1、玉米和水稻葉綠體的分離及葉綠素含量的測定摘要：利用高鹽低pH值法對植物和植物進行葉綠體的分離與提取，經(jīng)研磨-差 速離心-裂解-純化，可獲得完整的葉綠體，進而用丙酮溶解葉綠素，測定光密度值， 推算出總?cè)~綠素含量。本方法快速簡便、省去傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心和氯化銫 密度梯度離心等昂貴、耗時的步驟，對儀器的要求不高，成本低，適用于實驗教 學和科研活動。關鍵詞：葉綠體；葉綠素；分離；含量測定Abstract : Plant chloroplast were extracted by the high-salt and low pH method. after skiving, differential

2、 centrifugation, cracking and purification we got eligible chloroplast. dissolved the chlorophyl by acetone and calculate the total content of chlorophyl after the absorbency mensurated. The method is fast and simple, it elide some expensive, time-consuming steps such as traditional sucrose density

3、gradient centrifugation and cesium chloride density gradient centrifugation, it suit for teaching and research.Key words : Chloroplast, Chlorophyl, Separate, Content mensurate1前言葉綠體是植物進行光合作用極為重要的細胞器，它具有獨立復制的遺傳物質(zhì)。20世紀 初，人們根據(jù)植物葉片的花斑現(xiàn)象具有母性遺傳的特征，推斷在葉綠體上可能存在著核外 的遺傳因子。直到20世紀60年代初，隨著核酸檢測與鏡技術(shù)發(fā)展，葉綠體基因組的存在 才最

4、后由Ris等人證實1。目前，cpDNA被廣泛地用于細胞質(zhì)遺傳、植物雄性不育、植物 的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性和親緣關系等方面的研究。然而，葉綠素是在葉綠體中得到的 一種色素，它廣泛存在于植物的葉和莖中的綠色色素，它與蛋白質(zhì)結(jié)合在于葉綠體中，是 綠色植物進行光合作用所必需的催化劑。一般葉綠素是泛指葉綠素類的總稱。葉綠素及其 衍生物可廣泛用作食品的食用色素，還可用于化妝品的著色劑、脫臭劑等；在醫(yī)藥上可用 來治療創(chuàng)傷、傳染性肝炎、胃及十二指腸潰瘍、慢性腎炎及急性胰腺炎，它還能增進造血 機能及促進放射線損害機體的康復，外科上用于治療灼傷、痔瘡及子宮疾患，并有降低膽 固醇、改善便秘等作用。由于葉綠體中的重要

5、功能，所以一直是細胞生物學、遺傳學和 分子生物學的重要研究對象。人們根據(jù)光合作用碳素，同化中CO2固定的最初光合產(chǎn)物日不同，把高等植物分成2 類:1）C3植物。這類植物的最初光合產(chǎn)物是3-磷酸甘油酸（三碳化合物），這種反應途徑C3途 徑,如水稻、小麥、棉花、大豆等大多數(shù)植物。2）C4植物。這類植物以草酰乙酸（四碳化 合物）等為光合最初產(chǎn)物，所以這種途徑稱為C4途徑，如玉米、甘蔗、高粱等。一般來說，C4植物比C3植物具有較強的光合作用，其原因可從結(jié)構(gòu)和生理兩方面來探討。結(jié)構(gòu)和功能是有密切關系的，是統(tǒng)一的。C4植物葉片的維管束鞘薄壁細胞較大，其中 含有許多較大的葉綠體，葉綠體沒有基?；蚧０l(fā)育不良

6、；維管束鞘的外側(cè)緊密連接一層 成環(huán)狀或近于環(huán)狀排列的葉肉細胞，組成花環(huán)狀”結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)是C4植物的特征。葉肉 細胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目少，個體小，有基粒。C3植物的維管束鞘薄壁細胞較小，不含或很少 葉綠體，沒有“花環(huán)型”結(jié)構(gòu)，維管束鞘周圍的葉肉細胞排列松散。C4植物通過磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶固定CO2的反應是在葉肉細胞的細胞質(zhì)中進行的，生成的四碳羧酸轉(zhuǎn)移到維 管束薄壁細胞中，放出二氧化碳，參與卡爾文循環(huán)，形成糖類，所以玉米、甘蔗等24植物 進行光合作用時，只有維管束鞘薄壁細胞內(nèi)形成淀粉，在葉肉細胞中沒有淀粉。而水稻等 C3植物由于僅有葉肉細胞含有葉綠體，整個光合過程都是在葉肉細胞內(nèi)進行，淀粉只是

7、積 累在葉肉細胞中，維管束鞘薄壁細胞不積存淀粉。在生理上，C4植物一般比C3植物具有較強的光合作用，這是與。4植物的磷酸烯醇式 丙酮酸（PEP）羧化酶活性較強及光呼吸很弱有關4。高等植物光合作用過程中利用的光能是通過葉綠體色素（光合色素）吸收的。葉綠體色 素由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。葉片葉綠素含量與光合作用密切相關， 是反映葉片生理狀態(tài)的重要指標。在植物光合生理、發(fā)育生理和抗性生理研究中經(jīng)常需 要測定葉綠素含量。葉綠素含量也是指導作物栽培生產(chǎn)和選育作物品種的重要指標。分離完整的葉綠體是進行葉綠體遺傳研究的第一步。傳統(tǒng)提取高等植物葉綠體的方法 有蔗糖密度梯度離心法、氯化銫密度梯

8、度離心法和無水法等，但它們都有不足，或得率較 低，或純度不高，而且都費時，不易操作。2材料與方法2.1植物材料玉米、水稻新鮮嫩葉。2.2實驗儀器分析天平、高速離心機、離心管、紗布、剪刀、顯微鏡、TU-1800S紫外可見分光光 度計等。2.3試劑配制緩沖液A(pH=3.6)： 50mmol/L Tris, 25 mmo1/L EDTA, 1.25 mol/L NaC1, 0.25 mol/L 抗壞血酸。緩沖液B(pH=8.0)： 50mmol/L Tris, 25 mmol/L EDTA, 1.25 mol/LNaC1, 10 mmol/Lp 一巰基乙醇，0.1%牛血清白蛋白。緩沖液 C(pH=

9、8.0): 150mmol/L NaC1, 100mmol/L EDTA.2.4操作步驟2.4.1完整葉綠體的分離玉米、水稻葉片各10g，洗凈、擦干水分，4C避光放置過夜，液氮速凍后研磨成粉 末，加入100ml4C預冷的緩沖液A (50mmol/L Tris, 25mmo1/L EDTA, 1.25 mol/L NaC1, 0.25 mol/L抗壞血酸，pH3.6)，勻漿至糊狀，6層紗布過濾至預冷的離心杯中。將濾液分裝到45mL離心管中，4C下2500rpm離心6min,棄上清，用緩沖液A洗1次。沉淀中加60mL緩沖液B (50mmol/L Tris, 25mmol/L EDTA, 1.25

10、mol/L NaC1, 10mmol/Lp 一巰基乙醇，0.1%牛血清白蛋白，pH8.0)(其中10mmol/Lp 一巰基乙醇用前加 入)，用于搖動，使溶液充分懸浮沉淀，4C下2500rpm離心6min，棄上清，用緩沖液B洗1 次。 用少量5mL緩沖液C (150mmol/L NaC1, 100mmol/L EDTA, pH8.0)懸浮沉淀，補 加C液25mL, 4C下2500rpm離心6min,此沉淀即為純化的葉綠體，鏡檢觀察。 每個樣本用5ml 80%丙酮溶解，4C下2500rpm離心6 min,取上清液測定吸光度(A663 和 A645)o2.4.2觀察用顯微鏡觀察沉淀物中葉綠體的形狀、

11、大小。2.4.3測葉綠素的含量用分光光度計測定波長在663nm及645nm處的吸光系數(shù)，即可計算葉綠素含量。葉綠素 含量(mg/ml) =(8.02.A663+20.2.A645)/5，每個樣品重復測3次，再取它們的平均值。2.4.4比較用高鹽低pH值法測定C3植物與C4植物中葉綠素的含量，并比較出哪一種植物利用此方 法分離葉綠體效果更佳。2.4.5流程圖3結(jié)果與分析3.1葉綠體鏡檢觀察差速離心獲得純化的葉綠體鏡檢為綠色橄欖形、近圓形，大小在2-7um左右，在高倍 鏡下可看到葉綠體內(nèi)含有較深的綠色小顆粒。在提取過程中，有大量的葉綠體殘體被破壞， 但同時也有很多完整的葉綠體存在。圖1細胞中完整的

12、葉綠體3.2比較葉綠體的含量采用此方法測出葉綠素的含量。見表1表1c3植物與植物葉綠素含量的比較材料原料（g）A663umA645um得率(mg/ml)C3植物（水稻）100.4260.0150.7439C植物（玉米）4100.3520.3031.7887通過比較兩種植物的葉綠素的得率，進一步證實了 C4植物的葉綠素含量比。3植物的葉 綠素含量高。3.3分析3.3.1材料的選擇和準備選幼嫩葉片為試材，應選擇顏色較深，葉綠體發(fā)育較好，葉綠體色素含量相對較高的 葉片，有利于提取出完整的葉綠體。選擇好實驗用的葉片后，將葉片洗凈，去掉葉柄、葉 脈，最好風十數(shù)小時后再用，這樣經(jīng)過風干處理的葉片，提取制備

13、液中水分要低一些，能 獲得高濃度的葉綠體色素兇。3.3.2方法的確定高鹽低pH值提取方法的設計是圍繞葉綠素的得率和葉綠體的完整性來進行的，傳統(tǒng)的 方法，大都昂貴耗時，得率也不理想，在很大程度上限制了對下一步工作的深入研究，在 本實驗采用了此方法中，經(jīng)液氮研磨和差速離心后，鏡檢觀察到很多較完整的葉綠體，同 時也有很多破碎的葉綠體，證明效果良好。3.3.3試劑的探討低pH值的勻漿緩沖液的加入，有軟化細胞壁外硅質(zhì)的作用，能降低葉綠體膜在勻漿過 程中造成損傷，保證葉綠體的完整性。另外還能更進一步弱化DNA，組蛋白，葉綠體膜之 間的相互作用凹。葉綠體分裂時，沉淀要充分懸浮后，再漫漫加入10mmol/L

14、3巰基乙醇，否則裂解不完 全，就會影響得率【10。4結(jié)論葉綠素是葉綠體內(nèi)的一種色素，它廣泛存在于植物的葉和莖中。它與蛋白質(zhì)結(jié)合分布 在于葉綠體內(nèi)，是綠色植物進行光合作用所必需的物質(zhì)。一般葉綠素是泛指葉綠素類的總 稱，包括葉綠素A和葉綠素B。在樣品處理上，選用液氮研磨方法，沒有選用傳統(tǒng)的勻漿法。用液氮研磨方法比勻漿 細胞破碎的效果好，完整葉綠體的得率高。這樣可以有效破壞組織、細胞結(jié)構(gòu)，降低葉片 含水量，從而提高葉綠體中色素的提取效率。選幼嫩葉片，有利于提取出完整的葉綠體。 生長較老的葉片容易產(chǎn)生較多的粗纖維，不便于離心分離。結(jié)果表明，利用高鹽低pH值法對C3植物和C4植物進行葉綠體的分離與提取是

15、比較有效 的，經(jīng)研磨-差速離心-裂解-純化，可獲得較完整的葉綠體。根據(jù)表1可以證實，C4植物的 葉綠素含量比C3植物的葉綠素含量高。在制備葉綠體的過程中，由于葉綠體的被膜比較脆 弱，分離葉綠體應在等滲的緩沖溶液中，0-4C溫度下進行，葉綠體活力會隨著離體時間延 長而不斷下降，所以，分離工作盡可能在短時間內(nèi)完成。參考文獻劉大鈞.細胞遺傳學M.農(nóng)業(yè)出版社,2004.劉良式.植物分子遺傳學M.科學出版社，2003蔡秋聲.葉綠素及其衍生物的特性和生理功能J.糧食與油脂,1997,(3):38.潘瑞熾，王小菁,李娘輝.植物生理學M.高等教育出版社,2001,65-67.范淑琴，梁淑文.現(xiàn)代植物生理學實驗指南M.科學出版社，1