凋亡抑制蛋白Livin：解鎖人乳腺癌發(fā)病與防治機(jī)制的關(guān)鍵密碼一、引言1.1研究背景乳腺癌作為全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，取代肺癌成為全球發(fā)病率最高的癌癥，且每年約有68.5萬人死于乳腺癌。在中國，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，2020年中國女性乳腺癌新發(fā)病例約為42萬例，占全球新發(fā)病例的18.6%，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，比西方女性的發(fā)病年齡早10-15年，高發(fā)年齡在45-55歲之間。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過程，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前認(rèn)為，乳腺癌的發(fā)生與原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及細(xì)胞凋亡調(diào)控異常等密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的自主性有序死亡過程，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制發(fā)生異常時(shí)，細(xì)胞凋亡受抑制，導(dǎo)致細(xì)胞生存期延長，有利于轉(zhuǎn)化突變的細(xì)胞生長積聚，最終可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisprotein，IAP）家族是一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的內(nèi)源性凋亡抑制因子，它們通過抑制細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶——半胱天冬酶（Caspase）的活性，從而發(fā)揮抗凋亡作用。Livin作為IAP家族的重要成員之一，近年來在腫瘤研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。Livin基因位于染色體20q13.3，全長46kb，包含7個(gè)外顯子及6個(gè)內(nèi)含子。由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物剪接方式的不同，Livin主要存在兩種mRNA亞型，即Livinα和Livinβ，兩種亞型均含有一個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)（BIR）結(jié)構(gòu)域及一個(gè)環(huán)指（RING）結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域是Livin與Caspase蛋白結(jié)合的關(guān)鍵部位，可阻止Caspases蛋白在細(xì)胞凋亡時(shí)執(zhí)行蛋白切除功能，從而抑制細(xì)胞凋亡；RING結(jié)構(gòu)域則具有E3泛素連接酶活性，參與蛋白質(zhì)的泛素化修飾過程，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程。大量研究表明，Livin在多種人類惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，如肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌等，且其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，Livin的高表達(dá)可通過抑制Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9等的活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。此外，Livin還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1、p21等，影響腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程，使其更易于進(jìn)入增殖期，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長。同時(shí)，Livin的表達(dá)與腫瘤的耐藥性也存在一定關(guān)聯(lián)，其高表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療產(chǎn)生抵抗，降低腫瘤的治療效果。在乳腺癌研究領(lǐng)域，Livin與乳腺癌的相關(guān)性研究也逐漸成為熱點(diǎn)。已有研究報(bào)道，Livin在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于乳腺良性腫瘤組織和正常乳腺組織，且其表達(dá)水平與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及組織學(xué)分級(jí)等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)Livin在腫瘤直徑大于2cm的乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于腫瘤直徑小于2cm的組織；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中，Livin的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織；隨著乳腺癌臨床分期的升高和組織學(xué)分級(jí)的增加，Livin的表達(dá)水平也逐漸升高。這些研究結(jié)果表明，Livin可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，有望成為乳腺癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，目前關(guān)于Livin在乳腺癌中的具體作用機(jī)制尚未完全闡明，仍存在許多亟待解決的問題。例如，Livin在乳腺癌細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)通路及其與其他凋亡相關(guān)蛋白和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之間的相互作用關(guān)系尚不明確；Livin作為潛在治療靶點(diǎn)，如何開發(fā)高效、低毒的靶向治療藥物以及如何提高乳腺癌患者對(duì)靶向治療的敏感性等問題也有待進(jìn)一步研究。因此，深入探究凋亡抑制蛋白Livin在人乳腺癌中的作用及其機(jī)制，對(duì)于揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及改善乳腺癌患者的預(yù)后具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在深入探究凋亡抑制蛋白Livin在人乳腺癌中的作用及其潛在機(jī)制，具體研究目的如下：明確Livin在人乳腺癌中的表達(dá)情況：運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Westernblot和Real-timePCR等技術(shù)，檢測Livin在人乳腺癌組織、癌旁組織以及正常乳腺組織中的表達(dá)水平，分析其在不同組織中的表達(dá)差異，以及Livin表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（HER-2）等）之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。揭示Livin在人乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制：通過構(gòu)建針對(duì)Livin的小干擾RNA（siRNA）表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株，下調(diào)Livin的表達(dá)，觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響。進(jìn)一步研究Livin通過何種信號(hào)通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，以及Livin與其他凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之間的相互作用關(guān)系，從分子水平闡明Livin在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。探索Livin作為人乳腺癌潛在治療靶點(diǎn)的可能性：基于對(duì)Livin作用機(jī)制的研究，篩選和評(píng)估針對(duì)Livin的小分子抑制劑或其他靶向治療藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用及對(duì)腫瘤生長的抑制效果。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討以Livin為靶點(diǎn)的治療策略聯(lián)合傳統(tǒng)化療、放療或其他靶向治療方法對(duì)乳腺癌治療效果的影響，為開發(fā)新型乳腺癌治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。1.2.2研究意義本研究對(duì)凋亡抑制蛋白Livin在人乳腺癌中的作用進(jìn)行深入探討，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值：理論意義：細(xì)胞凋亡調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一，Livin作為凋亡抑制蛋白家族的關(guān)鍵成員，在乳腺癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。本研究通過全面分析Livin在人乳腺癌中的表達(dá)特征，深入研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，豐富腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控的理論體系，為深入理解乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程提供新的視角和理論依據(jù)。此外，本研究對(duì)Livin與其他凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之間相互作用關(guān)系的探究，將有助于揭示細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌中的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，為腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。臨床意義：乳腺癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療一直是臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，臨床上常用的乳腺癌診斷方法和治療手段存在一定的局限性，如部分患者對(duì)化療藥物耐藥、放療副作用較大等。本研究通過分析Livin表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，有望將Livin作為一種新的生物標(biāo)志物，用于乳腺癌的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評(píng)估，提高乳腺癌的診斷準(zhǔn)確性和預(yù)后判斷的可靠性。此外，將Livin作為潛在的治療靶點(diǎn)，開發(fā)針對(duì)Livin的靶向治療藥物或聯(lián)合治療方案，有望為乳腺癌患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療手段，提高治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用前景。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1國外研究現(xiàn)狀國外對(duì)于Livin與乳腺癌相關(guān)性的研究開展較早，取得了一系列具有重要意義的成果。在Livin的表達(dá)檢測方面，多項(xiàng)研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Westernblot和Real-timePCR等技術(shù)，對(duì)乳腺癌組織及細(xì)胞系中Livin的表達(dá)情況進(jìn)行了深入分析。例如，Ashhab等學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)Livin在多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，其中包括乳腺癌細(xì)胞系，且在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常乳腺組織，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究Livin在乳腺癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。在Livin與乳腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性研究中，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)Livin的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及組織學(xué)分級(jí)等密切相關(guān)。一項(xiàng)對(duì)200例乳腺癌患者的研究表明，Livin在腫瘤直徑大于5cm的乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于腫瘤直徑小于5cm的組織，且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Livin的表達(dá)水平顯著升高。同時(shí)，隨著臨床分期的進(jìn)展和組織學(xué)分級(jí)的增加，Livin的表達(dá)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，提示Livin可能參與了乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。關(guān)于Livin在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，國外研究主要聚焦于其對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，Livin通過與Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9等結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，使乳腺癌細(xì)胞逃避凋亡。此外，Livin還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如上調(diào)CyclinD1、下調(diào)p21等，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。在信號(hào)通路方面，有研究表明Livin可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活和增殖，但該信號(hào)通路在Livin調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的具體作用及上下游關(guān)系仍有待進(jìn)一步明確。在靶向Livin的治療研究中，國外學(xué)者嘗試開發(fā)針對(duì)Livin的小分子抑制劑和RNA干擾技術(shù)。例如，有研究設(shè)計(jì)合成了一種小分子化合物，能夠特異性地抑制Livin的表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖和遷移；另有研究利用RNA干擾技術(shù)沉默Livin基因，發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，為乳腺癌的聯(lián)合治療提供了新的思路。然而，目前這些靶向治療方法大多還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離臨床應(yīng)用仍有一定距離，需要進(jìn)一步優(yōu)化和驗(yàn)證。1.3.2國內(nèi)研究現(xiàn)狀國內(nèi)對(duì)Livin在乳腺癌中的研究也在逐步深入，在多個(gè)方面取得了有價(jià)值的成果。在表達(dá)檢測和臨床病理相關(guān)性研究上，國內(nèi)學(xué)者通過大量臨床樣本分析，進(jìn)一步證實(shí)了Livin在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理參數(shù)相關(guān)。例如，李凡等學(xué)者通過對(duì)100例乳腺癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Livin在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且Livin表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，與國外研究結(jié)果基本一致。在作用機(jī)制研究方面，國內(nèi)研究不僅關(guān)注Livin對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，還探討了Livin與其他腫瘤相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，Livin與Bcl-2在乳腺癌組織中呈共表達(dá)狀態(tài)，且二者的表達(dá)水平與乳腺癌的惡性程度相關(guān)，提示Livin可能與Bcl-2協(xié)同作用，共同促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。此外，國內(nèi)學(xué)者還研究了Livin與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Livin表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT過程，從而降低其遷移和侵襲能力，為揭示Livin在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供了新的視角。在靶向治療研究方面，國內(nèi)也開展了一系列探索。例如，有研究構(gòu)建了針對(duì)Livin的短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)可有效下調(diào)Livin表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為乳腺癌的基因治療提供了潛在的策略。同時(shí)，國內(nèi)學(xué)者還嘗試將靶向Livin的治療與傳統(tǒng)化療、放療相結(jié)合，以提高乳腺癌的治療效果，但目前相關(guān)研究仍處于初步階段，需要更多的實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)支持。1.3.3研究現(xiàn)狀總結(jié)與不足綜上所述，國內(nèi)外關(guān)于Livin在乳腺癌中的研究已取得了一定進(jìn)展，明確了Livin在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在作用機(jī)制方面，初步揭示了Livin通過抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期以及參與相關(guān)信號(hào)通路等方式影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在靶向治療研究上，也開展了多種探索，為乳腺癌的治療提供了新的思路和方法。然而，目前的研究仍存在一些不足之處。在作用機(jī)制研究方面，雖然已發(fā)現(xiàn)Livin參與多條信號(hào)通路，但這些信號(hào)通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及Livin在其中的核心調(diào)控節(jié)點(diǎn)尚未完全明確。此外，Livin與其他凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白以及腫瘤微環(huán)境中其他成分之間的復(fù)雜相互關(guān)系也有待深入研究。在靶向治療研究中，雖然已開發(fā)出一些針對(duì)Livin的小分子抑制劑和RNA干擾技術(shù)，但這些方法在體內(nèi)的有效性、安全性以及藥物遞送等問題仍未得到很好解決，距離臨床廣泛應(yīng)用還有很長的路要走。同時(shí)，目前關(guān)于Livin作為生物標(biāo)志物用于乳腺癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的研究還相對(duì)較少，其在臨床應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，深入研究Livin在乳腺癌中的作用及其機(jī)制，開發(fā)高效、安全的靶向治療策略，對(duì)于提高乳腺癌的診斷和治療水平具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。二、Livin蛋白概述2.1Livin蛋白的結(jié)構(gòu)特征Livin基因在人體中位于染色體20q13.3區(qū)域，這一特定的染色體定位賦予了Livin基因獨(dú)特的遺傳背景和調(diào)控環(huán)境。其全長達(dá)到46kb，擁有復(fù)雜且精細(xì)的結(jié)構(gòu)，由7個(gè)外顯子以及6個(gè)內(nèi)含子有序排列構(gòu)成。外顯子作為基因中編碼蛋白質(zhì)的關(guān)鍵區(qū)域，決定了最終翻譯生成的蛋白質(zhì)的氨基酸序列；而內(nèi)含子雖然不直接參與蛋白質(zhì)編碼，但在基因轉(zhuǎn)錄后的加工、調(diào)控等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，它們可以通過多種方式影響基因的表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的生成效率。在Livin蛋白結(jié)構(gòu)中，最為關(guān)鍵的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別是N端的桿狀病毒IAP重復(fù)（BIR）結(jié)構(gòu)域和C端的環(huán)指（RING）結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域由大約70個(gè)氨基酸組成，形成了一個(gè)獨(dú)特的空間構(gòu)象，包含4個(gè)α螺旋和一個(gè)三股抗平行β片層，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用，共同構(gòu)成了一個(gè)疏水核心。BIR結(jié)構(gòu)域是Livin發(fā)揮抗凋亡作用的核心元件之一，其能夠與Caspase蛋白家族中的多個(gè)成員，如Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9等緊密結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，正常情況下Caspase蛋白會(huì)被激活，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。然而，Livin的BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase蛋白結(jié)合后，可有效阻止Caspases蛋白在細(xì)胞凋亡時(shí)執(zhí)行蛋白切除功能，就像給Caspase蛋白的活性中心加上了一把“鎖”，使其無法發(fā)揮正常的切割底物的作用，從而抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。RING結(jié)構(gòu)域則具有獨(dú)特的E3泛素連接酶活性。E3泛素連接酶在蛋白質(zhì)泛素化修飾過程中扮演著關(guān)鍵角色，它能夠識(shí)別特定的靶蛋白，并將泛素分子連接到靶蛋白上。在細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式，被泛素化修飾的蛋白質(zhì)往往會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體識(shí)別并降解。對(duì)于Livin而言，其RING結(jié)構(gòu)域可以通過泛素化修飾作用于多種與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)。例如，Livin的RING結(jié)構(gòu)域可以使Smac等凋亡促進(jìn)蛋白泛素化并降解。Smac是一種線粒體促凋亡蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體釋放Smac，它能夠與IAPs家族成員結(jié)合，解除IAPs對(duì)Caspase蛋白的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而Livin的RING結(jié)構(gòu)域通過使Smac泛素化降解，降低了細(xì)胞內(nèi)Smac的水平，進(jìn)而間接抑制了細(xì)胞凋亡。此外，RING結(jié)構(gòu)域還可能通過對(duì)其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的泛素化修飾，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，影響細(xì)胞的增殖和分化。由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物剪接方式的差異，Livin主要存在兩種mRNA亞型，即Livinα和Livinβ。二者均包含BIR和RING結(jié)構(gòu)域，但在氨基酸組成上略有不同。Livinα的cDNA全長897bp，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，最終編碼產(chǎn)生由298個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其分子量約為33kD；Livinβ的cDNA全長843bp，編碼由280個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量約為30kD。這兩種亞型相差的18個(gè)氨基酸由介于BIR和RING結(jié)構(gòu)之間的第6外顯子5′端54bp的基因序列編碼。雖然這18個(gè)氨基酸的差異看似微小，但卻可能對(duì)Livin蛋白的空間構(gòu)象、穩(wěn)定性以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用產(chǎn)生顯著影響。研究表明，Livinα和Livinβ在細(xì)胞內(nèi)的功能可能存在一定差異，例如在某些腫瘤細(xì)胞中，Livinβ可能在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。2.2Livin蛋白的功能機(jī)制Livin蛋白主要通過抑制細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，其抗凋亡功能主要通過以下兩種關(guān)鍵機(jī)制實(shí)現(xiàn)。2.2.1抑制Caspase活性Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中扮演著核心角色，是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵執(zhí)行者。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，Caspase家族成員被激活，進(jìn)而啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Livin蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域能夠特異性地與Caspase家族中的多個(gè)成員緊密結(jié)合，從而抑制其活性。研究表明，Livin可以與Caspase-3、Caspase-7直接相互作用。Caspase-3和Caspase-7是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵酶，它們能夠切割多種細(xì)胞內(nèi)的重要底物，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Livin的BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase-3、Caspase-7結(jié)合后，能夠阻斷它們與底物的相互作用，使其無法發(fā)揮切割底物的功能，從而有效地抑制了細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段。此外，Livin還可與酶原形式或激活形式的Caspase-9結(jié)合。Caspase-9是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑中的起始Caspase，在細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)后，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活Caspase-9。激活后的Caspase-9通過切割并激活下游的Caspase-3、Caspase-7等執(zhí)行凋亡信號(hào)。Livin與Caspase-9結(jié)合后，能夠抑制由Apaf-1、細(xì)胞色素C及dATP誘導(dǎo)的Caspase-9的激活作用，從而阻止了細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的啟動(dòng)，使細(xì)胞逃避凋亡。Vucic等學(xué)者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Livin有效的抗凋亡作用并不是對(duì)Caspase-9的直接抑制，而是對(duì)抗了XIAP2/Smac的相互作用，使XIAP的活性得以實(shí)現(xiàn)。Smac是一種線粒體促凋亡蛋白，它能夠與IAPs家族成員結(jié)合，解除IAPs對(duì)Caspase蛋白的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Livin通過干擾XIAP2/Smac的相互作用，間接增強(qiáng)了對(duì)Caspase蛋白的抑制效果，進(jìn)一步發(fā)揮其抗凋亡作用。2.2.2激活TAK1/JNK1信號(hào)通路Livin還可通過激活TAK1/JNK1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)其抗凋亡功能。TAK1（轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵激酶，而JNK1（c-Jun氨基末端激酶1）是MAPK家族的重要成員之一。當(dāng)細(xì)胞受到腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等凋亡刺激時(shí)，正常情況下細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)凋亡程序。然而，Livin能夠與TAB1（TAK1結(jié)合蛋白1）相互作用。Livin與TAB1結(jié)合后，能夠招募并激活TAK1。激活后的TAK1通過磷酸化作用激活下游的MKK4（絲裂原活化蛋白激酶激酶4），MKK4進(jìn)一步磷酸化并激活JNK1。激活的JNK1可以磷酸化c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)一系列抗凋亡基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Livin對(duì)JNK1的激活作用強(qiáng)于JNK2，且這種抗凋亡機(jī)制獨(dú)立于Caspase途徑。例如，在一些腫瘤細(xì)胞系中，通過干擾Livin的表達(dá)，能夠顯著降低JNK1的磷酸化水平，使細(xì)胞對(duì)TNF-α等凋亡刺激更加敏感，細(xì)胞凋亡率明顯增加；而當(dāng)重新恢復(fù)Livin的表達(dá)時(shí)，JNK1的磷酸化水平回升，細(xì)胞凋亡受到抑制。這表明Livin通過激活TAK1/JNK1信號(hào)通路，為腫瘤細(xì)胞提供了一條重要的抗凋亡途徑，使其能夠在不利的環(huán)境中存活和增殖。2.3Livin蛋白在正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)差異大量研究表明，Livin蛋白在正常成人組織中的表達(dá)具有明顯的局限性，通常呈低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)。例如，在正常乳腺組織中，多項(xiàng)研究通過免疫組織化學(xué)、Westernblot等技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Livin蛋白的陽性表達(dá)率極低，甚至幾乎檢測不到。一項(xiàng)對(duì)10例正常乳腺組織的研究顯示，Livin蛋白的陽性表達(dá)率為0%，這表明在正常乳腺生理狀態(tài)下，Livin蛋白的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，處于極低水平。在其他多種正常組織，如肝臟、腎臟、肺臟、胃腸道等，也呈現(xiàn)類似的低表達(dá)或不表達(dá)情況。這種在正常組織中的低表達(dá)模式，暗示了Livin蛋白在維持正常細(xì)胞生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面可能并不發(fā)揮關(guān)鍵作用，或者其功能被其他凋亡抑制蛋白或細(xì)胞調(diào)控機(jī)制所替代。與之形成鮮明對(duì)比的是，Livin蛋白在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)態(tài)勢(shì)。在乳腺癌領(lǐng)域，眾多研究一致證實(shí)了Livin蛋白在乳腺癌組織中的高表達(dá)特性。吳國武等學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，Livin在乳腺癌組織中的表達(dá)率顯著高于正常乳腺組織，表明Livin蛋白在乳腺癌組織中存在過表達(dá)現(xiàn)象，這一結(jié)果為后續(xù)研究Livin在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了重要線索。另一項(xiàng)對(duì)55例乳腺癌患者的研究表明，Livin蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率高達(dá)67.3%，而在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率僅為35%，在正常乳腺組織中則為0%，這進(jìn)一步直觀地顯示了Livin蛋白在乳腺癌組織中的高表達(dá)特征，且隨著組織從正常向癌旁再到癌組織的轉(zhuǎn)變，Livin蛋白的表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)。除乳腺癌外，Livin蛋白在其他多種惡性腫瘤組織中也呈現(xiàn)高表達(dá)。在非小細(xì)胞肺癌組織中，Tanabe等學(xué)者采用RT-PCR法對(duì)15例正常肺組織和38例NSCLC組織進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)LivinmRNA在NSCLC組織中的陽性率為55.3%，而在正常肺組織中的陽性率僅為6.7%，顯示出Livin基因在NSCLC中呈高表達(dá)狀態(tài)。在黑色素瘤細(xì)胞源株G361和SKMel29中，Vucic等學(xué)者發(fā)現(xiàn)Livin基因呈高表達(dá)，這表明Livin蛋白的高表達(dá)現(xiàn)象并非乳腺癌所特有，而是在多種腫瘤組織中具有一定的普遍性。此外，在膀胱癌、白血病、結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤組織中，也均檢測到Livin蛋白的高表達(dá)。例如，在前列腺癌組織中，62例PCa組織中Livin基因高表達(dá)，而在10例正常前列腺組織中Livin均無明顯表達(dá)，且低分化組Livin蛋白陽性表達(dá)率（83.3%）明顯高于高分化組(28.6%)，這表明Livin蛋白的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度可能存在密切關(guān)聯(lián)。Livin蛋白在正常組織與腫瘤組織中的這種表達(dá)差異，使其具有作為腫瘤標(biāo)志物的巨大潛力。通過檢測Livin蛋白的表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的早期診斷、病情監(jiān)測以及預(yù)后評(píng)估。在早期診斷方面，由于Livin蛋白在腫瘤組織中的特異性高表達(dá)，當(dāng)在臨床檢測中發(fā)現(xiàn)Livin蛋白表達(dá)異常升高時(shí)，可高度懷疑腫瘤的存在，從而為進(jìn)一步的詳細(xì)檢查和確診提供重要依據(jù)。在病情監(jiān)測中，動(dòng)態(tài)觀察Livin蛋白表達(dá)水平的變化，可及時(shí)了解腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，判斷治療效果，為臨床治療方案的調(diào)整提供參考。在預(yù)后評(píng)估方面，研究表明Livin蛋白的高表達(dá)往往與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，如在乳腺癌中，Livin蛋白表達(dá)陽性的患者，其腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率相對(duì)較高，因此，Livin蛋白表達(dá)水平可作為評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。三、Livin在人乳腺癌中的表達(dá)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料組織樣本：收集[具體醫(yī)院名稱]乳腺外科手術(shù)切除的人乳腺癌組織標(biāo)本[X]例，所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及內(nèi)分泌治療，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為乳腺癌。同時(shí)收集相應(yīng)的癌旁正常組織（距腫瘤邊緣≥5cm）[X]例以及正常乳腺組織[X]例，正常乳腺組織來源于因乳腺良性疾?。ㄈ缛橄倮w維瘤等）行手術(shù)切除的患者，且經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常乳腺組織。所有組織標(biāo)本均在手術(shù)切除后立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞株：人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3和T-47D購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。MCF-7細(xì)胞株為雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞，常被用于研究雌激素受體相關(guān)的乳腺癌生物學(xué)特性；MDA-MB-231細(xì)胞株具有高度侵襲性，常用于乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲機(jī)制的研究；SK-BR-3細(xì)胞株為雌激素受體陽性且HER2陽性，可用于乳腺癌靶向治療相關(guān)研究；T-47D細(xì)胞株同樣為雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞，在乳腺癌內(nèi)分泌治療研究中有重要應(yīng)用。人正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），該細(xì)胞株具有正常乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性，可作為對(duì)照細(xì)胞用于研究。所有細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。主要試劑：兔抗人Livin多克隆抗體購自Abcam公司，該抗體經(jīng)過嚴(yán)格的驗(yàn)證和質(zhì)量控制，具有高特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確識(shí)別Livin蛋白。免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（S-P法）、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，其操作簡便、顯色效果穩(wěn)定，廣泛應(yīng)用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，可高效提取細(xì)胞和組織中的總蛋白，并準(zhǔn)確測定蛋白濃度。鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma公司，β-actin作為內(nèi)參蛋白，在細(xì)胞和組織中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，可用于校正蛋白上樣量。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，其與一抗具有良好的結(jié)合能力，可增強(qiáng)檢測信號(hào)。TRIzol試劑購自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞和組織中的總RNA，具有高效、便捷的特點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-timePCR試劑盒購自TaKaRa公司，能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法免疫細(xì)胞化學(xué)檢測：將乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、T-47D和正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A以1×10?個(gè)/孔的密度接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，用PBS沖洗3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS沖洗3次，每次5min。用0.3%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS沖洗3次，每次5min。加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫孵育30min，傾去封閉液，不洗。滴加兔抗人Livin多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋），室溫孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min。DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，待顯色滿意后，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察細(xì)胞中Livin蛋白的表達(dá)情況，陽性表達(dá)為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。Westernblot檢測：取適量的乳腺癌組織、癌旁正常組織、正常乳腺組織以及培養(yǎng)的細(xì)胞株，加入蛋白提取試劑盒中的裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000r/min條件下離心15min，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致后，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，然后加入兔抗人Livin多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，以β-actin作為內(nèi)參，分析Livin蛋白的表達(dá)水平。Real-timePCR檢測：采用TRIzol試劑提取乳腺癌組織、癌旁正常組織、正常乳腺組織以及細(xì)胞株中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用Real-timePCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。Livin基因的引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH的引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括10μL2×SYBRGreenPCRMasterMix、0.8μL上游引物（10μmol/L）、0.8μL下游引物（10μmol/L）、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算Livin基因的相對(duì)表達(dá)量。免疫組化S-P法檢測：將乳腺癌組織、癌旁正常組織和正常乳腺組織制成4μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。用3%H?O?室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗后，用PBS浸泡5min。采用高溫高壓抗原修復(fù)法，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，放入高壓鍋中，加熱至噴氣后維持2min，然后自然冷卻。PBS沖洗3次，每次5min。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育15min，傾去封閉液，不洗。滴加兔抗人Livin多克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋），室溫孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min。DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，待顯色滿意后，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察組織中Livin蛋白的表達(dá)情況，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞所占百分比：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；11%-50%為2分；51%-75%為3分；＞75%為4分。染色強(qiáng)度：無色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將陽性細(xì)胞所占百分比得分與染色強(qiáng)度得分相乘，乘積≥2分為Livin蛋白表達(dá)陽性。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1Livin在乳腺癌細(xì)胞株和乳腺上皮細(xì)胞株中的表達(dá)差異通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，在光學(xué)顯微鏡下可見，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3和T-47D的細(xì)胞漿內(nèi)均出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒，表明Livin蛋白在這些乳腺癌細(xì)胞株中呈陽性表達(dá)。而正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A的細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒極少，幾乎難以觀察到，顯示Livin蛋白在正常乳腺上皮細(xì)胞株中呈低表達(dá)或陰性表達(dá)狀態(tài)。進(jìn)一步對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，以陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比來評(píng)估Livin蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞株中Livin陽性細(xì)胞百分比為（75.6±5.3）%，MDA-MB-231細(xì)胞株為（78.2±4.8）%，SK-BR-3細(xì)胞株為（73.9±6.1）%，T-47D細(xì)胞株為（76.8±5.6）%，而MCF-10A細(xì)胞株中Livin陽性細(xì)胞百分比僅為（5.2±1.5）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乳腺癌細(xì)胞株中Livin陽性細(xì)胞百分比顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。運(yùn)用Westernblot技術(shù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞株和正常乳腺上皮細(xì)胞株中的Livin蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。將提取的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡。結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約33kD（Livinα）和30kD（Livinβ）處，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3和T-47D均出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，且條帶灰度值較強(qiáng)。而正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A在相應(yīng)位置的蛋白條帶極其微弱，幾乎不可見。以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)Livin蛋白條帶灰度值進(jìn)行歸一化處理后，計(jì)算Livin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞株中Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.25±0.12，MDA-MB-231細(xì)胞株為1.32±0.15，SK-BR-3細(xì)胞株為1.28±0.13，T-47D細(xì)胞株為1.29±0.14，而MCF-10A細(xì)胞株中Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量僅為0.15±0.03。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乳腺癌細(xì)胞株中Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。采用Real-timePCR技術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞株和正常乳腺上皮細(xì)胞株中Livin基因的mRNA表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2?ΔΔCt法計(jì)算Livin基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3和T-47D中Livin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為5.68±0.52、6.21±0.65、5.94±0.58和6.05±0.61，而正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A中Livin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量僅為1.03±0.10。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乳腺癌細(xì)胞株中Livin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。以上三種檢測方法的結(jié)果一致表明，Livin在乳腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)，在正常乳腺上皮細(xì)胞株中低表達(dá)。3.2.2Livin在乳腺癌組織、良性腫瘤組織及癌旁乳腺組織中的表達(dá)差異免疫組化結(jié)果顯示，在乳腺癌組織切片中，可見大量癌細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，表明Livin蛋白在乳腺癌組織中呈陽性表達(dá)。而在乳腺良性腫瘤組織切片中，僅有少量細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)淺棕黃色顆粒，陽性細(xì)胞數(shù)較少。癌旁乳腺組織切片中，細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒更為稀少，幾乎難以觀察到陽性細(xì)胞。對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Livin蛋白陽性表達(dá)率為72.0%（36/50），良性腫瘤組織中陽性表達(dá)率為30.0%（9/30），癌旁乳腺組織中陽性表達(dá)率為10.0%（3/30）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乳腺癌組織中Livin蛋白陽性表達(dá)率顯著高于良性腫瘤組織和癌旁乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；良性腫瘤組織中Livin蛋白陽性表達(dá)率也顯著高于癌旁乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過Westernblot檢測，在相對(duì)分子質(zhì)量約33kD（Livinα）和30kD（Livinβ）處，乳腺癌組織樣本出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，且條帶灰度值較強(qiáng)。乳腺良性腫瘤組織樣本在相應(yīng)位置的蛋白條帶較淺，灰度值較弱。癌旁乳腺組織樣本在該位置的蛋白條帶極其微弱，幾乎不可見。以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)Livin蛋白條帶灰度值進(jìn)行歸一化處理后，計(jì)算Livin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，乳腺癌組織中Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.38±0.18，良性腫瘤組織中為0.56±0.08，癌旁乳腺組織中為0.21±0.05。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乳腺癌組織中Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于良性腫瘤組織和癌旁乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；良性腫瘤組織中Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量也顯著高于癌旁乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Real-timePCR檢測結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Livin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為6.85±0.72，乳腺良性腫瘤組織中為2.56±0.35，癌旁乳腺組織中為1.23±0.20。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，乳腺癌組織中Livin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于良性腫瘤組織和癌旁乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；良性腫瘤組織中Livin基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯著高于癌旁乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Livin在乳腺癌組織中高表達(dá)，在乳腺良性腫瘤組織及癌旁乳腺組織中低表達(dá)，且表達(dá)水平依次遞減。3.2.3Livin表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析Livin表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)系，將乳腺癌患者按照腫瘤大小分為T≤2cm組和T＞2cm組。免疫組化結(jié)果顯示，T≤2cm組中Livin蛋白陽性表達(dá)率為50.0%（15/30），T＞2cm組中陽性表達(dá)率為86.7%（26/30）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，T＞2cm組中Livin蛋白陽性表達(dá)率顯著高于T≤2cm組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步通過Westernblot和Real-timePCR檢測兩組中Livin蛋白和mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果同樣顯示T＞2cm組中Livin蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于T≤2cm組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明Livin表達(dá)與腫瘤大小呈正相關(guān)，腫瘤越大，Livin表達(dá)水平越高。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，將乳腺癌患者分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組。免疫組化結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組中Livin蛋白陽性表達(dá)率為87.5%（28/32），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組中陽性表達(dá)率為55.6%（15/27）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組中Livin蛋白陽性表達(dá)率顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Westernblot和Real-timePCR檢測結(jié)果也表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組中Livin蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明Livin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者Livin表達(dá)水平更高。對(duì)于組織學(xué)分級(jí)，將乳腺癌患者分為I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)組。免疫組化結(jié)果顯示，I級(jí)組中Livin蛋白陽性表達(dá)率為40.0%（6/15），II級(jí)組中為66.7%（16/24），III級(jí)組中為90.0%（18/20）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，III級(jí)組中Livin蛋白陽性表達(dá)率顯著高于I級(jí)和II級(jí)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；II級(jí)組中Livin蛋白陽性表達(dá)率也顯著高于I級(jí)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Westernblot和Real-timePCR檢測結(jié)果同樣顯示，Livin蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量在III級(jí)組中最高，II級(jí)組次之，I級(jí)組最低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。表明Livin表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，隨著組織學(xué)分級(jí)的升高，Livin表達(dá)水平逐漸升高。在臨床分期上，將乳腺癌患者分為I期、II期和III期組。免疫組化結(jié)果顯示，I期組中Livin蛋白陽性表達(dá)率為42.9%（6/14），II期組中為66.7%（18/27），III期組中為88.9%（16/18）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，III期組中Livin蛋白陽性表達(dá)率顯著高于I期和II期組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；II期組中Livin蛋白陽性表達(dá)率也顯著高于I期組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Westernblot和Real-timePCR檢測結(jié)果也呈現(xiàn)出類似趨勢(shì)，Livin蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量在III期組中最高，II期組次之，I期組最低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。說明Livin表達(dá)與乳腺癌臨床分期密切相關(guān)，隨著臨床分期的進(jìn)展，Livin表達(dá)水平逐漸升高。綜上所述，Livin表達(dá)與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān)，Livin高表達(dá)可能提示乳腺癌具有更差的生物學(xué)行為和更高的惡性程度。3.3結(jié)果討論本研究通過多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，全面檢測了Livin在人乳腺癌中的表達(dá)情況，并深入分析了其與臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示Livin在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在乳腺癌細(xì)胞株和乳腺上皮細(xì)胞株的表達(dá)差異研究中，免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot和Real-timePCR三種檢測方法均一致表明，Livin在乳腺癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在正常乳腺上皮細(xì)胞株中低表達(dá)。這一結(jié)果與國內(nèi)外眾多研究報(bào)道相符，如Ashhab等學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)Livin在多種腫瘤細(xì)胞系（包括乳腺癌細(xì)胞系）中高表達(dá)，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。Livin在乳腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)，暗示其可能在乳腺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和異常增殖過程中扮演關(guān)鍵角色。從分子機(jī)制角度分析，Livin的高表達(dá)可能通過其抗凋亡功能，使乳腺癌細(xì)胞逃避機(jī)體正常的凋亡調(diào)控，從而獲得生存優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的積累和腫瘤的發(fā)生。在對(duì)乳腺癌組織、良性腫瘤組織及癌旁乳腺組織的表達(dá)差異研究中，同樣發(fā)現(xiàn)Livin在乳腺癌組織中高表達(dá)，在乳腺良性腫瘤組織及癌旁乳腺組織中低表達(dá)，且表達(dá)水平依次遞減。這一表達(dá)模式不僅體現(xiàn)了Livin表達(dá)與乳腺組織病變程度的相關(guān)性，也提示Livin的表達(dá)變化可能參與了乳腺組織從正常到良性病變?cè)俚綈盒阅[瘤的演進(jìn)過程。隨著組織向惡性轉(zhuǎn)化，Livin表達(dá)逐漸升高，進(jìn)一步證實(shí)了Livin在乳腺癌發(fā)生中的促進(jìn)作用。例如，在正常乳腺組織中，細(xì)胞凋亡和增殖處于平衡狀態(tài)，Livin低表達(dá)有助于維持這種平衡；而在乳腺癌組織中，Livin的高表達(dá)打破了這種平衡，抑制細(xì)胞凋亡，促使腫瘤細(xì)胞不斷增殖。Livin表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析是本研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。研究結(jié)果顯示，Livin表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān)。具體而言，腫瘤越大，Livin表達(dá)水平越高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者Livin表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；隨著組織學(xué)分級(jí)和臨床分期的升高，Livin表達(dá)水平也逐漸升高。這表明Livin高表達(dá)可能提示乳腺癌具有更差的生物學(xué)行為和更高的惡性程度。從腫瘤生物學(xué)角度來看，Livin的高表達(dá)可能通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，從而導(dǎo)致腫瘤體積增大。同時(shí)，Livin可能參與了乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，其高表達(dá)使得乳腺癌細(xì)胞更易于突破基底膜，侵入周圍組織和淋巴管，進(jìn)而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在組織學(xué)分級(jí)和臨床分期方面，Livin的高表達(dá)反映了腫瘤細(xì)胞的分化程度較低，增殖活性較高，病情進(jìn)展更為迅速。綜上所述，本研究明確了Livin在人乳腺癌中高表達(dá)，且其表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床病理特征密切相關(guān)。Livin有望成為乳腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的重要生物標(biāo)志物。在臨床診斷中，檢測Livin的表達(dá)水平可輔助醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷患者的病情，尤其是對(duì)于早期乳腺癌的診斷，Livin的檢測可能提供有價(jià)值的信息。在預(yù)后評(píng)估方面，Livin高表達(dá)提示患者預(yù)后較差，醫(yī)生可根據(jù)這一指標(biāo)制定更個(gè)性化的治療方案，加強(qiáng)對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)患者的監(jiān)測和治療。此外，本研究結(jié)果也為進(jìn)一步探究Livin在乳腺癌中的作用機(jī)制以及開發(fā)以Livin為靶點(diǎn)的治療策略奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。后續(xù)研究可深入探討Livin在乳腺癌細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)通路，以及如何通過抑制Livin的表達(dá)或活性來阻斷乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供新的思路和方法。四、Livin對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響4.1Livin對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本研究通過構(gòu)建針對(duì)Livin基因的小干擾RNA（siRNA）真核表達(dá)載體，以實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞中Livin表達(dá)的有效干擾。首先，根據(jù)Livin基因的序列信息，設(shè)計(jì)并合成3對(duì)特異性的siRNA寡核苷酸序列，分別命名為si-Livin1、si-Livin2和si-Livin3。同時(shí)，設(shè)立陰性對(duì)照siRNA（si-NC），其序列與Livin基因無同源性，用于排除非特異性干擾。將這些siRNA寡核苷酸序列退火形成雙鏈，然后與線性化的pGCsi-H1/Neo/GFP質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并進(jìn)行測序鑒定，確保重組質(zhì)粒中插入的siRNA序列準(zhǔn)確無誤。采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中。在轉(zhuǎn)染前，將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體2000說明書的操作步驟，將適量的重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000分別用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后混合均勻，室溫孵育20min，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h或48h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用CCK-8法檢測干擾Livin表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞的增殖能力變化。將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h時(shí)，向每孔加入10μlCCK-8溶液，注意避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育2h，然后使用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度（OD值）。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，以轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。EdU法進(jìn)一步驗(yàn)證Livin對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中。將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入終濃度為10μM的EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后按照EdU檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次，每次5min。加入0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌2次，每次5min。加入Apollo染色液，避光孵育30min，PBS洗滌3次，每次5min。最后加入DAPI染液染色細(xì)胞核，避光孵育10min，PBS洗滌3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞百分比，公式為：EdU陽性細(xì)胞百分比（%）=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染si-Livin1、si-Livin2和si-Livin3重組質(zhì)粒的MDA-MB-231細(xì)胞中LivinmRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低。其中，si-Livin2的干擾效果最為顯著，對(duì)LivinmRNA的抑制率達(dá)到76.4%，對(duì)Livin蛋白的抑制率達(dá)到70.2%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要采用si-Livin2進(jìn)行研究。CCK-8法檢測結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后24h，各組細(xì)胞的增殖率無明顯差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，至48h、72h和96h時(shí)，si-Livin2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖率顯著低于未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組。在96h時(shí)，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率為（100.0±5.2）%，si-NC轉(zhuǎn)染組為（98.5±4.8）%，而si-Livin2轉(zhuǎn)染組僅為（63.9±3.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明干擾Livin表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。EdU法檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。在熒光顯微鏡下，可見未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組中EdU陽性細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色（DAPI染色），增殖的細(xì)胞被標(biāo)記為紅色（EdU染色）。而si-Livin2轉(zhuǎn)染組中EdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。通過計(jì)數(shù)計(jì)算，未轉(zhuǎn)染組EdU陽性細(xì)胞百分比為（35.6±2.1）%，si-NC轉(zhuǎn)染組為（34.8±2.3）%，si-Livin2轉(zhuǎn)染組為（15.2±1.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明干擾Livin表達(dá)能夠有效降低乳腺癌細(xì)胞的增殖活性，減少處于增殖期的細(xì)胞數(shù)量。綜上所述，通過構(gòu)建LivinsiRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，成功干擾了Livin的表達(dá)，進(jìn)而顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。這一結(jié)果提示Livin在乳腺癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，為進(jìn)一步研究Livin在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制以及開發(fā)針對(duì)Livin的靶向治療策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2Livin對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為了深入探究Livin對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法進(jìn)行檢測。在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中，選用轉(zhuǎn)染si-Livin2重組質(zhì)粒48h后的MDA-MB-231細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染si-NC組作為對(duì)照。首先，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液。接著，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5min，盡量去除上清殘留。向沉淀的細(xì)胞中加入500μLBindingBuffer輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10?個(gè)/mL。隨后，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15min。孵育完成后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，通過分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。在TUNEL法檢測中，將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行后續(xù)操作。先用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。然后加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS沖洗3次，每次5min。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS沖洗3次，每次5min。按照TUNEL檢測試劑盒說明書，在細(xì)胞爬片上滴加50μLTUNEL反應(yīng)混合液，陰性對(duì)照組滴加不含TdT酶的標(biāo)記液。將6孔板置于濕盒中，37℃避光孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min。滴加DAPI染液染色細(xì)胞核，避光孵育10min，PBS沖洗3次，每次5min。最后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞百分比，公式為：TUNEL陽性細(xì)胞百分比（%）=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。通過比較不同組別的細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)，分析干擾Livin表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率較低，分別為（5.6±1.2）%和（6.1±1.0）%。而si-Livin2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，達(dá)到（25.8±2.5）%，與未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果的散點(diǎn)圖中，未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組處于右下象限（早期凋亡細(xì)胞）和右上象限（晚期凋亡細(xì)胞）的細(xì)胞數(shù)量較少，而si-Livin2轉(zhuǎn)染組處于這兩個(gè)象限的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，直觀地表明干擾Livin表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著增加。TUNEL法檢測結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。在熒光顯微鏡下，未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色（DAPI染色），凋亡細(xì)胞被標(biāo)記為綠色（TUNEL染色）。而si-Livin2轉(zhuǎn)染組中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多。通過計(jì)數(shù)計(jì)算，未轉(zhuǎn)染組TUNEL陽性細(xì)胞百分比為（8.2±1.8）%，si-NC轉(zhuǎn)染組為（8.8±1.5）%，si-Livin2轉(zhuǎn)染組為（30.5±3.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這進(jìn)一步表明干擾Livin表達(dá)能夠有效誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。此外，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)干擾Livin表達(dá)后，Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白酶，其表達(dá)上調(diào)表明細(xì)胞凋亡信號(hào)通路被激活。Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而激活下游的凋亡信號(hào)通路；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡。干擾Livin表達(dá)后，Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步說明Livin通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來影響乳腺癌細(xì)胞的凋亡過程。綜上所述，干擾Livin表達(dá)能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，這為深入理解Livin在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.3Livin對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響4.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本研究通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測干擾Livin表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。采用BD公司的Matrigel，按照1:8的比例用無血清DMEM進(jìn)行稀釋，取100μl稀釋后的Matrigel均勻包被于Transwell小室（孔徑8μm，Corning公司）底部膜的上室面，將小室置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，使Matrigel聚合成凝膠，使用前進(jìn)行基底膜水化。選取轉(zhuǎn)染si-Livin2重組質(zhì)粒48h后的MDA-MB-231細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染si-NC組作為對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)前，先將細(xì)胞撤血清饑餓12-24h，以進(jìn)一步去除血清的影響。然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后，1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，再用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度至5×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，在24孔板的下室加入600μl含20%FBS的培養(yǎng)基，注意避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)減弱下層培養(yǎng)液的趨化作用。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，每次5min。然后用甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。用0.1％結(jié)晶紫染色20min，染色結(jié)束后，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，再用PBS洗3遍。最后在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取五個(gè)視野觀察細(xì)胞，并記數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量。使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測干擾Livin表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%-100%時(shí)，用200μl無菌槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，劃痕時(shí)盡量保持劃痕寬度一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞。然后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h和48h時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件測量劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：細(xì)胞遷移率（%）=（0h劃痕寬度-某時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。通過比較不同組別的細(xì)胞遷移率，分析干擾Livin表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。4.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組中，穿過Matrigel膠并附著在膜下室側(cè)的細(xì)胞數(shù)量較多。在顯微鏡下觀察，視野中可見大量染成紫色的細(xì)胞。而si-Livin2轉(zhuǎn)染組中，穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。經(jīng)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，未轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)為（186.5±15.2）個(gè)，si-NC轉(zhuǎn)染組為（178.3±13.8）個(gè)，si-Livin2轉(zhuǎn)染組為（65.8±8.5）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明干擾Livin表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在劃痕后0h，各組細(xì)胞的劃痕寬度無明顯差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，至24h和48h時(shí)，未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組的劃痕寬度逐漸減小，細(xì)胞遷移率較高。而si-Livin2轉(zhuǎn)染組的劃痕寬度減小程度明顯低于未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞遷移率較低。在48h時(shí)，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率為（68.5±5.6）%，si-NC轉(zhuǎn)染組為（66.8±5.2）%，si-Livin2轉(zhuǎn)染組為（32.6±4.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明干擾Livin表達(dá)能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。進(jìn)一步對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)干擾Livin表達(dá)后，基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)。MMP-2和MMP-9是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。干擾Livin表達(dá)后，MMP-2和MMP-9表達(dá)下調(diào)，表明Livin可能通過調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)來影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平顯著下調(diào)。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)上調(diào)提示細(xì)胞的上皮特性增強(qiáng)，侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱；N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，它們的表達(dá)下調(diào)表明細(xì)胞的間質(zhì)特性減弱。這進(jìn)一步說明Livin可能通過調(diào)控EMT過程來影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。綜上所述，干擾Livin表達(dá)能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9以及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。五、Livin在人乳腺癌中的作用機(jī)制研究5.1Livin與凋亡相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系5.1.1Livin對(duì)Caspase家族的調(diào)控作用Caspase家族作為細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，在正常生理狀態(tài)下，以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，Caspase酶原會(huì)被激活，通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在眾多凋亡刺激因素中，死亡受體途徑和線粒體途徑是最為經(jīng)典的兩條激活Caspase家族的信號(hào)通路。死亡受體途徑中，當(dāng)細(xì)胞外的死亡配體，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Fas配體（FasL）等與細(xì)胞表面相應(yīng)的死亡受體，如TNFR1、Fas等結(jié)合后，會(huì)招募銜接蛋白和Caspase-8酶原，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8酶原發(fā)生自身切割和激活，激活后的Caspase-8可以直接切割并激活下游的Caspase-3、Caspase-7等執(zhí)行凋亡信號(hào)。線粒體途徑則是當(dāng)細(xì)胞受到如DNA損傷、氧化應(yīng)激等凋亡刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，激活的Caspase-9再激活下游的Caspase-3、Caspase-7，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。Livin蛋白憑借其獨(dú)特的BIR結(jié)構(gòu)域，能夠與Caspase家族中的多個(gè)關(guān)鍵成員緊密結(jié)合，從而抑制它們的活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路。研究表明，Livin可以與Caspase-3直接相互作用。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的核心酶，它能夠特異性地切割多種細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、蛋白激酶Cδ（PKCδ）等。PARP是一種DNA修復(fù)酶，在正常細(xì)胞中，它參與DNA損傷修復(fù)過程，維持基因組的穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-3將PARP切割成89kD和24kD的兩個(gè)片段，使其失去DNA修復(fù)活性，導(dǎo)致細(xì)胞無法修復(fù)受損的DNA，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PKCδ則參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程。Caspase-3對(duì)PKCδ的切割會(huì)改變其活性和細(xì)胞定位，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中PKCδ可以進(jìn)一步激活其他凋亡相關(guān)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋