菜制作工藝中，醬菜腌制期間會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸菌、酵母菌等益生菌[[]黃道梅,李詠富,孟繁博,鄭秀艷,陳曦,李國(guó)林,林茂,胡露.泡菜微生物與風(fēng)味品質(zhì)研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品,2017,42(03):176-180.]，這些益生菌代謝可以產(chǎn)生的乳酸、乙醇、酯類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)，在增加了醬菜獨(dú)特風(fēng)味的同時(shí)，還起到了解膩開(kāi)胃、預(yù)防腫瘤、降低膽固醇[[[]黃道梅,李詠富,孟繁博,鄭秀艷,陳曦,李國(guó)林,林茂,胡露.泡菜微生物與風(fēng)味品質(zhì)研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品,2017,42(03):176-180.[]李文斌，唐中偉，宋敏麗．韓國(guó)泡菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與保健功能的最新研究[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2006（8）：83-84，102.中國(guó)作為腌制菜的發(fā)源地，其醬菜的生產(chǎn)大多傳承于傳統(tǒng)的制作工藝。在原料的選擇上，為了降低成本預(yù)算，同時(shí)確保成品的口感以及后期保存，醬菜的腌制多采用大白菜、胡蘿卜、青菜頭、菊芋等新鮮多產(chǎn)、肉質(zhì)肥厚、易于保存的蔬菜。由于南北氣候條件、文化差異等因素，南方醬菜多以鮮、甜、嫩[[]張琛.揚(yáng)州醬菜的簡(jiǎn)要概述[J].南寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2017,22(04):9-12.]為主，而北方醬菜多以香、辣、咸為主。在腌制工藝上，中國(guó)醬菜大多沿用傳統(tǒng)的腌制手法，利用高濃度的鹽水浸泡，在露天的發(fā)酵缸或發(fā)酵池內(nèi)進(jìn)行密封式自然發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后再進(jìn)行降鹽和加料處理[[[]張琛.揚(yáng)州醬菜的簡(jiǎn)要概述[J].南寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2017,22(04):9-12.[]李靜，王瑤，鄧毛程.泡菜中優(yōu)良乳酸菌篩選及特性的研究[J].食生物工程，2016，37（6）：229-232.而韓國(guó)和日本作為國(guó)外腌制菜的生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，其醬菜的腌制工藝區(qū)別于中國(guó)的傳統(tǒng)作坊式的生產(chǎn)，也都別具特色[[]陳靜.國(guó)內(nèi)外泡菜生產(chǎn)的研究進(jìn)展[J].江蘇食品與發(fā)酵，2007（1）：17-20.[]陳靜.國(guó)內(nèi)外泡菜生產(chǎn)的研究進(jìn)展[J].江蘇食品與發(fā)酵，2007（1）：17-20.首先對(duì)于韓國(guó)泡菜來(lái)說(shuō)，其醬菜腌制的關(guān)鍵點(diǎn)有三：首先，韓國(guó)泡菜在醬料的選取上有所豐富，添加了有辣椒粉、海蝦醬等調(diào)醬料，使得醬菜的口感更加鮮香，富有層次；其次，不同于中國(guó)醬菜的密封發(fā)酵，韓國(guó)泡菜多用燒制的陶缸或者玻璃罐發(fā)酵[[]生書(shū)晶,佘婷婷,吳映明,陳非,袁學(xué)文.中國(guó)泡菜研究的現(xiàn)狀、問(wèn)題及建議[J].中國(guó)調(diào)味品,2015,40(09):113-116.],據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，韓國(guó)泡菜中存在多種益生菌，其中乳酸菌就多達(dá)30多種[[]ChoJ,LeeD,YangC,etal.MicrobialpopulationdynamicsofKinchi,afermentedcabbageproduct[J].FEMSMicrobialLett,2006(257):262-267.[]生書(shū)晶,佘婷婷,吳映明,陳非,袁學(xué)文.中國(guó)泡菜研究的現(xiàn)狀、問(wèn)題及建議[J].中國(guó)調(diào)味品,2015,40(09):113-116.[]ChoJ,LeeD,YangC,etal.MicrobialpopulationdynamicsofKinchi,afermentedcabbageproduct[J].FEMSMicrobialLett,2006(257):262-267.[]LeeJS,HeoGY,LeeJW,etal.AnalysisofKimchimicroflorausingdenaturinggradientgelelectrophoresis[J].IntJFoodMicrobiol,2005(102):143-150.而日本漬菜在韓國(guó)泡菜的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，不同于韓國(guó)泡菜的重醬重料，日本漬菜主要是低鹽、低糖、增酸、本味的天然低溫非發(fā)酵式生產(chǎn)。日本漬菜的腌制方式主要有淺漬法和保存漬法兩種，針對(duì)不同的醬料保存時(shí)長(zhǎng)及用料程度進(jìn)行區(qū)分。根據(jù)所用醬料的不同，日本漬菜還可以分為鹽漬類(lèi)、糟漬類(lèi)、醬漬類(lèi)等。近年，日本開(kāi)始流行養(yǎng)生醬菜的制作[[]鄧晨.養(yǎng)生醬菜風(fēng)行日本[J].小康生活,2006(06):43[]鄧晨.養(yǎng)生醬菜風(fēng)行日本[J].小康生活,2006(06):43隨著全球經(jīng)濟(jì)化的不斷發(fā)展，人們對(duì)醬菜的需求也在不斷增長(zhǎng)。對(duì)比2012年至2018年中、美、日、韓四國(guó)腌制菜的消費(fèi)數(shù)據(jù)來(lái)看，在零售價(jià)格方面，各國(guó)腌菜主要零售產(chǎn)品噸價(jià)自2012年以來(lái)基本保持穩(wěn)定，整體上呈上升趨勢(shì)，并且中國(guó)的價(jià)格上升速度更快，從2012年2910美元/噸增長(zhǎng)20%至2018年3490元/噸。但是在差價(jià)上，日本和韓國(guó)兩國(guó)產(chǎn)品噸價(jià)保持在9000美元/噸左右，相對(duì)來(lái)說(shuō)遠(yuǎn)高于美國(guó)（6270元/噸）和中國(guó)。這是由于韓國(guó)和日本在腌制工藝上采用低溫發(fā)酵形式，設(shè)備投入成本較高。同時(shí)日韓兩國(guó)的腌菜產(chǎn)業(yè)已改變了傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，開(kāi)始形成一個(gè)包括原材料制備、加工生產(chǎn)、檢驗(yàn)檢測(cè)、低溫儲(chǔ)存、冷鏈運(yùn)輸、銷(xiāo)售等環(huán)節(jié)的生產(chǎn)流水線(xiàn)，并且制定了全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在產(chǎn)品研發(fā)上有較大投入。中國(guó)部分先行企業(yè)雖然已經(jīng)逐漸開(kāi)始注重通過(guò)投入自動(dòng)化生產(chǎn)設(shè)施來(lái)推動(dòng)生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，但仍有許多企業(yè)保留著傳統(tǒng)的腌制工藝，在產(chǎn)品工藝優(yōu)化方面存在短板，在一定程度上使得本國(guó)腌菜產(chǎn)品噸價(jià)的低迷。由此可見(jiàn)，我國(guó)應(yīng)加大科研力度，優(yōu)化發(fā)酵工藝，建立標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化、批量化的生產(chǎn)流水線(xiàn)，采用成熟的益生菌接種發(fā)酵工藝，改善醬菜的品質(zhì)，提高我國(guó)的醬菜產(chǎn)業(yè)水平。本課題通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究益生菌接種醬菜發(fā)酵工藝技術(shù)，通過(guò)篩選益生菌季也蒙耐鹽酵母菌以及改進(jìn)菌種接種比例來(lái)發(fā)酵菊芋醬菜。本課題通過(guò)接菌發(fā)酵不僅可以縮短菊芋醬菜的發(fā)酵周期，降低發(fā)酵鹽濃度，還能夠減少醬菜中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，有很好的發(fā)展前景。1.2中國(guó)醬腌菜制作工藝的研究醬腌菜的一般制作工藝流程為清洗、整形、加鹽滲水、浸泡鹽水、密封發(fā)酵、脫鹽清洗、入料、滅菌包裝。其中的關(guān)鍵性工藝即密封發(fā)酵過(guò)程，決定了醬菜的品質(zhì)，對(duì)醬菜的風(fēng)味口感有著十分重大的影響。由于發(fā)酵過(guò)程的重要性，眾多研究多是針對(duì)發(fā)酵工藝的優(yōu)化進(jìn)行探討的，現(xiàn)在具體的發(fā)酵工藝可以大致分為自然發(fā)酵和接種發(fā)酵。1.2.1自然發(fā)酵自然發(fā)酵是直接利用原蔬菜本身帶有的乳酸菌、酵母菌等微生物進(jìn)行發(fā)酵，因而在其生產(chǎn)過(guò)程中不可避免地會(huì)受到許多制約因素的影響，如受原材料生產(chǎn)時(shí)間的限制、氣候條件的限制等等。傳統(tǒng)的自然發(fā)酵技術(shù)還存在著發(fā)酵周期長(zhǎng)、亞硝酸鹽含量高[[]ToshirouHashimoto.Thecauseontheabnormalaccumulationofnitriteinpicklesofchinesecabbage(BrassicapekinesisRupr.)[J].NipponShokuhinKagakuKogakuKaishi，2001，48(6)：409－415．][]ToshirouHashimoto.Thecauseontheabnormalaccumulationofnitriteinpicklesofchinesecabbage(BrassicapekinesisRupr.)[J].NipponShokuhinKagakuKogakuKaishi，2001，48(6)：409－415．1.2.2接種發(fā)酵接種發(fā)酵是利用研究得到的醬菜益生菌進(jìn)行培養(yǎng)，純化擴(kuò)培后得到的菌種再在無(wú)菌狀態(tài)下接入發(fā)酵醬菜中進(jìn)行發(fā)酵。接種發(fā)酵從接種的菌種選擇上可以分為純種接種和混菌接種，純種接種是利用生長(zhǎng)旺盛的單一益生菌接入醬菜中，這種發(fā)酵方式可以說(shuō)是一種簡(jiǎn)單有效的發(fā)酵方式；混菌發(fā)酵則是接入兩種及以上的益生菌，他能往往能夠做到相互協(xié)助發(fā)酵的作用，在發(fā)酵過(guò)程中能夠減少副產(chǎn)物的生成等?？捎糜卺u菜腌制的酵母菌種研究乳酸菌和酵母菌在醬菜的腌制階段發(fā)揮著很大的作用。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理時(shí)的新鮮蔬菜中占優(yōu)勢(shì)的自然菌種大多為革蘭氏好氧陰性菌[[]吳元鋒，鄒禮根泡菜中乳酸菌的分離、鑒定及發(fā)酵性能研究中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2007，7（5）：43-46[]吳元鋒，鄒禮根泡菜中乳酸菌的分離、鑒定及發(fā)酵性能研究中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2007，7（5）：43-46現(xiàn)階段，各國(guó)針對(duì)腌制菜中乳酸菌的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，而對(duì)酵母菌的研究則相對(duì)偏少。已有的研究表明：目前發(fā)現(xiàn)的醬菜中的酵母菌主要有畢赤酵母、德氏酵母等[[]BrianJB,Wood.主編.徐巖譯.發(fā)酵食品微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2001,42]。酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物能夠抑制雜菌的生長(zhǎng)、還可以給醬菜增香增味，有著許多的益處；但同時(shí)部分酵母菌也會(huì)產(chǎn)生降解果膠的酶類(lèi)物質(zhì)，使蔬菜軟化[[[]BrianJB,Wood.主編.徐巖譯.發(fā)酵食品微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2001,42[]楊瑞，張偉，陳煉紅等.發(fā)酵條件對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程中微生物菌系的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè).2005(3):90-9菌種的篩選、鑒定及保存現(xiàn)代化的腌制技術(shù)有著幾點(diǎn)關(guān)鍵性的技術(shù)要點(diǎn)，其不僅要求硬件上的高標(biāo)準(zhǔn)、高效率，還需保證材料上的安全可靠?，F(xiàn)代的工業(yè)化腌制工藝與傳統(tǒng)的自然發(fā)酵工藝最大的不同就是接菌。菌種的種類(lèi)、功能、數(shù)量等因素很大程度上影響成品的質(zhì)量。工業(yè)上篩選出來(lái)的菌種一般需要生命力旺盛、繁殖速度快、有毒代謝物少、耐鹽、耐酸、降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)等特征。在本次課題研究中，我們從鹽城某醬菜制作廠的發(fā)酵池等處取樣，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離篩菌，再將提取分離出的酵母菌純化培養(yǎng)。根據(jù)不同鹽濃度、溫度等條件下各菌株的生長(zhǎng)情況挑選出實(shí)驗(yàn)課題所需的菌種。將提取出的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，采用YPD固體培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)和稀釋涂布培養(yǎng)。為了減少霉菌等雜菌物質(zhì)的干擾，篩選初期可以在PDA培養(yǎng)基中加入氯霉素來(lái)抑制雜菌的生長(zhǎng)。在生物領(lǐng)域中，鑒定酵母菌需要多道程序。從淺至深主要有形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和分子鑒定等。形態(tài)學(xué)鑒定主要是通過(guò)肉眼觀察酵母菌在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、大小、生長(zhǎng)狀況等，通過(guò)比對(duì)不同種屬的酵母菌菌落形態(tài)特征進(jìn)行簡(jiǎn)單的分辨歸類(lèi)，生理生化鑒定則是通過(guò)酵母菌在某些化學(xué)物質(zhì)的作用下發(fā)生的反應(yīng)進(jìn)一步分辨鑒定，基本可以確定酵母的功能特征。分子鑒定則是通過(guò)檢測(cè)分子水平的基因組序列對(duì)酵母進(jìn)行鑒定。目前隨著科學(xué)技術(shù)的更新，更多地改善了菌種的分類(lèi)鑒定在分子水平上的研究，針對(duì)不同的基因組序列，檢測(cè)方法也各不相同，使用較多的方法有(26S)rDNAD1/D2序列分析、DNA雜交、16SrRNA序列分析和質(zhì)粒圖譜等。以上鑒定各有特色，層層深入，前兩種方法操作簡(jiǎn)單、可觀性強(qiáng)、反應(yīng)明顯，但操作工作量大，效率較低、且僅在菌落層面進(jìn)行鑒定，受操作人員主觀影響較大；而分子鑒定以核酸為研究對(duì)象，利用酵母菌大亞基(26S)rDNAD1/D2可變區(qū)的序列進(jìn)行分析，從而鑒定出酵母菌的品系。菌種保存的方法多種多樣，根據(jù)菌種的特性、生長(zhǎng)情況、應(yīng)用等方面的不同，大致有斜面保存法、載體保存法、甘油管保存、液氮保存、冷凍干燥保存等。本實(shí)驗(yàn)在前期純化培養(yǎng)菌種時(shí)采用甘油管保存的方式，該方法簡(jiǎn)便、耗材少、適用于保藏期較短的菌種。在確定實(shí)驗(yàn)課題所需菌種后，對(duì)于目的菌株采取的是冷凍干燥保存的方式，將菌株制成菌粉形態(tài)，更易于保管和應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外有關(guān)醬菜發(fā)酵的主要研究情況接菌發(fā)酵醬菜雖然有著極大的發(fā)展空間，但是也面對(duì)著許多的挑戰(zhàn)和難題?，F(xiàn)如今，為了解決這些問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外的研究者們進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究。杜志琳[[]杜志琳,尹望.一株來(lái)自泡菜汁中的酵母菌分離鑒定[J].飼料研究,2014(21):24-27.]等人從泡菜汁中分離得到了一株酵母菌，經(jīng)過(guò)分析鑒定得出該酵母菌為畢赤酵母HEW-C206。李院[[]李院.醬菜中抑霉菌的乳酸菌分離、鑒定及抑菌活性物質(zhì)分析[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2015.]等人對(duì)市面上銷(xiāo)售的品牌醬菜進(jìn)行探究，篩選得到三株乳酸菌，分別是清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和植物乳桿菌，發(fā)現(xiàn)這三株乳酸菌有抑制霉菌等雜菌生長(zhǎng)的作用，這對(duì)于提高醬菜品質(zhì)，降低醬菜腐壞率具有重要的意義。侯曉艷[]杜志琳,尹望.一株來(lái)自泡菜汁中的酵母菌分離鑒定[J].飼料研究,2014(21):24-27.[]李院.醬菜中抑霉菌的乳酸菌分離、鑒定及抑菌活性物質(zhì)分析[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2015.[]侯曉艷，陳安均，羅惟，等.不同乳酸菌純種發(fā)酵蘿卜過(guò)程中品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化[J].食品工業(yè)科技，2015，36（2）：181-185.1.3醬菜品質(zhì)的分析理化指標(biāo)醬菜擁有獨(dú)特的食物風(fēng)味，在醬菜接菌生產(chǎn)過(guò)程中，菌種、鹽分、發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)等各個(gè)因素的選擇上，都會(huì)影響醬菜的最終發(fā)酵品質(zhì)。因此，醬菜成品是否符合標(biāo)準(zhǔn)的食用要求，還有需要做進(jìn)一步的探究。1.3.1乳酸乳酸作為一種有機(jī)酸，是乳酸菌的代謝產(chǎn)物，酸奶中富含乳酸，由于其酸味不具有刺激性，使得腌制品具有獨(dú)特的香味，可以增強(qiáng)人體腸胃的蠕動(dòng)，有助于腸道消化吸收[[]蘇揚(yáng)，陳云川.泡菜的風(fēng)味化學(xué)及呈味機(jī)理的探討[J].中國(guó)調(diào)味品，2001,266（4）：28~31.[]蘇揚(yáng)，陳云川.泡菜的風(fēng)味化學(xué)及呈味機(jī)理的探討[J].中國(guó)調(diào)味品，2001,266（4）：28~鹽度醬菜在傳統(tǒng)工藝腌制中會(huì)以高濃度的鹽水進(jìn)行浸泡，一方面能都起到抑菌殺菌的作用，另一方面也能夠提高醬菜的風(fēng)味，保證醬菜的口感。然而高濃度的鹽含量對(duì)人體也有著極大的危害。據(jù)中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)表明，正常成年人每天的食鹽量應(yīng)該控制在3~5g[[]中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì).中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量（2013版）[M].北京：科學(xué)出版社，2014.[]中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì).中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量（2013版）[M].北京：科學(xué)出版社，20亞硝酸鹽很多人在聽(tīng)到亞硝酸鹽的時(shí)候都會(huì)談“硝”色變，但其實(shí)亞硝酸鹽本身并沒(méi)有毒性。真正對(duì)人體產(chǎn)生危害的主要是亞硝胺，亞硝胺會(huì)導(dǎo)致人體發(fā)生畸形，且嚴(yán)重者會(huì)產(chǎn)生癌變[[]周相玲,朱文嫻,湯樹(shù)明,張慶成,孫國(guó)波.人工發(fā)酵與自然發(fā)酵泡菜中亞硝酸鹽含量的對(duì)比分析[J].中國(guó)釀造,2007(11):51-52.]。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽在人體內(nèi)與仲胺合成的亞硝胺所引發(fā)的癌變癥狀可通過(guò)胎盤(pán)傳給后代，并且發(fā)生率極高[[[]周相玲,朱文嫻,湯樹(shù)明,張慶成,孫國(guó)波.人工發(fā)酵與自然發(fā)酵泡菜中亞硝酸鹽含量的對(duì)比分析[J].中國(guó)釀造,2007(11):51-52.[]中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所化學(xué)基因組．腫瘤防治研究[M]．3版北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：12-18．雖然醬菜腌制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽，但是隨著腌制周期的增長(zhǎng)，亞硝酸鹽的含量會(huì)明顯下降，一般在半個(gè)月左右，亞硝酸鹽就基本消失。實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)樣品亞硝酸鹽的方法有很多，最快速有效的方法是利用亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸在鹽酸酸化條件下發(fā)生的重氮化反應(yīng)，讓反應(yīng)物與N-1－萘基乙二胺偶聯(lián)形成紫色產(chǎn)物，根據(jù)反應(yīng)的顏色不同來(lái)檢測(cè)醬菜的亞硝酸鹽含量[[]衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所．食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定：GB／T5009．33[]衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所．食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定：GB／T5009．33—2010[S]．北京．中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010．第二章實(shí)驗(yàn)部分2.1引言傳統(tǒng)的醬菜腌制工藝有兩大缺點(diǎn)：高濃度鹽和發(fā)酵周期長(zhǎng)。高濃度的鹽含量雖然可以起到抑制雜菌生長(zhǎng)、保持醬菜口感等作用，但也會(huì)導(dǎo)致亞硝酸鹽含量過(guò)高等負(fù)面影響；亞硝酸鹽含量會(huì)在發(fā)酵過(guò)程中逐漸減少，因而延長(zhǎng)發(fā)酵周期能夠降低醬菜中的亞硝酸鹽含量，但同時(shí)也增加了醬菜發(fā)酵的成本。目前的現(xiàn)代化醬菜制作工藝為了解決這兩個(gè)問(wèn)題采用接菌發(fā)酵的方式，篩選出醬菜發(fā)酵過(guò)程中的益生菌，并進(jìn)行培養(yǎng)，再將菌種接入醬菜發(fā)酵罐中，降低醬菜發(fā)酵過(guò)程中的鹽濃度，縮短發(fā)酵周期，加大益生菌的活力，從而達(dá)到提高醬菜發(fā)酵質(zhì)量的目的。2.2試劑與儀器2.2.1原料發(fā)酵醬菜汁：采自鹽城市某醬菜廠菊芋池、菊芋缸和胡蘿卜池中。新鮮菊芋：采購(gòu)自鹽城市某醬菜廠。2.2.2主要試劑表2-1實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑規(guī)格生產(chǎn)廠家鄰苯二甲酸氫鉀工作基準(zhǔn)試劑天津市化學(xué)試劑研究所有限公司孟加拉紅瓊脂生化試劑BR青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司磷酸二氫鉀分析純AR江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司酵母浸出膏分析純AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司亞硝酸鈉分析純AR上海山浦化工有限公司氯霉素10g上海生工生物工程股份有限公司脫脂奶粉100g杜爾伯特伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）引物上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司引物NL2（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）引物上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司2.2.3主要儀器表2-2實(shí)驗(yàn)儀器儀器型號(hào)廠家電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9140A上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司三用恒溫水箱DK-600S上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司高速離心機(jī)5805R德國(guó)Eppendorf移液器各種量程規(guī)格德國(guó)Eppendorf攪拌機(jī)MJ-WBL2501B廣東美的生活電器制造有限公司電子分析天平AL-104上海儀器有限公司超聲波清洗儀KQ-500B上海普渡生化科技有限公司紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)SP-756上海光譜儀器有限公司鹽度計(jì)0~28深圳市鼎鑫宜實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司冷凍干燥機(jī)LGJ-10C北京四環(huán)科學(xué)儀器廠PCR儀2720AB1公司顯微鏡E3寧波舜宇儀器有限公司2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1菌種的篩選取發(fā)酵醬菜汁6份，分別采自鹽城市某醬菜廠菊芋池、菊芋缸和胡蘿卜池中，用滅過(guò)菌的一次性吸管吸取菊芋池、菊芋缸以及胡蘿卜池中的發(fā)酵液各20mL,將發(fā)酵液分別裝入50mL無(wú)菌離心管，標(biāo)記標(biāo)簽，備用。取上述醬菜汁1mL，按梯度稀釋至，取0.2mL稀釋液各接種于115℃滅菌20min的YPD固體培養(yǎng)基中，于28℃下培養(yǎng)24~48h，再?gòu)闹刑暨x出類(lèi)似酵母菌的菌株，進(jìn)行純化培養(yǎng)，去除雜菌等物質(zhì)。將分離純化的菌種分別接入不同鹽濃度的固體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)箱中的溫度控制在28℃，恒溫通風(fēng)培養(yǎng)48h，記錄各菌種生長(zhǎng)情況，挑選出耐鹽度高且生長(zhǎng)旺盛的酵母菌株。將分離得到的酵母菌株先用甘油管進(jìn)行保存，甘油濃度在25~30%。接種完畢后放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.2酵母菌的菌體形態(tài)及生理生化鑒定將冷凍保藏的菌株取出活化，在固體培養(yǎng)基中于28℃劃線(xiàn)培養(yǎng)24~48h，在劃線(xiàn)過(guò)程中采取少量少次的方法，在減少雜菌干擾的情況下，盡量使得菌落相互分離，以便于觀察菌落的色澤、形態(tài)、大小等。觀察完畢后，用接種環(huán)挑取少量菌落放入滴加了生理鹽水的載玻片中央。用鑷子夾住蓋玻片的一邊，小心地將另一邊貼附到生理鹽水中，輕輕放下蓋玻片，排出縫隙中的氣泡。將制得的玻片放到顯微鏡下進(jìn)行觀察，找到油鏡下菌體細(xì)胞的形態(tài)，用手機(jī)拍攝照片，并做標(biāo)記記錄。2.3.3菌種的分子鑒定本研究運(yùn)用26SrRNA基因D1/D2區(qū)序列分析的方法研究從菊芋醬菜汁中分離出的酵母菌株，旨在通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行菌種的分子鑒定。酵母菌DNA的提取酵母菌DNA的提取采用SDS裂解法。酵母菌26SrDNAD1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增及反應(yīng)程序酶與實(shí)驗(yàn)試劑：TaqDNA聚合酶2μL、瓊脂糖、DNTPMIX1μL、引物NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'、引物NL2：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'各2μL，10*taqBuffer10μL,模板DNA5μL，雙蒸水28μL。實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀、水平電泳儀等。（3）操作步驟：根據(jù)26SrDNAJ基因D1/D2序列對(duì)酵母菌DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：96℃預(yù)變性5min；96℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)35次；再72℃延伸7min。制作瓊脂糖凝膠板用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，將制作好的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽中，槽中加入緩沖液需沒(méi)過(guò)凝膠板的加樣孔；將樣品、Marker等依次放入加樣孔后，接入電源，將電壓保持在70V，使DNA樣品由負(fù)極向正極泳動(dòng)，跑膠30min后切斷電源，終止電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠板，在凝膠成像儀中觀察電泳條帶的位置，通過(guò)比對(duì)Marker的位置得出樣品的大小。酵母菌26SrDNAD1/D2區(qū)序列分析將得到的的酵母菌26SrDNAD1/D2區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州泓迅生物科技有限公司，委托其進(jìn)行基因序列測(cè)定。數(shù)據(jù)處理將測(cè)序結(jié)果用SequencescannerV1.0軟件進(jìn)行分析，查看序列的長(zhǎng)度以及可信度。選擇測(cè)序結(jié)果中可信度較高的序列，將選定的序列提交至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果中顯示的序列相似度高低來(lái)確定待鑒定菌株的種屬分類(lèi)。以相似度大于99%時(shí)確定其屬和種，初步確定酵母菌株的分類(lèi)學(xué)地位。2.3.4獲得的酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)及菌粉制備通過(guò)前期培養(yǎng)，掌握選取的酵母菌的生長(zhǎng)周期。通過(guò)搖瓶培養(yǎng)的方式進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，制得400mL酵母菌菌液。本課題采用冷凍干燥的方法進(jìn)行菌種的保存。將制得的菌液分裝入50mL離心管中1800r/min下離心10min，離心完畢后盡快倒去上清液，保留沉淀菌體，添加生理鹽水震蕩清洗，再次離心兩次，隨后倒去上清液，保留沉淀菌體。根據(jù)前期文獻(xiàn)的查閱，確定實(shí)驗(yàn)所需的保護(hù)劑，將提前制備好的保護(hù)劑加入到沉淀菌體中，震蕩溶解，形成菌懸液。將加入保護(hù)劑后的菌懸液倒入滅菌過(guò)的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封住皿口，在保鮮膜上戳適量孔洞，隨后放入-20℃冰箱進(jìn)行冷凍8h，直至菌懸液凝固取出。使用冷凍干燥機(jī)，按照正常操作進(jìn)行凍干，冷凍2d后，取出培養(yǎng)皿，制得菌粉，放入無(wú)菌自封袋中標(biāo)記保存。2.3.5益生菌應(yīng)用于菊芋醬菜制備的工藝（或方法）研究醬菜的腌制方法確定采購(gòu)鹽城某醬菜廠的新鮮菊芋10kg,進(jìn)行預(yù)處理，清洗風(fēng)干1~2h。將預(yù)處理好的菊芋在鹽中進(jìn)行揉搓，隨后分裝至準(zhǔn)備好的滅菌壇中，共分裝4只，進(jìn)行標(biāo)記。預(yù)腌制24h后，觀察壇中菊芋滲水情況，隨后向各個(gè)壇中分別加入250g煮沸冷卻后的10%食鹽水，再腌制24h。將醬菜壇分別標(biāo)記為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)，其中1、2號(hào)作為空白對(duì)照組，不添加菌種，3、4號(hào)作為酵母菌組，添加季也蒙耐鹽酵母菌，菌種的添加量按菌懸液：鹽水為1:50的比例添加菌懸液，接菌結(jié)束后密封保存醬菜壇3個(gè)月。醬菜鹽濃度測(cè)量方法的確定在醬菜腌制3個(gè)月后，每周次無(wú)菌采集各壇醬菜汁適量，使用實(shí)驗(yàn)室鹽度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。鹽度計(jì)是利用鹽溶液中可溶性物質(zhì)含量與折光率在普通環(huán)境下成正比例，從而來(lái)測(cè)定出鹽溶液的折光率，這樣就求算出鹽的濃度[[][]陳瑞歡.鹽度計(jì)(鹽分測(cè)試儀)校準(zhǔn)方法的探討[J].計(jì)量與測(cè)試技術(shù),2019,46(03):32-33.致謝時(shí)光荏苒，一去四年，在2016年的那個(gè)暑假我拿到了鹽城工學(xué)院的錄取通知書(shū)，在2020年的這個(gè)暑假，我便要背上行囊離開(kāi)這個(gè)生活了4年的地方，心中不免傷感。在這個(gè)夢(mèng)想起航的地方，我領(lǐng)略到了鹽城的美麗風(fēng)光，品嘗到了當(dāng)?shù)鬲?dú)特的美食，學(xué)習(xí)到了基礎(chǔ)理論知識(shí)的同時(shí)也懂得了許多人生哲理。四年前入學(xué)時(shí)，我還是一個(gè)青澀稚嫩的小學(xué)妹，四年后的現(xiàn)在，我已然變成了一個(gè)開(kāi)朗獨(dú)立的老學(xué)姐，時(shí)光從我們的身邊匆匆流過(guò)，剩下的回憶卻那么的美好且珍貴。在這四年里，我從學(xué)會(huì)專(zhuān)業(yè)的基礎(chǔ)理論知識(shí)，到進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)操作；從能夠熟練地使用實(shí)驗(yàn)器材，到現(xiàn)在的能夠完成自己的畢業(yè)論文。每一次進(jìn)步都離不開(kāi)老師的悉心指導(dǎo)。首先，本論文是在導(dǎo)師高健老師的悉心指導(dǎo)下完成的，導(dǎo)師淵博的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，精益求精的工作作風(fēng)，嚴(yán)以律己寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無(wú)華、平易近人的人格魅力對(duì)我影響深遠(yuǎn)。不禁使我樹(shù)立了遠(yuǎn)大的學(xué)術(shù)目標(biāo)學(xué)握了基本的研究方法，還是我明白了許多待人接物與為人處事的道理。本論文從選題到完成，每步都是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下完成的，傾注了導(dǎo)師大量的心血。在此，謹(jǐn)向?qū)煴硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x!本論文的順利完成，離不開(kāi)各位老師、同學(xué)和朋友的關(guān)心和幫助。在此感謝感謝實(shí)驗(yàn)室張麗老師的指導(dǎo)和幫助；感謝黃巍巍學(xué)長(zhǎng)和劉俊偉學(xué)長(zhǎng)的關(guān)心支持和幫助；在四年的學(xué)習(xí)期間，得到袁靜和學(xué)弟學(xué)妹們的關(guān)心和幫助，在此表示深深的感謝。沒(méi)有他們的幫助和支持是沒(méi)有辦法完成我的學(xué)位論文的，同窗之間的友誼永遠(yuǎn)長(zhǎng)存。最后感謝我的父母，感謝他們從小到大一直陪伴著我，支持鼓勵(lì)著我，是他們無(wú)私的付出，為我創(chuàng)造良好的學(xué)習(xí)條件，我才能順利的完成學(xué)業(yè)，感謝他們對(duì)我的撫養(yǎng)和培育。謹(jǐn)以此文獻(xiàn)給所有關(guān)心幫助我的人，再次表示由衷的謝意！實(shí)驗(yàn)試劑：帶測(cè)樣品、蒸餾水等。使用儀器：實(shí)驗(yàn)室鹽度計(jì)、一次性吸管、紙巾等。（3）操作步驟：打開(kāi)蓋板，將純凈水滴2~3滴到棱鏡上，從目鏡處觀察，藍(lán)白分界線(xiàn)是否在“0”刻度線(xiàn)上，如果不在，則用螺絲刀進(jìn)行校正，校正完畢后，用紙巾擦拭干凈。隨后取待測(cè)溶液數(shù)滴，置于檢測(cè)棱鏡上，合上蓋板，使溶液遍布棱鏡表面。將棱鏡處移動(dòng)到光線(xiàn)明亮的地方，眼睛靠近目鏡處觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)握手調(diào)整鏡像，直至可清晰地看清藍(lán)白界線(xiàn)的成像，界線(xiàn)處的數(shù)值即為樣品的鹽濃度。將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄并分析。亞硝酸鹽含量的測(cè)量方法的確定本實(shí)驗(yàn)利用亞硝酸鹽在鹽酸酸化條件下，與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，再與N-1－萘基乙二胺偶聯(lián)形成紫紅色產(chǎn)物這一顯色反應(yīng)，制作出亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，然后再運(yùn)用紫外分光光度計(jì)，通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)計(jì)算出樣品中的亞硝酸鹽含量。實(shí)驗(yàn)試劑：蒸餾水、氯化銨、60%乙酸、0.42mol/L硫酸鋅溶液、20g/L氫氧化鈉溶液、對(duì)氨基苯磺酸溶液、1g/LN-1-萘基乙二胺溶液、顯色劑（在檢測(cè)樣品前配制的將N-1-萘基乙二胺溶液1g/L和對(duì)氨基苯磺酸溶液等體積混合均勻，即為顯色劑）、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用儀器：榨汁機(jī)、分光光度計(jì)、比色管(25mL*8)、燒杯、恒溫水浴鍋、漏斗、100mL、250mL、500mL容量瓶、量筒若干。步驟方法：亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：用移液槍分別依次吸取0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別加入到干燥潔凈的帶塞比色管中。向各個(gè)比色管中統(tǒng)一依次加入4.5mL氯化銨緩沖液、2.5mL60%乙酸、5mL顯色劑，最后加水至20mL刻度線(xiàn)，震蕩混合均勻。此時(shí)，各比色管中的亞硝酸鈉依次代表0μg、2.5μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg。將各比色管放置于黑暗處?kù)o置25min，隨后取出，觀察各管顯色情況。使用紫外分光光度計(jì)，將波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至540nm，以0號(hào)管作為對(duì)照品，進(jìn)行吸光度檢測(cè)，測(cè)的數(shù)據(jù)記錄繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品處理：稱(chēng)取10g的醬菜，將其切碎后放入榨汁機(jī)中，添加70mL水，攪碎后倒入燒杯中，向其中加入12mL氫氧化鈉溶液20g/L，在用20g/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至8，隨后轉(zhuǎn)移溶液到250ml容量瓶中，加入10ml硫酸鋅，混合均勻，再次添加氫氧化鈉溶液直到產(chǎn)生白色絮狀沉淀為止。將處理好的樣品放置于水浴鍋中加熱，溫度為60℃，加熱10min后取出，放置冷卻，隨后加水定容至刻度，再次混合均勻，靜置30min。操作完成后，用濾紙過(guò)濾各容量瓶中溶液，初濾液30ml倒棄不用，保存20ml左右濾液用于檢測(cè)。樣品測(cè)定：吸取10.0mL上述濾液于25mL帶塞比色管中，加入4.5mL氯化銨緩沖液，加2.5mL60%乙酸后立即加入5.0mL顯色劑，加水至刻度，混勻，置暗處25min，用2cm比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)540nm處測(cè)吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到相應(yīng)的亞硝酸鹽含量，計(jì)算出實(shí)際樣品中的亞硝酸鹽的含量。將數(shù)據(jù)記錄并處理，保存。醬菜中菌落數(shù)的測(cè)量方法的確定在超凈工作臺(tái)中，每周次取醬菜汁1mL，經(jīng)適當(dāng)稀釋?zhuān)M量使其中的菌種充分分散成單個(gè)細(xì)胞，然后取一定量的稀釋液涂布接種到孟加拉紅固體培養(yǎng)基中。經(jīng)48h的培養(yǎng)后，由每個(gè)單細(xì)胞生成的肉眼可見(jiàn)的單菌落，統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)后，根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量進(jìn)行換算，得出醬菜中的菌落數(shù)。醬菜中乳酸含量的測(cè)量方法采用標(biāo)定的0.1mol／LNaOH溶液滴定總酸，換算成乳酸含量。（1）實(shí)驗(yàn)試劑：氫氧化鈉、酚酞指示劑、鄰苯二甲酸氫鉀、蒸餾水、干燥劑（2）實(shí)驗(yàn)儀器：儀器：20mL堿式滴定管、100mL容量瓶、10mL移液管、100mL量筒、1%酚酞指示劑、膠頭滴管/滴瓶、1000mL容量瓶等。操作步驟：配制0.1moL/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)量4g的固體氫氧化鈉，迅速地放入小燒杯中，加入適量的蒸餾水溶解，快速攪拌。將溶解好的NaOH溶液沿著玻棒加入到1000mL容量瓶中，隨后用蒸餾水依次潤(rùn)洗小燒杯和玻棒，將潤(rùn)洗的殘余NaOH溶液加入到容量瓶中，以保證溶液濃度的準(zhǔn)確性。隨后向容量瓶中加入蒸餾水，定容。定容完成后將容量瓶上下反復(fù)顛倒震蕩，將溶液混合均勻，備用。標(biāo)準(zhǔn)滴定0.1mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取1g左右的基準(zhǔn)物鄰苯二甲酸氫鉀放入稱(chēng)量瓶中，將稱(chēng)量的鄰苯二甲酸氫鉀連同稱(chēng)量瓶一起放入硅膠干燥器中干燥24h，隨后準(zhǔn)確稱(chēng)量0.6g的鄰苯二甲酸氫鉀移入錐形瓶中，加入50mL的蒸餾水，由于鄰苯二甲酸氫鉀在水中的溶解度不高，所以在溶解過(guò)程中需要加熱。待鄰苯二甲酸氫鉀完全溶于水中后，向錐形瓶中加入2至3滴酚酞。堿式滴定管用蒸餾水潤(rùn)洗3次，再用0.1mol/LNaOH潤(rùn)洗3次，隨后將標(biāo)準(zhǔn)液加入到堿式滴定管中，校正好刻度準(zhǔn)備滴定。在滴定過(guò)程中，需不斷地振蕩錐形瓶，確保滴定液與基準(zhǔn)液的充分混合，當(dāng)錐形瓶中的溶液顏色保持3分鐘為粉紅色時(shí)，滴定結(jié)束。滴定完成后，讀取堿式滴定管上刻度線(xiàn)，根據(jù)公式推算出0.1mol/LNaOH的準(zhǔn)確濃度。樣品的處理與測(cè)定：每周用移液管吸取各壇醬菜10mL發(fā)酵液，加入100mL容量瓶中，振蕩均勻后，用濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確吸取過(guò)濾液20mL，放入錐形瓶中，再加入1%酚酞2到3滴，用前面標(biāo)定好的氫氧化鈉溶液滴定，當(dāng)錐形瓶中的溶液呈現(xiàn)粉紅色并且在0.5min內(nèi)不褪色時(shí)，記下NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的用量，上述操作反復(fù)3次，最后取平均值，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。根據(jù)公式：R——乳酸含量，%V——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液用量,mLN——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)液摩爾濃度，mol/LW——發(fā)酵液量,mLK——轉(zhuǎn)化乳酸系數(shù)0.09得出各組醬菜中的乳酸含量，并記錄。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)把亞硝酸鹽含量設(shè)置為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值設(shè)置為縱坐標(biāo)，繪制出亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖2-1，得回歸方程Y=0.0135X+0.0018，R2=0.9966，線(xiàn)性良好。圖2-1亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1酵母菌的分離和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果分析從醬菜發(fā)酵液中總共提取了3株酵母菌株，利用YPD培養(yǎng)基對(duì)這3株酵母菌株進(jìn)行了純化培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)選取了其中一株編號(hào)為J2的酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)應(yīng)用。該酵母菌的平板菌落形態(tài)如下圖所示。圖3-1J2酵母菌落形態(tài)圖基于菌落的形態(tài)、大小、表面光滑度、濕潤(rùn)程度等進(jìn)行初步的分析鑒定。分析結(jié)果如下表：菌種編號(hào)J2菌落顏色微黃色菌落形態(tài)圓形表面光滑度光滑邊緣整齊大小不均等隆起形狀低凸透明度不透明假菌絲無(wú)表3-1J2酵母菌落形態(tài)特征通過(guò)顯微鏡對(duì)該酵母菌進(jìn)行觀察，其細(xì)胞形態(tài)如下圖所示：圖3-2J2酵母細(xì)胞形態(tài)圖根據(jù)上述圖表可以看出，該酵母菌細(xì)胞形態(tài)較小，無(wú)假菌絲，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞繁殖速度快。3.2菌種的分子鑒定結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)利用NL1和NL2這兩個(gè)引物對(duì)挑選出來(lái)的J2酵母菌26SrDNA的D1/D2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約538bp的目的片段，結(jié)果見(jiàn)下圖。MarkerJ2500bpMarkerJ2500bp圖3-3擴(kuò)增的26SrDNA的D1/D2區(qū)域電泳圖將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，隨后送至蘇州泓迅生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用SequencescannerV1.0軟件進(jìn)行分析，再將選定的序列提交至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果中顯示的序列相似度高低確定了J2酵母菌為季也蒙耐鹽酵母。3.3菌粉制備結(jié)果本實(shí)驗(yàn)通過(guò)冷凍干燥法將鑒定出來(lái)的季也蒙耐鹽酵母進(jìn)行凍干制成菌粉。制作流程及成品如下圖所示。圖3-4冷凍干燥流程圖圖3-5成品展示圖3.4發(fā)酵醬菜鹽濃度測(cè)量結(jié)果在目前的菊芋醬菜腌制工藝中，傳統(tǒng)的工廠化生產(chǎn)大多采取高鹽度抑制雜菌的方式，在腌制初期，將處理好的菊芋用12%的鹽水進(jìn)行腌制，然后按梯度逐漸增加鹽濃度至15%左右，使腌制過(guò)程處于高鹽度狀態(tài)。在腌制結(jié)束后，再用清水進(jìn)行沖洗浸泡，以此降低鹽濃度。本實(shí)驗(yàn)采用接菌的方式在低鹽濃度下接種益生菌，空白對(duì)照組和接菌組的醬菜的鹽濃度分析圖如下：圖3-6空白對(duì)照和純菌接種醬菜的鹽濃度比較根據(jù)圖表信息可以得知，在醬菜腌制3個(gè)月后，鹽濃度基本穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)初期，各壇醬菜的鹽濃度基本保持在8%~10%，據(jù)研究表明，鹽濃度在此階段可以保存成品90d左右。保持較低鹽度的處理目的是為了在初期控制菌體的數(shù)量，同時(shí)也能夠保證滲透壓的平衡，使物質(zhì)的代謝活動(dòng)保持穩(wěn)定持續(xù)。在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)期間，對(duì)照組和接菌組的鹽濃度都有輕微下降，具體原因是醬菜壇容量較小，受各時(shí)間段取樣的影響，導(dǎo)致鹽分的輕微流失，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有所影響。3.5發(fā)酵醬菜亞硝酸鹽含量測(cè)量結(jié)果醬菜腌制過(guò)程中，由于蔬菜中含有大量硝酸鹽，會(huì)在大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等硝酸鹽還原菌的作用下，將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。在醬菜腌制初期，乳酸菌、酵母菌含量還不是很高，無(wú)法抑制硝酸鹽還原菌的生長(zhǎng)，醬菜中的亞硝酸鹽含量會(huì)逐漸增長(zhǎng)。然而在加鹽、密封以及低溫的發(fā)酵條件下，乳酸菌及酵母菌會(huì)逐漸增多，在抑制雜菌的同時(shí)，也會(huì)分解亞硝酸鹽，使得在醬菜發(fā)酵后期，亞硝酸鹽含量降到很低的水平。本實(shí)驗(yàn)測(cè)量了發(fā)酵3個(gè)月后對(duì)照組和接菌組中的亞硝酸含量，如下圖所示：圖3-7對(duì)照組和接菌組醬菜的亞硝酸鹽含量比較本實(shí)驗(yàn)在醬菜發(fā)酵3個(gè)月之后進(jìn)行檢測(cè)，旨在研究在較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵過(guò)程后醬菜中的亞硝