細胞培養(yǎng)概述CellCulture細胞生物學(xué)教研室現(xiàn)在是1頁\一共有128頁\編輯于星期日授課對象：研究生

授課教材：細胞培養(yǎng)，司徒振強、吳軍正主編等主編，

世界圖書出版西安有限公司

授課教師：顧蕓，王彩萍，劉曉宇

帶教研究生：一組負(fù)責(zé)人：彭蘇

組員：龔佳歡、劉鑫、吳建成、葉永契

二組負(fù)責(zé)人：何春嬌

組員：王盛燃、張薛杰、查廣彬從猛

神經(jīng)再生重點實驗室/神經(jīng)科學(xué)系

現(xiàn)在是2頁\一共有128頁\編輯于星期日學(xué)號姓名組別帶教14180014曹澄君超凈臺1龔佳歡彭蘇15180002印麗鋒15180004劉珍珍15180007俞盛楠15180009陳曉旭超凈臺2劉鑫15180010錢秀榮15180012朱曉玥15180020程鑫15180021張晟超凈臺3吳建成15180022邢鳳軍15180023殷開治15160001李雯15160003陳美美超凈臺4葉永契15160006吉磊15160007王守艷15160010俞少露15160015吳麗婷超凈臺5王盛燃何春嬌

15160016周琪15160017夏瑜椰15160018楊春朝15160019季兆東超凈臺6張薛杰15160021王昆15160022陳璐15160023何理15160024胡靜靜超凈臺7查廣彬15160026華橋15160027單延鳳15160028李潔瑩15160029張慶婕超凈臺8從猛15160030陸建鋒15160031韋玉芳15160032薛均15160033施維現(xiàn)在是3頁\一共有128頁\編輯于星期日課程內(nèi)容介紹第一講：細胞概論-----------------------------------------------

4.11（周一）18:30

第二講：細胞株傳代培養(yǎng)--------------------------------------

4.12（周二）18:00

第三講：臺盼藍染色及細胞計數(shù)-----------------------------

4.14（周四）18:00第四講：細胞凍存及種細胞（為真核轉(zhuǎn)染及細胞分裂指數(shù)做準(zhǔn)備）----------------------------------------------------------4.15（周五）18:00第五講：真核細胞轉(zhuǎn)染----------------------------------------4.16（周六）18:00第六講：細胞分裂指數(shù)，細胞活力鑒定及細胞固定（為細胞周期測定做準(zhǔn)備）

----------------------------------------------------------4.17（周日）18:00第七講：凍存細胞復(fù)蘇、觀察轉(zhuǎn)染效果及講解細胞周期、細胞活力測定結(jié)果

----------------------------------------------------------4.18（周一）18:00第八講：原代細胞的培養(yǎng)--------------------------------------4.19（周二）18:00第九講：觀察原代培養(yǎng)結(jié)果，流式細胞實驗演示，課程復(fù)習(xí)和總結(jié)----------------------------------------------------------4.21（周四）18:00現(xiàn)在是4頁\一共有128頁\編輯于星期日？WHY現(xiàn)在是5頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是6頁\一共有128頁\編輯于星期日

據(jù)CCTV4報道，13年10月中國臺灣地區(qū)臺北榮民總醫(yī)院在干細胞研究方面有重大突破，研究人員利用干細胞已分化出網(wǎng)膜和心肌細胞，目前該研究正處于臨床實驗階段，未來有望生產(chǎn)干細胞藥品有效治療失明、心臟病等?，F(xiàn)在是7頁\一共有128頁\編輯于星期日一口好牙不但能給出一個美麗的笑容，還是健康的標(biāo)志。但由于疾病或意外事故，我們可能失去牙齒。鑲顆金牙吧，有損整體美觀?，F(xiàn)在好了，科學(xué)家成功利用人的尿液衍生的細胞誘導(dǎo)形成干細胞獲得再生牙齒雛形。7月30日，這項研究成果刊登在學(xué)術(shù)期刊《細胞再生》上，同時也引發(fā)國際社會廣泛討論。現(xiàn)在是8頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是9頁\一共有128頁\編輯于星期日

CLS生物治療的原理是利用自身免疫殺滅腫瘤細胞。2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎獲得者斯坦曼博士在1973年發(fā)現(xiàn)了激活免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細胞DC細胞。在20世紀(jì)80年代，科學(xué)家又培養(yǎng)出了具有腫瘤強殺傷效應(yīng)的CIK細胞。這兩種細胞是腫瘤生物治療的關(guān)鍵。CLS生物治療通過體外實驗萬倍擴增這兩類細胞，再輸回患者體內(nèi)實現(xiàn)腫瘤大面積殺傷治療。CLS多細胞生物免疫治瘤-有效延長生命長度3-5年,保證提升生物質(zhì)量,實現(xiàn)瘤自我康復(fù).現(xiàn)在是10頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)在是11頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)的應(yīng)用研究哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律研究細胞分化用于制造組織，器官研究基因功能生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物疾病治療與治療性克隆研究細胞癌變機理及新藥物的篩選

從分子到細胞，我們?nèi)绾稳ニ伎迹楷F(xiàn)在是12頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)的優(yōu)點1.活細胞：能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動2.可控制：可選擇特定的研究細胞種類、性質(zhì)、階段

可控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等因素

可采用各種研究技術(shù)、記錄方法：

倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等。3.樣品均一性：來源于同一組織同一種細胞。4.經(jīng)濟、規(guī)模和機械化

現(xiàn)在是13頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)的局限性人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高,但人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同。缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響。當(dāng)細胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，必然發(fā)生變化?，F(xiàn)在是14頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)的基本條件無菌/滅菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素細胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，

高速離心機，移液器細胞保存條件：液氮罐實驗室安全：生物實驗室安全，P1,P2,P3實驗室安全現(xiàn)在是15頁\一共有128頁\編輯于星期日設(shè)計原則：防止微生物和有害物質(zhì)的影響，要求環(huán)境整潔，空氣清新、無塵、干燥。細胞培養(yǎng)室按功能可分為準(zhǔn)備室，緩沖室，培養(yǎng)室。冰箱超凈臺倒置顯微鏡離心機載物臺櫥柜物品柜培養(yǎng)箱恒溫箱顯微鏡緩沖室培養(yǎng)室準(zhǔn)備室工作臺水池試劑柜干燥箱CellBiologyLab現(xiàn)在是16頁\一共有128頁\編輯于星期日凈化工作室------我國藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn)-------潔凈度級別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)

≥0.5um

≥5um浮游菌/立方沉降菌/皿

100

3,500

0

5

1

10,000

350,000

2,000

100

3

100,0003,500,000

20,000

500

10

300,00010,500,000

60,000

NA

15現(xiàn)在是17頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是18頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)室現(xiàn)在是19頁\一共有128頁\編輯于星期日初級過濾高級過濾無菌空間超凈工作臺現(xiàn)在是20頁\一共有128頁\編輯于星期日

SterileworkarealaminarflowcabinetclassII-HEPAfilter(0.3μm)-UV250-270nm現(xiàn)在是21頁\一共有128頁\編輯于星期日Incubator(humidCO2incubatorrecommended)CO2incubator，37oC，AppropriateCO2現(xiàn)在是22頁\一共有128頁\編輯于星期日大容量高壓滅菌器

全自動手提式滅菌器

濕熱滅菌裝置現(xiàn)在是23頁\一共有128頁\編輯于星期日自動雙重純水蒸餾器純水儀細胞培養(yǎng)用水裝置現(xiàn)在是24頁\一共有128頁\編輯于星期日酶標(biāo)儀微孔板震蕩器現(xiàn)在是25頁\一共有128頁\編輯于星期日水平離心機現(xiàn)在是26頁\一共有128頁\編輯于星期日

倒置顯微鏡invertedmicroscope現(xiàn)在是27頁\一共有128頁\編輯于星期日水浴箱干燥箱現(xiàn)在是28頁\一共有128頁\編輯于星期日29LiquidN2Long-termstorageofcells液氮罐現(xiàn)在是29頁\一共有128頁\編輯于星期日移液器現(xiàn)在是30頁\一共有128頁\編輯于星期日濾器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。Zeiss濾器(過濾除菌)：現(xiàn)在是31頁\一共有128頁\編輯于星期日培養(yǎng)基過濾除菌裝置現(xiàn)在是32頁\一共有128頁\編輯于星期日負(fù)壓正壓Filtrate：suckfilter0.22umpressfilter0.22um現(xiàn)在是33頁\一共有128頁\編輯于星期日Mediasterilizationthrougha0.22μmmembranefilterassembledinafilterholderA:ThevacuumpumpB:GlassorplasticpipettesFiltrate現(xiàn)在是34頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是35頁\一共有128頁\編輯于星期日培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿現(xiàn)在是36頁\一共有128頁\編輯于星期日實驗器材的清洗和滅菌清洗的重要性1.除化學(xué)污染：鹽、油污、蛋白質(zhì)、重金屬等2.使培養(yǎng)瓶內(nèi)表面帶負(fù)電荷，供細胞附著。不要讓污染了的器皿變干??！滅菌的重要性除去微生物污染現(xiàn)在是37頁\一共有128頁\編輯于星期日一、玻璃制品的清洗清洗工作包括；浸泡、超聲、浸酸、沖洗四步。1、浸泡；器皿在加中性洗滌劑的液體中浸泡數(shù)小時。新購的玻璃器皿必須徹底清洗。2、超聲；在加有中性洗滌劑的超聲槽中超聲30min。3、沖洗，用水沖凈，稍涼干后浸酸。4、浸酸-清潔液，一般浸泡6h以上。以配制中等強度清潔液為例；重鉻酸鉀120g、濃硫酸200ml、蒸餾水200ml。5、沖洗，及時沖凈（不掛水為止）6、烘干。現(xiàn)在是38頁\一共有128頁\編輯于星期日三：金屬器皿

金屬器皿不能泡酸，洗滌時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。

放入鋁制盒內(nèi)包裝好，高壓滅菌，再烘干備用。二、塑料及橡膠制品

用水浸泡→超聲→沖洗→浸酸（1%鹽酸，6h）→沖洗→烘干?，F(xiàn)在是39頁\一共有128頁\編輯于星期日四、物品的包裝及消毒

1、洗凈、烘干的物品應(yīng)及時包裝，常用牛皮紙、棉布、鋁盒、以及專用金屬消毒筒等。物品應(yīng)標(biāo)明品名、日期。

2、消毒；

⑴用壓力蒸氣滅菌，玻璃器皿一般15壓力（ibf)-121℃.壓力維持30min。培養(yǎng)用的液體以及塑料、橡膠制品常以10ibf-115℃，維持10min。

⑵過濾除菌；有塑料、不銹鋼微孔濾膜濾器，用正壓過濾除菌。塑料的一般為針式濾器，直徑25mm和50mm兩種。不銹鋼微孔濾膜濾器有500和1000ml兩種。除菌用微孔濾膜，孔徑為0.22um。注意濾完后要檢查濾膜是否完整。

⑶電離輻射滅菌；核素產(chǎn)生的r射線或電子加速器產(chǎn)生的加速離子輻射物品殺細菌和微生物的方法。

⑷環(huán)氧乙烷，化學(xué)滅菌?，F(xiàn)在是40頁\一共有128頁\編輯于星期日培養(yǎng)用液

體外培養(yǎng)離不開細胞在體外生存和生長的各種液體環(huán)境-培養(yǎng)用液，因此其各種成份必需嚴(yán)格選擇，有嚴(yán)格的制備操作過程。

培養(yǎng)用液主要包括:培養(yǎng)液、緩沖液、平衡鹽溶液、血清、PH調(diào)整液、抗生素液等。所有用液均除菌后標(biāo)明名稱、日期、PH值，在適當(dāng)溫度下貯存。一、水與緩沖液（一）水:是培養(yǎng)用液最主要的溶劑，是細胞賴依生存的環(huán)境。對水質(zhì)要求高；三蒸水、去離子水、超純水。此外，水的貯存也很重要；貯存于密封、洗凈玻璃并內(nèi)，時間<2W，最好是現(xiàn)制現(xiàn)用?，F(xiàn)在是41頁\一共有128頁\編輯于星期日（二）緩沖液

由弱酸/弱酸強堿組成的鹽或弱堿/弱堿強酸組成的鹽如碳酸/碳酸氫鈉，磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉。

細胞生活環(huán)境中無機鹽種類很多，因細胞、組織的不同而不同，在所有細胞中無機鹽都以離子狀態(tài)存在。培養(yǎng)用液

現(xiàn)在是42頁\一共有128頁\編輯于星期日二、培養(yǎng)基（一）、營養(yǎng)成分：

1、氨基酸：主要需要以下12種必須氨基酸，它們都是L型的。

2、單糖：六碳糖是主要的能源，也是合成氨基酸的原料，吸收能力最強的是葡萄糖、半乳糖最低。

3、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，因此是必不可少的。

4、無機離子和微量元素：細胞生長過程中除需要鈉、鉀、鈣、鎂等基本元素外，還需要一些微量元素，鐵、鋅、錳、鉬等。培養(yǎng)用液

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液現(xiàn)在是43頁\一共有128頁\編輯于星期日（二）、促生長因子及激素

體內(nèi)生長需要因子的刺激、調(diào)節(jié)，體外同樣需要，愈來愈多的實驗證明各種激素、生長調(diào)節(jié)因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)具有十分重要的作用。（三）、滲透壓

細胞必須生活在等滲的環(huán)境中，大多數(shù)細胞對滲透壓有一定的耐受性。人血漿的滲透壓是290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。對于大多數(shù)哺乳類動物細胞，滲透壓在260~320mOsm/kg的范圍內(nèi)都適宜。現(xiàn)在是44頁\一共有128頁\編輯于星期日（四）、pH

大多數(shù)細胞的適宜pH為7.2~7.4，偏離此范圍對細胞產(chǎn)生有害影響，培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力。造成培養(yǎng)基pH波動的主要物質(zhì)是細胞代謝產(chǎn)生的CO2,在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為了解決這一問題，合成培養(yǎng)基中采用了NaHCO3-CO3緩沖系統(tǒng)，并采用開放式培養(yǎng)的方式，使細胞產(chǎn)生的CO2及時逸出培養(yǎng)器皿，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中的CO2氣體的濃度（5%），使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。NaHCO3+H2ONa++HO–+H2O+CO2現(xiàn)在是45頁\一共有128頁\編輯于星期日（五）、無毒、無污染

體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)無任何抵抗力。因此，培養(yǎng)基應(yīng)達到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染?，F(xiàn)在是46頁\一共有128頁\編輯于星期日培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。

（六）、培養(yǎng)基的種類現(xiàn)在是47頁\一共有128頁\編輯于星期日合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低。

缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要?，F(xiàn)在是48頁\一共有128頁\編輯于星期日水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液(balancedsaltsolution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無機鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。配液時注意：（1）用水；配制先后順序；稱量，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等。（2）物質(zhì)的純度，常用的純度有優(yōu)級純(特級純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種。（3）物質(zhì)的可溶性，避免沉淀析出。（4）物質(zhì)的穩(wěn)定性，如葡萄糖只能在10磅下維持15～20分鐘。（5）貯存液通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時混合和稀釋，過濾除菌備用。常用的緩沖液：生理鹽水、PB、PBS(注意有無鈣鎂離子)、Hanks液（含有鈣鎂離子、葡萄糖、酚紅）細胞培養(yǎng)用液的配制現(xiàn)在是49頁\一共有128頁\編輯于星期日pH調(diào)節(jié)液(1)碳酸氫鈉液可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)pH過程中或超過要求值時，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調(diào)節(jié)之。(2)Hepes緩沖液是一種可以保持細胞培養(yǎng)過程中pH值較長時間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為10～15mmol/L。配制時，稱取所需的Hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，過濾除菌分裝小瓶中，4℃冰箱保存?，F(xiàn)在是50頁\一共有128頁\編輯于星期日消化液(1)胰蛋白酶溶液，

一種黃白色粉末，易受潮，應(yīng)密封放置陰暗干燥處。它的主要作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細胞從瓶壁上脫落并使細胞游離分散開來。常用濃度為0.25%或5%胰蛋白酶。(2)EDTA(乙烯二胺與乙酸或Versene)溶液EDTA是一種化學(xué)螯合劑，毒性小，對貼壁細胞有離散作用。一般使用濃度為0.02%。稱0.1gVersene溶解于500ml無鈣鎂離子磷酸緩沖液中，15磅30分鐘高壓滅菌，4℃或室溫保存。(3)胰蛋白酶－EDTA的配制0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4ml，無鈣鎂離子緩沖液100ml?，F(xiàn)在是51頁\一共有128頁\編輯于星期日抗生素溶液在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100μg。配制時取青霉素1×106和鏈霉素1×106μg,溶于100mlHanks或PBS中，使其含量為青霉素1×104U/ml，鏈霉素1×104μg/ml，使用時每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~1ml。慶大霉素：每毫升100單位---方便、廣譜、穩(wěn)定?，F(xiàn)在是52頁\一共有128頁\編輯于星期日基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升完全培養(yǎng)基的組成現(xiàn)在是53頁\一共有128頁\編輯于星期日血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；

②多種金屬離子；

③激素；各種生長因子；

④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；

⑤胰酶抑制因子；

⑥轉(zhuǎn)移蛋白；

⑦不明成分。血清現(xiàn)在是54頁\一共有128頁\編輯于星期日血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘。血清的消毒：過濾除菌。血清的使用現(xiàn)在是55頁\一共有128頁\編輯于星期日一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死，但支持細胞生長一般需加10％血清。對于血清支持細因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學(xué)特性是細胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。血清的作用現(xiàn)在是56頁\一共有128頁\編輯于星期日無血清培養(yǎng)基現(xiàn)在是57頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)現(xiàn)在是58頁\一共有128頁\編輯于星期日一、無菌技術(shù)微生物污染一直是細胞培養(yǎng)的主要問題?，F(xiàn)在是59頁\一共有128頁\編輯于星期日無菌程度梯度示意圖現(xiàn)在是60頁\一共有128頁\編輯于星期日培養(yǎng)室的滅菌實驗人員的無菌準(zhǔn)備工作面無菌原則現(xiàn)在是61頁\一共有128頁\編輯于星期日正確的工作臺面布局物品在工作臺中部潔凈區(qū)圍成新月狀，酒精燈位于中央?，F(xiàn)在是62頁\一共有128頁\編輯于星期日保持臺面整齊Good！Bad！現(xiàn)在是63頁\一共有128頁\編輯于星期日無菌操作凡是帶入超凈工作臺內(nèi)瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精燈火焰操作。玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必須過火滅菌打開和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。無菌級別高的物品不能觸碰無菌級別低的物品。手不能從敞開的瓶口上方經(jīng)過各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。手握試管、滴管、移液管時盡量遠離工作端。盡可能移走不需要的物品，在操作中經(jīng)常用酒精擦拭臺面。盡可能減少開蓋時間。隨時擦去任何溢出物?，F(xiàn)在是64頁\一共有128頁\編輯于星期日無菌操作傾倒廢液時防止濺起和瓶口回流。

在視野范圍內(nèi)工作?，F(xiàn)在是65頁\一共有128頁\編輯于星期日無菌的思想貫穿到細胞培養(yǎng)的任何操作步驟現(xiàn)在是66頁\一共有128頁\編輯于星期日二、培養(yǎng)細胞的觀察（一）．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度（二）．倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)現(xiàn)在是67頁\一共有128頁\編輯于星期日培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特征1.體外培養(yǎng)細胞的分型2.培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程3.體外培養(yǎng)細胞的種類4.細胞系或細胞株的命名現(xiàn)在是68頁\一共有128頁\編輯于星期日體外培養(yǎng)細胞的分型1.貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：成纖維細胞上皮型細胞游走細胞型多型細胞型2.懸浮型：見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。現(xiàn)在是69頁\一共有128頁\編輯于星期日胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。成纖維細胞型：貼附型現(xiàn)在是70頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。上皮型細胞：現(xiàn)在是71頁\一共有128頁\編輯于星期日游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。多形細胞型：有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

現(xiàn)在是72頁\一共有128頁\編輯于星期日見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。2.懸浮型概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫細胞也可能特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點：觀察不方便，很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)細胞生物學(xué)技術(shù)課件73現(xiàn)在是73頁\一共有128頁\編輯于星期日懸浮細胞現(xiàn)在是74頁\一共有128頁\編輯于星期日培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程

1.培養(yǎng)細胞生命期（LifeSpanofCultureCells）指細胞在整個離體培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時間，分為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。2.組織培養(yǎng)細胞一代生存期所謂細胞“一代”一詞，僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增(Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。現(xiàn)在是75頁\一共有128頁\編輯于星期日概念——“代”細胞分裂一次？錯！培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）?，F(xiàn)在是76頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞生物學(xué)技術(shù)課件77原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)現(xiàn)在是77頁\一共有128頁\編輯于星期日每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期平臺期現(xiàn)在是78頁\一共有128頁\編輯于星期日游離:

懸浮,胞質(zhì)回縮,全部細胞變?yōu)閳A球形;吸附:

貼附底物,一般24小時內(nèi)貼壁;潛伏期:可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相.細胞貼壁過程現(xiàn)在是79頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞密度：接種的細胞密度越大、數(shù)量越多，細胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較長。細胞類型：傳代培養(yǎng)的細胞潛伏期比原代培養(yǎng)的細胞短。傳代培養(yǎng)期的細胞,一般為6~24h;原代24~96h或更長。單個細胞快,細胞大團慢,組織塊慢。連續(xù)細胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細胞(6-24h)比有限細胞系與正常二倍體細胞的短。

來源：胚胎組織:短,2天可見細胞生長；成體組織:長。細胞機能狀態(tài)：不良者慢。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)液,pH,底物等，不利：污染,有毒；慢。滯留時間的長短與：細胞種類、接種的細胞密度、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)?，F(xiàn)在是80頁\一共有128頁\編輯于星期日初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細胞已進入指數(shù)增生期?，F(xiàn)在是81頁\一共有128頁\編輯于星期日潛伏期指數(shù)生長期停滯期現(xiàn)在是82頁\一共有128頁\編輯于星期日有絲分裂指數(shù)(MI):

指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)1000個細胞。

一般細胞的MI約為0.1~0.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞高，可達3%~5%。細胞群體倍增時間：

培養(yǎng)物種中細胞數(shù)量翻倍的平均時間MTT法：

反映細胞內(nèi)線粒體中一種酶活性程度標(biāo)記核苷酸(3H-TdR)摻入量：反映DNA合成判斷細胞生長的指標(biāo)：

指數(shù)生長期內(nèi)細胞分裂活動的程度(增殖活性)可作為判斷細胞生長是否旺盛的重要指標(biāo)?，F(xiàn)在是83頁\一共有128頁\編輯于星期日1.初代培養(yǎng)

又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦進行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。2.細胞系

初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系。無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明已惡性化。3.細胞株從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株。體外培養(yǎng)細胞的種類現(xiàn)在是84頁\一共有128頁\編輯于星期日4.二倍體細胞細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細胞占75％或80％以上）的細胞群，稱二倍體細胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細胞系。但隨供體年齡和組織細胞的不同，二倍體細胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細胞可傳50代土10代，人胚腎只有8～10代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細胞15～30代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或2～5代即大量凍存作為原種，用時再進行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細胞的衰老。5.遺傳缺陷細胞從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養(yǎng)的細胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細胞，都屬遺傳缺欠細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。6.腫瘤細胞系或株這是現(xiàn)有細胞系中最多的一類，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。

現(xiàn)在是85頁\一共有128頁\編輯于星期日HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）

CHO：中國倉鼠卵巢細胞（ChineseHamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）建立；每3天傳代，每次接種3×105細胞／毫升。

細胞系或細胞株的命名現(xiàn)在是86頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞系或株的鑒定、管理和使用

培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細胞已傳代數(shù)等；

凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱；

細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性；培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量；細胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細胞等，融解后細胞生長特性

核型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無

無污染檢測：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等

物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測

免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測

細胞建立者：建立者姓名；檢測者姓名如：ATCC入庫細胞要求檢測項目現(xiàn)在是87頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是88頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是89頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是90頁\一共有128頁\編輯于星期日同時附有照片（高低密度）現(xiàn)在是91頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)的污染和檢測

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌和病毒。無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等是主要的污染源。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。現(xiàn)在是92頁\一共有128頁\編輯于星期日肉眼直接觀察法、培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法細菌和真菌的污染和檢測現(xiàn)在是93頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是94頁\一共有128頁\編輯于星期日支原體的污染和檢測造成支原體高污染率的原因有多種

支原體大小0.1~0.8m，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45m）；支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化；過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式；細胞流通間缺乏物品管理，造成實驗室間的相互污染；研究或操作人員忽略污染問題；已受污染的細胞、培養(yǎng)基、血清等?，F(xiàn)在是95頁\一共有128頁\編輯于星期日

相差顯微鏡觀察法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法PCR方法特異引物擴增支原體DNA支原體的檢測現(xiàn)在是96頁\一共有128頁\編輯于星期日支原體污染后的抗生素處理:

第一種方法：使用泰樂菌素（tylosin，Sigma)，泰樂菌素是一種獸用抗生素,常用在雞、豬的食料輔料，可以防止支原體感染引起的支氣管哮喘，至今尚未見有耐藥菌株，是治療支原體感染的特效藥。第二種方法：M-Plasmocin,InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細胞，不會重新感染支原體。第三種方法：用BM-Cyclin-1/2，效果很好，方法如下：細胞傳代同時加BM-Cyclin-110g/ml，37℃培養(yǎng)3天，加入BM-Cyclin-25g/ml，37℃培養(yǎng)3天；（不需傳代，因為支原體污染的細胞生長非常慢?。┤绻毎L恢復(fù)正常，即可結(jié)束。否則加BM-Cyclin-120g/ml，37℃培養(yǎng)3天，加入BM-Cyclin-210g/ml，37℃培養(yǎng)3天。懷疑是支原體污染的就可以試試，對細胞不會有太大影響?，F(xiàn)在是97頁\一共有128頁\編輯于星期日3.病毒的污染和檢測

細胞的直接觀察動物接種檢查電子顯微鏡觀察免疫學(xué)檢查PCR技術(shù)現(xiàn)在是98頁\一共有128頁\編輯于星期日現(xiàn)在是99頁\一共有128頁\編輯于星期日常用抗生素用量和效應(yīng)抗生素抗菌譜細菌真菌支原體常用濃度青霉素G+100IU/ml鏈霉素G-100g/ml慶大霉素G+,G-＋200g/ml四環(huán)素G+,G-＋10g/ml卡那霉素G+,G-＋50g/ml兩性霉素＋2g/ml制霉菌素＋25g/ml現(xiàn)在是100頁\一共有128頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)中的研究方法現(xiàn)在是101頁\一共有128頁\編輯于星期日內(nèi)容提要一、細胞生長狀況觀察二、細胞活力測定三、細胞凋亡檢測四、流式細胞術(shù)五、常用單細胞分離技術(shù)六、真核細胞轉(zhuǎn)染現(xiàn)在是102頁\一共有128頁\編輯于星期日一、細胞生長狀況觀察

1.常規(guī)觀察

2.細胞計數(shù)

3.細胞生長曲線

4.細胞分裂指數(shù)

5.細胞貼