請學(xué)習(xí)：29/49/54/57/60

切向流過濾驗證在生物制品中的應(yīng)用（2009修訂版）

目錄

1.0介紹.................................................................-3-

1.1目的................................................................-3-

1.2范圍................................................................-4-

2.0術(shù)語表..............................................................-5-

3.0切向流過濾在生物工藝中的應(yīng)用......................................-12-

3.1TFF的操作工藝.....................................................-14-

3.1.1濃縮.........................................................-14-

3.1.2滲濾.........................................................-14-

3.1.3澄清/固液分離................................................-15-

3.1.4可溶性物質(zhì)的分離.............................................?15?

3.1.5灌注.........................................................-15-

3.2TFF的操作模式.....................................................-15-

3.2.1單向過濾.....................................................-16-

3.2.2批處理和流加處理.............................................-16-

3.2.3恒加只過濾...................................................-17-

3.3TFF組件及配置.....................................................-18-

3.3.1卷式濾板與板框...............................................?18?

3.3.2中空纖維膜...................................................-19-

3.3.3螺旋筒.......................................................-20-

3.4TFF的運行控制手段................................................-21-

4.0設(shè)備確認(rèn)（EQ）.........................................................................................-22-

4.1設(shè)備確認(rèn)的前提.................................................?22?

4.2TFF系統(tǒng)操作注意事項...............................................-22-

4.3設(shè)計注意事項.......................................................-23-

4.4安裝確認(rèn)...........................................................-23-

4.5運行確認(rèn)...........................................................-24-

4.6性能確認(rèn)...........................................................-25-

5.0工藝開發(fā)............................................................-26-

5.1膜的適用性........................................................-26-

5.2產(chǎn)物截留量和通量..................................................-27-

5.2.1細(xì)胞澄清.....................................................-27-

5.2.2超濾濃縮和滲濾...............................................-28-

5.3設(shè)備的設(shè)計和操作注意事項..........................................-29-

5.4切向流過濾的工藝特性...............................................-29-

5.4.1微濾.........................................................-30-

5.4.2超濾/滲濾....................................................-32-

5.4.3除雜.........................................................-34-

5.5等比例放大或縮小規(guī)模的要求........................................-34-

6.0工藝驗證............................................................-35-

6.1工藝設(shè)計和工藝特性的關(guān)系..........................................-35-

6.2開發(fā)方案的驗收標(biāo)準(zhǔn)................................................?36?

7.0清潔驗證...........................................................-38-

7.1清潔難點...........................................................-39-

7.2清潔消毒方法.......................................................-39-

7.3清潔驗證方案.......................................................-41-

8.0膜再生..............................................................-42-

9.0再驗證..............................................................-44-

9.1現(xiàn)場監(jiān)控...........................................................-44-

9.2再驗證.............................................................-45-

921設(shè)備再3如正....................................................-45-

9.2.2濾膜和過濾組件的變更........................................-45-

9.2.3操作參數(shù)變更................................................?46?

9.2.4生產(chǎn)規(guī)模的變更...............................................?46?

10.0完整性測試........................................................-47-

10.1完整性測試的類型及應(yīng)用...........................................-47?

10.2結(jié)果分析指南.....................................................-48-

10.2.1完整性測試在大規(guī)模設(shè)備中的應(yīng)用.............................-49-

10.3標(biāo)準(zhǔn)水透性測試...................................................-49-

10.3.1NWP的影響因素............................................-49-

10.3.2NWP測試的結(jié)果分析........................................-50-

10.3.3NWP驗收標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置........................................-50-

11.0萃取物與溶出物...................................................-51-

11.1構(gòu)成材質(zhì)注意事項.................................................-52-

11.2工藝注意事項.....................................................-52-

11.3清潔注意事項.....................................................-53-

1L4沖洗過程..........................................................-53-

11.5實驗方法..........................................................-53-

12.0參考文獻(xiàn)..........................................................-54-

1.0介紹

技術(shù)報告第15號：從工業(yè)發(fā)展的角度來看，關(guān)于切向流過濾在生物制藥中應(yīng)用的描

述，最早出現(xiàn)在1992年，這些相關(guān)的描述為生物制藥生產(chǎn)中切向流過濾技術(shù)（TFF）

的工藝驗證提供了方向性的指導(dǎo)。（1）在過去的15年中，工業(yè)處理設(shè)備大有改進(jìn)，新

技術(shù)和新材料的引入為后續(xù)大量工藝產(chǎn)品的驗證工作提供了良好的技術(shù)條件,與此同

時，也產(chǎn)生了大量的驗證指導(dǎo)文件。C）

1.1目的

PDA技術(shù)報告第15號（2009年修訂版）：本次修訂《生物制藥中切向流過濾工藝

驗證》的目的是為了3僉證和更新TR-15（TechnicalReportNo.15，技術(shù)報告第15號）

在1992年原始版本中提出的觀點和信息。目前應(yīng)用較廣的純化方案有切向流過濾和層

析法，關(guān)于層析法的相關(guān)內(nèi)容可見PDA技術(shù)報告第14號（2008年修訂版）《蛋白質(zhì)

純化工藝中色譜柱的驗證》。2）

本驗證方案的基本原理不變，其目的仍然是為了提高該工藝的可信度。然而，現(xiàn)行

的切向流過濾驗證方法需要在初始驗證結(jié)果的基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)，以更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度

對待后續(xù)的各項風(fēng)險評估。

本報告將就切向流過濾技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離工藝上，需要進(jìn)行驗證的所有方面展開

討論。討論內(nèi)容包括，切向流過濾技術(shù)的原理，工藝開發(fā)和實驗室小試規(guī)模研究，放

大生產(chǎn)驗證，驗證后續(xù)工作如過程監(jiān)控等。本技術(shù)報告主要是為缺乏蛋白質(zhì)純化工藝

驗證經(jīng)驗的科研人員和技術(shù)人員提供簡明的指導(dǎo),而非手把手地傳授驗證經(jīng)驗。

1.2沱圍

PDA技術(shù)報告第15號（2009年修訂版），切向流過濾驗證在生物制藥行業(yè)的應(yīng)用，

著重介紹了通過重組或非重組技術(shù)表達(dá)生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)和多肽的TFF工藝驗證過程,

并結(jié)合相關(guān)分析方法表達(dá)驗證結(jié)果。其中部分原理同洋適用于其他生物制品工藝，如

從組織和體液中分離提取蛋白質(zhì)和多肽等。不過,重組DNA藥物和單克隆抗體不在本

文涉及的產(chǎn)品范圍內(nèi)，相關(guān)的工藝蛉證方法可能也不適用于這兩類生物制品。

本技術(shù)報告為TFF工藝提供了可用于生產(chǎn)工藝和單元操作驗證的具體策略，并涵括了

驗證的生命周期，包括TFF的工藝研發(fā)和性能特性,設(shè)備的設(shè)計，工藝及設(shè)備驗證，

變更控制維持"驗證狀態(tài)"，過程監(jiān)控和再驗證。本文還對切向流過濾的基本原則進(jìn)

行簡要的回顧，只有充分理解這些基本原理，才能更好的開展后續(xù)的驗證開發(fā)工作。

本報告驗證內(nèi)容不含以下方面：返工，重加工，無菌藥品生產(chǎn)工藝，過程分析技術(shù)

（PAT）,廠房設(shè)施，設(shè)計確認(rèn)，穩(wěn)定性研究及運輸。讀者可通過查閱參考文獻(xiàn)獲得更

多相關(guān)信息。

本次修訂TR-15的主要目的是通過提供更詳細(xì)的切向流過濾驗證指導(dǎo)，并對TR-42

《蛋白質(zhì)生產(chǎn)工藝驗證》內(nèi)容進(jìn)行補充說明。（2）與TR-42一樣，本文不會制定強制

性的驗證標(biāo)準(zhǔn)。TFF技術(shù)在除熱原上的應(yīng)用較少，因而本文將不對其進(jìn)行討論。

2.0術(shù)語表

以下為本技術(shù)報告中常見的專業(yè)術(shù)語或其同義詞：

各向異性（不對稱）膜：

在膜的厚度方向上，孔徑結(jié)構(gòu)不一致的高分子膜。因液體透過膜時的流動特性主要取

決于透過速度的大小，所以膜內(nèi)的流動通?？烧J(rèn)為是“定向"的。（見圖3.0-2和

3.0-3）

分批過濾：

濾液在過濾后通過再循環(huán)系統(tǒng)重新回到原貯罐中的過程稱為分批過濾過程。［詳見

322節(jié)。］

邊界層：

流體在膜表面形成的薄層區(qū)域，距離邊界層越近，物體的相對速度越小，邊界層內(nèi)物

體速度為零。

泡點：

向濕潤濾膜（溶液可為水，乙醇，產(chǎn)物等）施加一定的氣體壓力后，氣體不斷冒出濾

膜，形成氣泡。濾膜生成氣泡需要的最小壓力稱為泡點壓力（4）。

濾餅：

液體過濾后附著在濾器上的原液所含的固體物質(zhì)；

卷式濾板：

包含平板，半透膜，進(jìn)料通道和濾液流道，濾膜呈卷狀分布的一類切向流過濾組件。

清潔水通量：

在指定溫度和壓力下，單位面積-時間-壓力下測得的透過濾膜的水或緩沖液的通量。

【別名:標(biāo)準(zhǔn)水透性NWP］

清洗：

利用物理或化學(xué)作用，除去濾膜在日常工作中殘留污石的過程。

復(fù)合膜：

具有多層結(jié)構(gòu)的復(fù)合型濾膜。

濃縮：

通過過濾操作獲得濃縮濾液的過程。

濃縮因子：

初始進(jìn)料體積與滲余物體積的比值。

濃差極化：

截留的溶質(zhì)在膜與原溶液界面或臨近膜界面區(qū)域濃度逐漸增大，并在濃度梯度作用下,

溶質(zhì)又會由膜面向原溶液擴散的現(xiàn)象

雜質(zhì)：

所有由外部引入，非過濾系統(tǒng)產(chǎn)生的物質(zhì)（化學(xué)物質(zhì)、生物物質(zhì)、微生物等）稱為雜

質(zhì)。

關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)：

影響產(chǎn)品的安全，性質(zhì)，效力，質(zhì)量及純度等重要屬性的因素。

錯流過濾：

參考切向流過濾的定義。

切向流速：

濾液在平行于膜表面方向上的流動速率。

透析：

混合溶液中的溶劑透過透析膜進(jìn)入透析液，使原溶液中溶質(zhì)濃度不斷提高的操作。

透析體積（DiafiltrationVolume,Diavolumes）:

透析過程中以等體積透析所用的透析液體積。

擴散流測試：

通過測定氣體透過濕濾膜的速率來判斷濾膜完好程度的試驗。

提?。?/p>

通過施加壓力或改變其物理性質(zhì)（如添加溶劑溶解，改變溫度或作用時間等），從混

合物中萃取有用成分的操作。

流加過濾：

原理類似于分批過濾，料液從一個單獨的貯罐（通常容量較大）輸送至一個較小的回

流罐中過濾，回流罐中的截留液通過循環(huán)回流至貯罐中重新進(jìn)行過濾的過程。（詳見

3.2.2）

料液：

過濾前的原始溶液。

進(jìn)料壓力：

切向流過濾系統(tǒng)入口處測得的壓力值。

濾篩：

用于分離流體中各種組分的多孔固體介質(zhì)。

濾液：

料液透過濾篩或濾膜后獲得的流體。【同義詞：滲透液】

濾壓：

切向流過濾系統(tǒng)中料液透過過濾介質(zhì)時的壓力?！就x詞：滲透壓力】

流量：

單位時間內(nèi)液體流動的容量，單位如升/分鐘，加侖/天等。

通量：

流體在單位時間通過單位橫截面積的速率，單位為速度/（面積?時間）（如LMH,升

/（平方米?小時））

污垢：

降低膜的工作效率的溶質(zhì)或懸浮固體（詳見結(jié)垢）

結(jié)垢：

通過吸附進(jìn)料液中組分或與料液中組分發(fā)生聚合反應(yīng)，降低膜的性能的過程稱為結(jié)垢。

一般情況下,污垢可以通過清洗去除。

雜質(zhì)：

藥物生產(chǎn)中所有不在理論計算范圍內(nèi)的組分，包括類似物及輔料。此處定義的雜質(zhì)不

同于污染。

完整性檢測：

確定膜或過濾器的完好性，保證無重大缺陷的測試方法。

浸出：

在存儲或正常使用過程中，某些化學(xué)成分與溶液接觸，并透過接觸表面擴散至溶液中

的過程。

膜（合成膜）：

一類表面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其厚度的薄膜，在一定的驅(qū)動力作用下，如施加壓力、電滲透壓

等，粒子能穿過薄膜進(jìn)入至另一側(cè)。

膜面積：

濾膜的有效過濾表面積

微濾（MicrofitrationMF）:

在壓力驅(qū)動下，溶液透過基膜，小顆粒及可溶性分子（通常為直徑大于或等于0.1pm）

被截留在膜外的過程。

膜組件：

一個由多個不同形態(tài)的膜組成的，用于連接料液、截留、過濾及空氣系統(tǒng)中所有管道

及端口的完整的單元框架結(jié)構(gòu)。

分子量篩截（NMWC0）:

制造商定義的一種用于測量超濾膜溶質(zhì)保留系數(shù)的方法

參數(shù)（2）:

操作系數(shù)：生產(chǎn)過程中，通過控制一個內(nèi)在的變量或條件，以達(dá)到直接控制生產(chǎn)過程

的目的。一般情況下,這些參數(shù)為理化參數(shù)。（例如，溫度，處理時間，柱流速，洗

柱量，反應(yīng)物濃度，緩沖液PH值等。）【別名，工藝參數(shù)】

關(guān)鍵操作參數(shù)：

在小范圍內(nèi)變動和/或難以控制的，且在控制過程中必須的，但不會影響重要的產(chǎn)品質(zhì)

量屬性的輸入型參數(shù)。當(dāng)關(guān)鍵操作參數(shù)超出可接受范圍時會影響工藝的性能，但不會

影響產(chǎn)品質(zhì)量?！緞e名：關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）】

非關(guān)健操作參數(shù)：

定義上，除關(guān)鍵操作參數(shù)以外的所有操作參數(shù)均為非關(guān)鍵操作參數(shù)。非關(guān)鍵操作參數(shù)

又可分為重要操作參數(shù)和一般操作參數(shù)。

關(guān)鍵操作參數(shù)：

通過固定其數(shù)值可將生產(chǎn)過程中的變化嚴(yán)格控制在小范圍內(nèi)，且其在生產(chǎn)過程中起著

必不可少的作用的參數(shù)。生產(chǎn)過程中，關(guān)鍵操作參數(shù)不會影響產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，

當(dāng)其數(shù)值超出標(biāo)準(zhǔn)制定范圍，對產(chǎn)品的工藝流程造成影響而不會影響產(chǎn)品質(zhì)量。（如

影響產(chǎn)量、過程持續(xù)時間等）

非關(guān)鍵操作參數(shù)：

生產(chǎn)過程中容易被控制的過程參數(shù)。非關(guān)鍵運行參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)范圍相對較寬，當(dāng)其超出

可接受范圍時可影響原料藥的質(zhì)量及操作工藝。

性能參數(shù)：

一類不能被直接控制的外在變量或結(jié)果，但通過控制在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)可達(dá)到預(yù)期結(jié)果的

外在參數(shù)。（又稱，性能屬性）

板框：

一種由折疊的膜板和支撐框架構(gòu)成的膜組件。

孔徑：

過濾介質(zhì)中的細(xì)孔的直徑大小，是判定一個過濾器的過濾能力的特征參數(shù)。

孔徑分布：

用于確定過濾介質(zhì)中平均孔徑及細(xì)孔尺寸范圍的參數(shù).

多孔性：

孔占據(jù)的體積與膜的總體積的比率。

回收率：

包括濾液和截留量在內(nèi)所有最終產(chǎn)物中溶質(zhì)的質(zhì)量與進(jìn)料溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量之比，以

百分?jǐn)?shù)表示?！緞e名，收率】

截留液：進(jìn)料液濃縮去濾液后得到的濃縮液體?！居侄[，濃縮液】

截留壓力：

切向流過濾系統(tǒng)工作時，在截留側(cè)出口處測得的壓力.

截留因子：

1減去濾液中組分i的濃度（Ci/f）與進(jìn)料液中組分i的濃度（Ciib）的比值，如以下方

程：

R=1-[Cij/Ctb]

當(dāng)R=0,溶質(zhì)無截留；

當(dāng)R=1,溶質(zhì)全截留

【又稱，攔截因子，攔截系數(shù)】

反滲透：

反滲透的基本原理是通過截留無機鹽達(dá)到分離目的。因反滲透膜的孔徑在顯微鏡下難

以觀察，所以孑LS大小對反滲透的影響不大。反滲透常用于海水淡化。

剪切速率：

流體的流動速率相對于管道半徑的變化速率。當(dāng)流體呈層流狀態(tài)時，剪切速率與流體

切線速率成正比，與管道的高度或直徑成反比（一般TFF情況下）

篩分系數(shù)：

濾液中組分i的濃度（Gf）與進(jìn)料液中組分i的濃度[Cilb）的比值

S=Ci,f/Ci,b

當(dāng)s=l,溶質(zhì)可自由擴散，且分子量較小，

當(dāng)s=0,溶質(zhì)全截留

【同義詞，轉(zhuǎn)運，產(chǎn)品轉(zhuǎn)運】

攪拌型反應(yīng)器過濾：

切向流過濾的變形，通過在進(jìn)膜處增加一定的攪拌代替剪切速度。傳統(tǒng)的攪拌以機械

攪拌為主，如設(shè)置攪拌槎或葉輪等。

切向流過濾：

切向流過濾是指液體流動方向與過濾方向呈垂直方向的過濾形式。（詳見3.0節(jié)）

【又稱，錯流過濾】

吞吐量：

液體透過單位膜面積的容積?！就x詞，膜的容量】

跨膜壓力（TMP）:

進(jìn)料液的平均壓差與濾液壓差的差值。

超濾：

在壓力驅(qū)動下，小分子溶質(zhì)透過半透膜，大分子溶質(zhì)被截留的膜過濾方式。

速度：

液體在垂直于管道橫截面方向上的切線速率。

粘度：

在剪切力的作用下，液體流動特性改變，并產(chǎn)生內(nèi)部阻力的性質(zhì)。

3.0切向流過濾在生物工藝中的應(yīng)用

在過去的20年里，重組蛋白在醫(yī)療領(lǐng)域上的應(yīng)用迅速擴大。截止2004年，重組蛋

白藥物的使用量已達(dá)到1000噸。目前重組蛋白藥物已被廣泛用于治療炎癥,腫瘤，代

謝和神經(jīng)類疾病，因而蛋白分離技術(shù)在提高人類疾病治療的效率上起著至關(guān)重要的作

用。

切向流過濾技術(shù)非常適用于生物分子的分離，最主要的原因是：

?常溫條件下反應(yīng)，只要通過施加適當(dāng)壓力即可達(dá)到分離的目的

?系統(tǒng)密閉性良好

?無需添加化學(xué)試劑

?無相變過程

?系統(tǒng)可控性良好

膜過濾技術(shù)可按作用條件分為不同的種類，其中切向流過濾技術(shù)（TFF）較其他過濾

方式更適用于濃縮，滲濾或澄清。不同于傳統(tǒng)過濾模式的是，TFF中液體的流動方向

垂直于其過濾方向,避免溶質(zhì)在膜表面形成死端。在,專統(tǒng)的死端過濾中，截留溶質(zhì)持

續(xù)堆積在膜表面形成偏振層或濾餅，嚴(yán)重地限制了膜的吞吐量，而TFF這種錯流過濾

作用，可及時沖刷膜表面截留的溶質(zhì)，減少溶質(zhì)在膜表面的堆積，從而提高膜的吞吐

量。因而傳統(tǒng)的膜過濾形式較適用于稀溶液的過濾，如降低微生物限度，無菌過濾，

除熱原等。（1”1）

目前切向流過濾中應(yīng)用的微濾膜和超濾膜多為孑宙分布不對稱的各向異性聚合膜。

超濾膜具有選擇透過性，其厚度一般lpms孔徑略大于其厚度，呈多孔型折疊結(jié)構(gòu)，

其中，多孔結(jié)構(gòu)使濾膜具有選擇透過性，折疊的結(jié)構(gòu)布局為其提供了結(jié)構(gòu)上的支撐（7）。

不同孔徑范圍的濾膜均可用于切向流過濾，其中，微濾膜的孔徑范圍為0.05-lOpm,

常用于溶液的澄清；超濾膜的孔徑范圍為l-50nm,常用于分子量截留。（NMWCO）。

超濾膜常用于離子交換,濃縮及除熱原。（除熱原大多采用常規(guī)過濾而非切向流過濾，

因而本文不作詳細(xì)介紹）。TFF的應(yīng)用較廣泛，本文主要對其中幾種常見的應(yīng)用作詳

細(xì)的介紹。圖3.0-1-3.0-3為切向流過濾中常用的幾種濾膜的微觀結(jié)構(gòu)圖。

圖3.0-2非對稱超濾膜：泡沫型結(jié)構(gòu)

圖3.0-3各向異性超濾膜：指型結(jié)構(gòu)

3.1TFF的操作工藝

TFF的典型應(yīng)用有產(chǎn)物的濃縮，滲濾（離子交換），澄清，細(xì)胞或破碎細(xì)胞組分的分

離，多組分溶液的分儲等，詳細(xì)描述見下文。

3.4節(jié)中詳細(xì)描述了不同控制模式下TFF工藝的應(yīng)用。調(diào)節(jié)跨膜壓力為最常用的控制

手段；澄清和分儲操作中常通過調(diào)節(jié)溶液的流量以控制濾液的濃度和防止邊界層堵塞。

3.1.1濃縮

通過減少溶液的體積以提高溶質(zhì)的濃度的過程稱為濃縮，篩分系數(shù)越?。ń亓袅吭?/p>

大），濾膜濃縮效果越好。貯罐中料液以間歇進(jìn)料或分批進(jìn)料的方式進(jìn)入過濾器，通

過不斷除去濾液以達(dá)到濃縮的結(jié)果。濃縮的效果常用初始進(jìn)料體積與滲余物的體積的

比率一濃縮系數(shù)（CF）來表示。

分批過濾后目的產(chǎn)物的最終濃度為：

1S

C/CO=CF-【式1】

其中，

C為溶質(zhì)濃縮后的理論濃度；

Co為溶質(zhì)的起始濃度

S為篩分系數(shù)或濾液濃度與進(jìn)料濃度的比值（12）

3.1.2滲濾

從字面意思上理解，滲濾為透析和過濾的結(jié)合，溶液與透析液中的離子透過濾膜進(jìn)

行離子交換的過程稱為滲濾。例如，溶液與緩沖液中離子通過超濾膜進(jìn)行互換；透過

微濾膜，從生長培養(yǎng)基中篩選出菌體細(xì)胞并洗去雜質(zhì).操作時，以恒定速率向濾膜一

側(cè)不斷補加緩沖液，雜質(zhì)不斷被洗出，洗出的雜質(zhì)種類越多，產(chǎn)品的純度越高，分離

效果越好。當(dāng)溶液與緩沖液的滲透速率相等時，滲濾液（截留液）體積恒定不變。通

過不斷加入新鮮緩沖液,產(chǎn)物的濃度逐漸增大，雜質(zhì)不斷被洗出。

當(dāng)滲濾液（截留液）的體積恒定不變時，溶質(zhì)的最終濃度為：

C/Co=e-NS【式2】

其中，N為體積系數(shù)（DV）（12）

滲濾過程中產(chǎn)物一側(cè)的PH值和電導(dǎo)率會有所變化，為確保產(chǎn)物的穩(wěn)定性，滲濾后應(yīng)

盡快將產(chǎn)物送至后續(xù)工序。為節(jié)省緩沖液的量，滲濾一般安排在濃縮之后進(jìn)行。值得

注意的是，蛋白質(zhì)的濃度過高時，系統(tǒng)允許通過的最大錯流速度會相對減小，因而，

滲濾過程中蛋白質(zhì)的濃度，錯流速率，濾液通量，膜面積等參數(shù)存在最大峰值

(13,14,15)

O

3.1.3澄清/固液分離

澄清是指從產(chǎn)品溶液中分離細(xì)胞碎片和其他顆粒物的過程。錯流微濾是一種有效分離

發(fā)酵培養(yǎng)液中分離細(xì)胞或破碎細(xì)胞的方法。靶蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)被大量表達(dá)后，通過

將細(xì)胞培養(yǎng)液過濾濃縮獲得高濃度菌懸液。再往菌懸液添加裂解液，促使細(xì)胞釋放產(chǎn)

物，由此獲得的裂解細(xì)胞液在經(jīng)過錯流微濾或超濾后可分離得到純度較高的靶蛋白。

在此過程中，雖然可以通過改變膜的物化性質(zhì)或控制孔徑來避免結(jié)垢，但仍會有部分

細(xì)胞碎片吸附在濾膜上。。0)同樣的，當(dāng)靶蛋白被表達(dá)至胞外時，也可通過切向流微

濾的形式分離靶蛋白和宿主細(xì)胞，而不同的是，在此過程必須要保證細(xì)胞的完整性，

若細(xì)胞在此過程中裂解,其裂解物會影響靶蛋白的純度。此過程可通過選擇合適的進(jìn)

料泵和控制管道尺寸方式減少細(xì)胞的裂解)。

3.1.4可溶性物質(zhì)的分離

膜分離技術(shù)也可應(yīng)用于除熱原及大小不等的生物藥品的分離?；诋a(chǎn)品和可溶性污染

物的篩分系數(shù)的差異,一般選用孔徑為5-20KD的濾膜，徹底將熱原阻隔在膜外，小分

子物質(zhì)及溶劑透過濾膜滲出，從而達(dá)到分離的目的。

3.1.5灌注

灌注是在切向流過濾的基礎(chǔ)上，除去含產(chǎn)物蛋白的原生長培養(yǎng)基，同時又不斷補加新

鮮培養(yǎng)基以達(dá)到分離第白質(zhì)產(chǎn)物和細(xì)胞的一種方法。灌注分離具有成本低，細(xì)胞密度

大，介質(zhì)成分的利用率高，生物反應(yīng)器的規(guī)模小，在細(xì)胞內(nèi)的停留時間短，產(chǎn)物不易

被降解等優(yōu)點”6),因而，灌注分離是最適用于攪拌式生物反應(yīng)器的蛋白質(zhì)分離方式。

此過程需要控制培養(yǎng)基的移除及添加速率以保持培養(yǎng)基的體積恒定。

在灌注過程中，細(xì)胞隨含產(chǎn)物蛋白的原生長培養(yǎng)基進(jìn)行膜過濾后返回培養(yǎng)基中繼續(xù)培

養(yǎng)。灌注中使用的微濾膜組件在使用前必須經(jīng)過無菌或滅菌處理。此外，鑒于灌注分

離中細(xì)胞為生長中的活細(xì)胞，因而在對高密度細(xì)胞液進(jìn)行過濾及設(shè)計微濾系統(tǒng)時應(yīng)考

慮盡量避免對細(xì)胞造成損傷。

3.2TFF的操作模式

結(jié)合實際應(yīng)用，切向流過濾系統(tǒng)具有多種不同的操作模式，但不管是哪一種模式，其

基本原理都是一致的：溶液的流動方向與膜的表面相互平行，進(jìn)料速度垂直于過濾速

度，由此形成錯流以減少溶質(zhì)在膜表面的堆積。上文提到的分離方法均可結(jié)合切向流

過濾技術(shù)使用。

操作系統(tǒng)應(yīng)根據(jù)以下條件選用合適的操作模式：，

?作業(yè)規(guī)模

?反應(yīng)容器的大小

?操作經(jīng)驗

?設(shè)備的選擇和使用情況

?結(jié)合實際運行情況（如，預(yù)測濃度，處理量范圍，泵的靈敏度，作用時間要求，

熱傳遞和物料衡算等）

上述操作模式均采用流加補料或分批補料的形式，其他補料形式的相關(guān)敘述見下文。

3.2.1單向過濾

料液通過泵的作用上膜過濾，截留液被輸送至貯罐收集或直接進(jìn)入純化工藝的下一工

序的過濾方式稱為單向過濾，可用于間歇式或連續(xù)處理。單向過濾廣泛用于水的淡化：

通過反滲透作用截留無機鹽以獲得純化水的過程。單向超濾和微濾可用于少量雜質(zhì)及

微生物的分離，然而，這些系統(tǒng)在操作時往往會形成死端，截留線完全關(guān)閉，以至于

全部進(jìn)料液透過濾膜。

單向過濾系統(tǒng)的設(shè)計相對較復(fù)雜，尤其在系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化率較大，也即是進(jìn)料量較大時，

流體透過濾膜時的瞬時粒子濃度和平均流速均處于變動狀態(tài)。流體的流速越慢，系統(tǒng)

的傳質(zhì)系數(shù)越??；流體內(nèi)粒子濃度越大，進(jìn)料溶液濃度越大，濃縮驅(qū)動力越小，因而

通過調(diào)節(jié)流體的流速和濃度可達(dá)到調(diào)節(jié)通量的目的（口）。

Figure3.2.1-1Single-PassOperation

Backpressure

Contro向ve

Permeate

Stream

3.2.2批處理和流加處理

批處理是指預(yù)過濾料液在壓力泵作用下從貯罐分批運送至過濾器中，過濾后截留液重

新回流至貯罐中，如此循環(huán)過濾的過程。因而，與單向過濾相比，批處理產(chǎn)生的濾液

量要少得多。隨著過濾次數(shù)的增多，貯罐中料液的濃度逐漸增大，從而導(dǎo)致過濾通量

逐漸減少。相比于其他過濾模式，批處理具有操作簡單，易操作（手動或自動操作），

硬件要求低等優(yōu)勢。批史理最大的缺點是，進(jìn)料貯罐的體積越大，過濾操作是料液越

容易冷卻沉降，因而如何控制料液的溫度和勻稱度是設(shè)計貯罐時首要考慮的因素。除

此以外，進(jìn)料貯罐的容積也會影響最終濃縮液的收率（7）。

Figure3.2.2-1Fed-BatchOperation

Backprossuro

Cont2l

fermeate

Stream

Membrane

Recirculatbn

Module

Pump

流加處理系統(tǒng)是在傳統(tǒng)分批處理系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，增加循環(huán)貯罐用于收集截留液的一種

變型應(yīng)用。這種配置方式為截留液提供一個良好的混合環(huán)境，減少截留液的堆積，從

而提高濃縮驅(qū)動力，彌補了批處理的不足。然而，在這種處理模式下，產(chǎn)物濃度較高,

處理時間更長，溶液所受的剪切力更大，容易導(dǎo)致細(xì)胞裂解，蛋白質(zhì)變性或發(fā)生聚合

作用

3.2.3恒體積過濾

進(jìn)料速度與出料速度相等，操作過程中系統(tǒng)處于恒體積狀態(tài)的過濾模式稱為恒體積過

濾（10）0當(dāng)截留液濃度達(dá)到最大值，截留液終止循環(huán)，打開截留開關(guān)，截留液進(jìn)入下

一工序，此時通量最小。通過增加操作次數(shù)可以有效的提高過濾收率，但會增加機械

和控制系統(tǒng)的復(fù)雜性。當(dāng)操作系統(tǒng)規(guī)模較大時，選用恒體積過濾模式可節(jié)省電源線路。

Figure3.2.3-1FeedandBleedOperation

Ftow

3.3TFF組件及配置

影響TFF系統(tǒng)性能的主要因素有操作模式，過程控制，膜的化學(xué)性質(zhì)和膜的結(jié)構(gòu)。

TFF運行系統(tǒng)的主要配置包括壓力泵，貯罐，管道，閥門，分析儀器和特定的TFF膜

組件。

使用膜組件的優(yōu)點有：

?分離料液和濾液；

?優(yōu)化膜性能，增強膜的機械性能；

?保證溶質(zhì)質(zhì)量傳遞，減少壓力損失；

?調(diào)節(jié)膜的裝填密度

本文將就生物藥物生產(chǎn)工藝中常用的幾類膜組件展開詳細(xì)討論，其他配制組件（如，

管道式，陶瓷膜，動態(tài)膜等）則不作詳細(xì)介紹。

3.3.1卷式濾板與板框

卷式濾板是由多個平面膜和隔板組裝成的一個框架，其卷式回旋結(jié)構(gòu)可最大限度的縮

小過濾器的表面積（如圖3.3.1-1）。在卷式濾板中，液體穿梭于兩張彼此相對的平行的

膜之間，也就是說，相鄰的兩張膜，濾液側(cè)與濾液側(cè)用對，進(jìn)料側(cè)與進(jìn)料側(cè)相對，膜

面與膜面之間是相對的，由此達(dá)到分離上游進(jìn)料液和下游濾液的目的。每張膜的濾液

側(cè)均設(shè)置有多孔隔板，防止進(jìn)料側(cè)膜面與濾液側(cè)膜面接觸。通過劃分不同的過濾平面

和設(shè)置拿流可達(dá)到提高進(jìn)料液通量的目的。

Figure3.3.1>1SchematicDescriptionofFlowPathsinCassetteModules

板框是一種由濾膜附著的空心濾板與實心隔離板交替排列的裝置。隔離板表面可設(shè)置

為光滑表面，也可做成粗糙平面利于產(chǎn)生紊流。板框過濾系統(tǒng)通常是開放的，液體在

膜組件內(nèi)的流動狀態(tài)可為層流或湍流。

常用板框材料有不銹鋼，丙烯酸酯和聚颯三種，目前過濾器大多選用不銹鋼材質(zhì)，板

與框之間填充壓縮過濾介質(zhì)形成密封組件，各組件間以軸桿連接，兩側(cè)板框以外板固

定。沿著軸桿方向，可向T則外板施加壓力，推動板椎向另T則壓濾，亦可同時向推

動兩側(cè)外板框施壓，推動板框向中間壓濾。

3.3.2中空纖維膜

中空纖維膜是由多根聚合纖維（纖維數(shù)量一般在10-50000間）組成的，兩端以環(huán)氧

樹脂、氨基甲酸甲酯或其類似物密封的束狀膜組件。中空纖維膜的兩端為開放式管腔

（管側(cè)），管內(nèi)布置與殼管式換熱器相似。操作時，料液自纖維管內(nèi)沿半徑方向向外

擴散過濾，小分子流出，大分子被截留于管內(nèi)。該組件具有單一的進(jìn)出口，進(jìn)料口與

濃縮物出口分別位于管筒兩個對立面上，兩側(cè)各設(shè)一個濾液出口。中空纖維裝置可以

實現(xiàn)高密度填充，在同等體積條件下，表面積與體積比達(dá)到最大值。中空纖維的內(nèi)徑

較?。ㄒ话阍?.5?2mm）,可在較低的進(jìn)料流速下實現(xiàn)高效傳質(zhì)。由于中空纖維的架

構(gòu)無需外力支撐，因而可通過反沖洗法（沖洗方向與濾液流動方向相反）防止料液堵

塞孔隙。

Figure3.3.2-1ExampleofaTypicalHollowFiberCartridge

3.3.3螺旋筒

螺旋筒組件是由多組多孔平面膜組成的，以螺旋狀纏繞，自上游到下游分布，形似

磁帶盒的膜過濾組件。進(jìn)料側(cè)通過設(shè)置隔板限定進(jìn)料路徑、流向和徑高，多孔型架構(gòu)

為膜組件提供支撐力，濾液通過組件中央的收集管排出。如圖3.3.3-1所示,組件中濾

膜成夾心狀分布，并于前三層膜邊沿處形成封鎖，濾液從邊沿處分離滲出。膜夾層的

第四層與多孔濾液收集管連接，濾膜繞收集管盤纏螺旋，成螺旋狀分布。螺旋膜組件

外殼為不銹鋼或塑料筒管。

如圖3.3.3-1所示，進(jìn)料液（1）從螺旋筒的一端進(jìn)入，切向流（3）沿著組件中軸方

向流動，滯留物從另一端排出。濾液流（2）沿垂直于螺旋方向流向中心收集管排出。

Figure3.331SpiralCartridge

UxrcncMttrtire

3.4TFF的運行控制手段

TFF的運行控制手段有好幾種，下文就其中常用的兩種方法進(jìn)行討論：

維持恒定的跨膜壓力（TMP）是控制組件運行過程的有效手段，TFF過濾中對TMP

的定義為：

p

'Fillrate

一2【式3】

其中，

「560￡1=膜組件進(jìn)料壓力

PRetentate=膜組件的出口壓力

「尸口1同0=濾液流出痣膜時的壓力

囚控制過程只需用到壓力表監(jiān)測，囚此控制TMP是最簡單有效的一種控制手段。需

要注意的是，過濾過程中的通道壓力一直處于變動狀態(tài)，因而方程中的壓力值為“平

均值"（10）。通過控制進(jìn)料流速可以調(diào)節(jié)進(jìn)料壓力，調(diào)節(jié)截留液閥門位置可以穩(wěn)定截

留液的出料壓力。

通過檢驗濾膜對蛋白質(zhì)的截留量、截留蛋白的分子量和濾液的通量可以對TMP和再

循環(huán)速率進(jìn)行優(yōu)化設(shè)置。增大進(jìn)料液的通量可以增大濾液的進(jìn)料速率，但此過程需要

增加泵的功率。濾液的通量通常受限于溶液極化濃度和TFF系統(tǒng)壓力的大小，但可通

過提高TMP的值從而增大通量。

當(dāng)處理易結(jié)垢或易堵塞液體時,如敏感性液體，若濾液通量無顯著下降趨勢，則難以

維持較大的TMP值。因此，在過濾敏感性液體時，濾液通量一般設(shè)為恒量（可控）以

達(dá)到最佳吞吐量。這種操作模式下，通過壓力泵調(diào)節(jié)濾液通量或設(shè)置流量閥控制濾液

流速可間接調(diào)控TMP的值。

4.0設(shè)備確認(rèn)（EQ）

在藥品生產(chǎn)的過程中，任何設(shè)備或系統(tǒng)在安裝和正式使用前都必須經(jīng)過合理的審評和

確認(rèn)。為了保證系統(tǒng)的操作和使用性能，一般將系統(tǒng)確認(rèn)分為三個階段：安裝確認(rèn)

（IQ）,運行確認(rèn)（0Q）,和性能確認(rèn)（PQ）。

設(shè)備確認(rèn)是證明設(shè)備是適合其預(yù)定用途，保證產(chǎn)品在生產(chǎn)和臨床試驗階段中（I、II、

III期臨床試驗階段）符合cGMP要求的必要措施。

本章節(jié)主要分析TFF系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)備確認(rèn)的前提條件，并討論不同配置的TFF系統(tǒng)進(jìn)

行設(shè)備確認(rèn)的難易程度。不同配置的關(guān)鍵設(shè)備在使用前必須明確其使用目的和功能以

確保該設(shè)備可達(dá)到預(yù)定的用途。

4.1設(shè)備確認(rèn)的前提

根據(jù)不同預(yù)定用途，TFF系統(tǒng)可被設(shè)計、配置成不同的組合件,不同組合的原理詳見

本報告第3節(jié)。在對設(shè)備進(jìn)行調(diào)試?口確認(rèn)，制定和執(zhí)行測試方案前也應(yīng)結(jié)合該設(shè)備的

設(shè)計原理。

在對TFF系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)備確認(rèn)前，一般要求設(shè)備有工廠驗收測試（FAT）和現(xiàn)場驗L攵測

試（SAT）合格的背景。這些重要的調(diào)試需要在供應(yīng)商發(fā)貨前或設(shè)備驗收安裝后正式投

入使用前完成。進(jìn)行FAT和SAT測試主要是為了確保：

?設(shè)備的功能可滿足用戶的預(yù)定需求；

?保證TFF系統(tǒng)可安全正常運行；

?設(shè)備已完成所有預(yù)定程序和機械調(diào)試

FAT和SAT測試所得的數(shù)據(jù)一般會與預(yù)定的驗收標(biāo)準(zhǔn)有一定的偏離。若測試過四

作和記錄得當(dāng)，F(xiàn)AT/SAT測試結(jié)果可用于安裝和運行確認(rèn)，以簡化后續(xù)驗證程序。

4.2TFF系統(tǒng)操作注意事項

TFF系統(tǒng)運行時需考慮的因素需根據(jù)其配置而定。TFF系統(tǒng)可以是簡單的臺式操作系

統(tǒng)，也可是復(fù)雜的、特定的自動化系統(tǒng)。簡易的TFF系統(tǒng)包含過濾操作所需的全部組

件，且可以手動操控，因而簡易的TFF系統(tǒng)可以作為一個單獨的結(jié)構(gòu)單元完成性能確

認(rèn)。復(fù)雜的TFF系統(tǒng)可能包含不同的單元系統(tǒng)，因而復(fù)雜的系統(tǒng)可以作為一個整體結(jié)

構(gòu)完成確認(rèn)，也可分別每個單元系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)。自動化操作也是對TFF系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)

時需要考慮的影響因素（洱19）。

TFF系統(tǒng)中用于存儲、運輸或收集產(chǎn)品的容器具必須符合使用要求，包括容器具的容

積，使用溫度，發(fā)泡程度，混合要求以及消毒或滅菌等（必要時）。

TFF系統(tǒng)運行時涉及的關(guān)鍵和非關(guān)鍵的公用系統(tǒng)必要時也需進(jìn)行確認(rèn)，以確保公用系

統(tǒng)符合TFF系統(tǒng)的要求?，F(xiàn)有的公用設(shè)施應(yīng)定期進(jìn)行檢查，保證其具有擴展的空間。

4.3設(shè)計注意事項

TFF系統(tǒng)在設(shè)計時需考點預(yù)期工藝操作和其他條件下產(chǎn)生的壓力等影響因素，保證系

統(tǒng)具備承受生產(chǎn)中產(chǎn)生的壓力。常見的影響因素包括系統(tǒng)的再生和過濾能力、彈性相

容性以及系統(tǒng)的可操控性?？紤]到對系統(tǒng)的沖擊力和清潔性，選擇規(guī)格合適的部件至

關(guān)重要。若系統(tǒng)中包含再循環(huán)系統(tǒng)和濾液泵，則必須保證具能提供就地清洗（CIP）所

需的流速，且在處理過程中無額外剪切力的產(chǎn)生。根據(jù)的使用目的，系統(tǒng)中若有額外

附加閥門、儀表和管道的，需要考慮對濾膜完整性測試、蒸汽、清潔及其他配置遂行

確認(rèn)。

在某些應(yīng)用中，再循環(huán)系統(tǒng)中用于混合的容器要求具有均一性。該系統(tǒng)的設(shè)計還須保

留有足夠的空間供氣體流動，尤其是對于那些結(jié)構(gòu)復(fù)雜而又需要進(jìn)行就地蒸汽滅菌

（SIP）操作的系統(tǒng)。作為系統(tǒng)的核心模塊，過濾器的形態(tài)，數(shù)量和布置必須足以克服

流體流動過程產(chǎn)生阻力，保證組件內(nèi)液體具有足夠大的通量。選擇合適的儀器和安裝

地點是實現(xiàn)有效控制和過程監(jiān)控的重要前提。通常，儀器的使用壓力被定義為接近過

濾裝置在實際工作空間環(huán)境下所能承受的壓力范圍。在TFF系統(tǒng)的實際操作、確認(rèn)和

驗證中，都必須考慮到上述及其他因素的影響。

4.4安裝確認(rèn)

IQ（安裝確認(rèn)）是證明TFF系統(tǒng)符合設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)、制造商建議和客戶要求的確認(rèn)證明。

IQ可證明：

?所有外在設(shè)備均正確安裝

?系統(tǒng)的安裝位置適當(dāng)

?系統(tǒng)所需的關(guān)鍵公用設(shè)備（例如，注射用水【W(wǎng)FI］，純化水，潔凈蒸汽,壓縮空

氣，室內(nèi)空氣等）的數(shù)量及質(zhì)量符合要求且都正確連接

?調(diào)試和小試數(shù)據(jù)尢誤

組成一個TFF系統(tǒng)的各個組件都必須進(jìn)行評估確認(rèn)（即類型，制造商，包括泵（多

個），管道，儀表，控制系統(tǒng)，容器支架及膜組件）.用于維持系統(tǒng)操作性能的化學(xué)

添加劑及結(jié)構(gòu)也需進(jìn)行確認(rèn)（例如，泵的潤滑劑，用于薄膜儲存、運輸和清潔的架構(gòu)

等）。

4.5運行確認(rèn)

0Q（運行確認(rèn)）與IQ一樣，是證明TFF系統(tǒng)在正莒工作中滿足預(yù)期操作范圍和功能

的要求的書面確認(rèn)。在實際操作允許的情況下，應(yīng)盡量擴大系統(tǒng)的操作范圍，以適應(yīng)

未來工藝的要求。測試的重點應(yīng)放在系統(tǒng)的功能規(guī)格和客戶的要求上。當(dāng)在現(xiàn)有系統(tǒng)

上引進(jìn)新工藝時,所有的控制參數(shù)的操作范圍都應(yīng)與工藝要求進(jìn)行核對。

0Q應(yīng)確保系統(tǒng)中所有部件的操作控制方式和處理順序正確無誤。系統(tǒng)的重要工藝參

數(shù)（即，最小及最大處理量，進(jìn)料罐的混合特性，水過濾系統(tǒng)等）在運行確認(rèn)時也應(yīng)

記錄統(tǒng)計。系統(tǒng)進(jìn)行操作性能確認(rèn)時需要測定的參數(shù)可以參照下列例子：

TFF系統(tǒng)的性能

?系統(tǒng)清潔

?系統(tǒng)沖洗

?系統(tǒng)密封性測試

?濾膜的透水性

?濾膜的完整性測試

?產(chǎn)品濃度或體積降低

?滲濾（離子交換）

?產(chǎn)品收率

TFF運行測試

?再循環(huán)速率的監(jiān)控

?溫度監(jiān)控

?TMP監(jiān)控*

?濾液流量的監(jiān)控*

?濾液的混合情況

?滲濾時料液罐內(nèi)液位的控制

?系統(tǒng)運行的最小容積的測定

?系統(tǒng)運行的最大容積的測定

*一般來說，TFF系統(tǒng)在設(shè)計時只會選擇跨膜壓力和濾液流量其中一個變量進(jìn)行控制。

4.6性能確認(rèn)

性能確認(rèn)（PQ）是表征設(shè)備和輔助系統(tǒng)滿足已生效的工藝規(guī)程要求且連接有效，可

重復(fù)利用的書面證明（6）。PQ可與工藝驗證同時進(jìn)行。當(dāng)該工藝要求無菌操作時，PQ

也必須在無菌操作下進(jìn)行。設(shè)備的清潔驗證、重復(fù)使用驗證可以與工藝驗證同時進(jìn)行。

5.0工藝開發(fā)

工藝研發(fā)過程中，進(jìn)行模擬生產(chǎn)時應(yīng)該建立生產(chǎn)過程的工藝要求。（例如，濃縮和滲

濾因子，壓力，流量，膜的安裝位置，工藝的操作時間等）。工藝流程可以根據(jù)現(xiàn)有

設(shè)備及提供的設(shè)計信息進(jìn)行改進(jìn)。

針對TFF系統(tǒng)的使用目的，正式使用前應(yīng)對其進(jìn)行風(fēng)險評估（2。）。對病人影響、工

藝合理性、法規(guī)符合性都需要納入風(fēng)險評估的范圍。在風(fēng)險識別的過程中，TFF系統(tǒng)

各步驟的應(yīng)急處理（即各步驟出現(xiàn)突發(fā)狀況時采取應(yīng)急措施的評估）和工藝順序也需

要納入風(fēng)險評估的范圍內(nèi)。

新工藝開發(fā)前，工藝員必須清楚地了解進(jìn)料溶液和產(chǎn)物的理化性質(zhì)、與半透膜之間的

相互作用。只有徹底掌握了這些信息，才能更專注地完成一個TFF工藝各細(xì)節(jié)步驟的

改進(jìn)，以實現(xiàn)預(yù)期的工藝指標(biāo)。（例如，高收率，合適的緩沖液或雜質(zhì)洗脫液，溶液

的澄清度或純度等）。對TFF進(jìn)行工藝開發(fā)時必須確立穩(wěn)定的工藝參數(shù)以滿足后續(xù)工

藝驗證的要求。

工藝開發(fā)流程包括：

?濾膜及組件的選擇

?系統(tǒng)各操作單元的設(shè)計，包括泵，容器，管道，鋪助設(shè)備和操控設(shè)備

?操作參數(shù)的確定

?工藝鑒定及穩(wěn)定性研究

5,1膜的適用性

改善TFF工藝的第一步就是要選擇合適的濾膜。超濾膜的組成材料多為高分子聚合物。

其中，某些高分子材料具有表面改性，有助于提高超濾膜的操作性能。常用于生物制

品過濾的濾膜材料有聚醛礪，再生纖維素，聚丙烯和聚偏二氟乙熔。除了選擇適合的

材質(zhì)以外，選用合適的標(biāo)準(zhǔn)孔徑，改變過濾器的幾何閡架（例如，平片狀、管狀或中

空纖維）或改變液體的流道間距也可提高濾膜的過濾性能。在操作無誤的前提下,濾

膜的結(jié)垢情況和/或產(chǎn)品收率可作為評價上述參數(shù)對TFF操作性能的影響指標(biāo)。例如，

膜的孔徑大小、孔的分別和膜的表面特性都會直接影響到產(chǎn)品和/或雜質(zhì)的流出速率。

膜需要定期清洗，以確保其正常運行。在選擇清潔劑時應(yīng)選用可有效去除殘留物，且

不會影響膜的性能的清潔劑。此外，在每次生產(chǎn)前都應(yīng)當(dāng)確保設(shè)備無殘留清潔劑。

表面活性劑可保護(hù)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，減少其在氣-液分界層的降解，因其可有效控制生物

發(fā)酵工藝中泡沫的產(chǎn)生，表面活性劑也常作為消泡劑使用。某些聚合膜的過濾性能常

會受表面活性劑的影響而降低，尤其是疏水性較強的超濾膜（例如，通量降低，溶質(zhì)

滲透率降低等）。考慮到表面活性劑的影響，在選擇表面活性劑的類型，膜的材質(zhì)，

膜的孔徑和操作溫度時應(yīng)仔細(xì)分析后選擇，減少對系統(tǒng)操作參數(shù)的影響。表面活性劑

可附著到濾膜的表面，因而在生產(chǎn)后應(yīng)充分除去殘留的表面活性劑，保證不會影響后

續(xù)生產(chǎn)批次的產(chǎn)品質(zhì)量。

不管是為于維持膜的結(jié)構(gòu)還是避免殼體損壞濾膜，過濾器在物理或機械設(shè)計上的限制

是影響過濾組件可承受的最大壓力和最大流量的主要因素。關(guān)于各種濾膜和膜組件的

最大操作范圍等詳細(xì)信息可向供應(yīng)商索取。

溶液的PH值，過濾溶質(zhì)，溫度，接觸作用時間，清潔情況和溶液殘留情況都會影響

聚合膜的降解速度。選攔透過性濾膜可以提高過濾的通量和減少結(jié)垢現(xiàn)象，但容易在

反復(fù)清洗的過程中受損。供應(yīng)商可為顧客提供濾膜的適用條件、清洗注意事項和儲存

條件等信息。若所選濾膜不適用于現(xiàn)有操作系統(tǒng)，則在工藝開發(fā)完成前必須更換合適

的濾膜。盡管可將濾膜預(yù)設(shè)為一種與推薦的清潔劑、消毒劑，整個膜組件，包括外殼、

粘合劑和連接組件完全兼容的特定結(jié)構(gòu)，在實際使用中系統(tǒng)也可能會出現(xiàn)不兼容的情

況。改變膜的形態(tài)也會影響膜在使用過程中的結(jié)垢程度。在選擇膜組件時需充分考慮

上述因素的影響。

5.2產(chǎn)物截留量和通量

TFF工藝的開發(fā)，也包括優(yōu)化產(chǎn)物截留量和通量。產(chǎn)物最小截留量（即產(chǎn)品的高諦分

或傳送）必須滿足細(xì)胞澄清需要（詳見5.2.1）。產(chǎn)物的定量截留適用于濃縮和滲濾兩

個流程（詳見5.2.2）。在這兩種情況下，實現(xiàn)處理通量的最大化也是工藝開發(fā)的一個

重點。這兩類流程可在實驗室規(guī)模下進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。

5.2.1細(xì)胞澄清

TFF的主要應(yīng)用之一是用于細(xì)菌、酵母和哺乳類動物細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)過程產(chǎn)生的分泌

物或水溶性產(chǎn)物（一般為大分子產(chǎn)物或蛋白質(zhì)）的分離回收。澄清操作大多采用孑瘡

在0.1-0.65klm的中空纖維，管狀或平面狀（卷式或板框）微濾膜。優(yōu)化TFF澄清步

驟的重點是在盡可能地減少結(jié)垢和在通量恒定的條件下優(yōu)化高分子產(chǎn)物的膜內(nèi)流動路

徑。在濾膜潔凈度允許的情況下，產(chǎn)物可高效地透過濾膜，然而，結(jié)垢、孔隙堵塞，

細(xì)胞碎片或雜質(zhì)的附著、積累往往會阻礙產(chǎn)物的過濾，降低濾膜的過濾效率。而濾液

的通量往往會受到膜的材質(zhì)、發(fā)酵產(chǎn)物的組分和操作條件的限制，如膜表面的剪切速

率和TMPe

在對用于澄清哺乳動物培養(yǎng)液的微濾（MF）系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化時，初步的篩選實驗應(yīng)該

保證切向流過濾具有一定的產(chǎn)物通量和滲透率，細(xì)胞濃度梯度大，細(xì)胞存活率高。在

優(yōu)化濾膜負(fù)荷容量、錯流速率和壓力控制過程中TMP（或濾液控制過程中的通量）等

參數(shù)前，應(yīng)保證微濾系統(tǒng)通量及產(chǎn)物滲透率在恒定范圍內(nèi)。通過選用一系列不同孔徑

和化學(xué)組成的微濾膜進(jìn)行過濾操作可評估濾膜的工藝參數(shù)。進(jìn)一步的工藝優(yōu)化包括整

體通量和產(chǎn)物滲透率的優(yōu)化，或其他可優(yōu)化的操作單元。

此外，略微調(diào)整料液流的絮凝劑和改變?nèi)芤旱碾x子組成也可提高微濾系統(tǒng)整體穩(wěn)健性。

改變料液的溶液性質(zhì)可以誘導(dǎo)細(xì)胞核細(xì)胞碎片絮凝，提高濾膜表面組合的傳質(zhì)效率，

從而在一定的濾液通量和流速下降低TMP值。

總而言之，優(yōu)化產(chǎn)物的濾液通量、滲透率和傳質(zhì)效率（即高篩分系數(shù)）都是實現(xiàn)切向

流微濾工藝優(yōu)化中的首要目標(biāo)。

5.2.2超濾濃縮和滲濾

蛋白質(zhì)的超濾工藝可從兩個方面著手開發(fā)：大分子組分滲濾濃度或小分子組分分離用

緩沖液。影響TFF系統(tǒng)性能的主要操作參數(shù)有：

?膜的特性

?進(jìn)料液的組成（如，蛋白質(zhì)濃度，離子組成，濃度等）

?操作溫度

?緩沖液的組成，包括PH值

?壓力分布

?流量

超濾膜的形態(tài)及化學(xué)性質(zhì)可直接影響初始蛋白超濾沉淀過程中蛋白質(zhì)-膜表面間的相

互作用（平衡吸附蛋白質(zhì)）。這種現(xiàn)象可能對TFF處理中的流體的形態(tài)和雜質(zhì)的清除

產(chǎn)生很大的影響。

一般情況下，超濾性能可根據(jù)工藝開發(fā)過程建立的濾液通量（或TFF的允許運行時

間），蛋白質(zhì)產(chǎn)物的回收率，和/或可溶性雜質(zhì)的洗脫情況來評估。為保證工藝產(chǎn)量，

在選擇濾膜時，通常會根據(jù)NMWCO值選用比產(chǎn)品分子量至少小3-5倍的濾膜。雖

然已證實高效切向流過濾（HPTFF）等高等技術(shù)具有更高的分離能力，但這些技術(shù)目

前并未廣泛應(yīng)用于生物制藥行業(yè)（21）。

另一個需要考慮的操作參數(shù)是系統(tǒng)的操作溫度。除了會影響一些生物制劑的穩(wěn)定性以

外，系統(tǒng)操作溫度還是影響溶液的粘度和超濾系統(tǒng)管道、過濾器的組件壓力-流量特性

的主要因素。TFF系統(tǒng)及過濾模塊中潛在的壓力限制也是工藝開發(fā)過程中需要解決的

問題，因而也應(yīng)對進(jìn)料流量,溫度和產(chǎn)物濃度等操作參數(shù)進(jìn)行評估，確定其對過濾模

塊入口壓力的影響。

5.3設(shè)備的設(shè)計和操作注意事項

在TFF系統(tǒng)的工藝開發(fā)和設(shè)計階段中，不管是微濾除細(xì)胞碎片還是超濾濃縮蛋白質(zhì)/

離子交換除雜工序，都會受到預(yù)設(shè)的操作方式和設(shè)備的約束，在小空間或操作窗中操

作。

該工序的操作窗口的大小通常會受系統(tǒng)采用的過濾器模塊所限制。過濾器的物理或機

械限制與過濾器幾何結(jié)構(gòu)、配置的最大承受壓力和流量間存在一定的函數(shù)關(guān)系。不管

是何種類型的過濾器模塊，都有對應(yīng)的額定最大壓力值，具值大小取決于過濾器及組

件的最適操作條件和最適再循環(huán)速率。各種膜和膜組件的約束條件細(xì)節(jié)可向供應(yīng)商索

取。

TFF相關(guān)設(shè)備在設(shè)計時需要考慮容量，動力泵和反應(yīng)功能區(qū)的限制?；谛∫?guī)模的微

濾或超濾的工藝開發(fā)成果，TFF系統(tǒng)在設(shè)計時應(yīng)選用合適功率的泵，過濾面積必須滿

足再循環(huán)系統(tǒng)要求，且跨膜的剪切速率足夠大。在設(shè)計相應(yīng)的設(shè)備時還需要TFF工藝

流程的允許操作時間、對產(chǎn)品質(zhì)量的潛在影響及工廠的工作時間安排。實驗室規(guī)模的

研發(fā)工作也是確立系統(tǒng)操作溫度和清洗方式的重要依據(jù)。該設(shè)備的設(shè)計和使用局限性

（即溫度調(diào)控能力）可能會影響工藝開發(fā)的方向。最后，在進(jìn)行工藝放大實驗時，應(yīng)

當(dāng)對再循環(huán)的混合效果進(jìn)行評估,尤其是在高粘度條件下進(jìn)行滲濾時，TFF的過濾性

能參數(shù)如壓降,濾液的通量，混合效果等都會受到粘度的影響。

5.4切向流過濾的工藝特性

工藝特性（又稱魯棒性研究）是指通過改變工藝的操作參數(shù)以確定其對產(chǎn)品的質(zhì)量和

生產(chǎn)工藝的影響的一系列實蛉數(shù)據(jù)。操作參數(shù)是可直接控制的過程輸入性因素。性能

參數(shù)是可以通過監(jiān)控以確保或確認(rèn)工藝結(jié)果可接受的輸出性因素。操作參數(shù)的定義是

主觀的；由此建議定義，在操作范圍外發(fā)生有效、小范圍或不可預(yù)測的變動時可對重

要產(chǎn)品質(zhì)量造成顯著影響的一系列參數(shù)為"臨界操作參數(shù)二

"關(guān)鍵操作參數(shù)”定義為在小范圍內(nèi)變動和/或難以控制的，且在控制過程中必須的,

但不會影響重要的產(chǎn)品質(zhì)量屬性的參數(shù)。當(dāng)關(guān)鍵操作參數(shù)超出可接受范圍時會影響工

藝的性能（例如，收率或工藝操作時間），但不會影響產(chǎn)品質(zhì)量。

非關(guān)鍵操作參數(shù)是指具有廣泛的可接受限度或易控制的輸入性變量，一般無嚴(yán)格的控

制范圍。非關(guān)鍵操作參數(shù)一般不會對產(chǎn)品質(zhì)量或操作工藝造成影響。

小規(guī)模的參數(shù)研究應(yīng)建立工藝參數(shù)的可接受范圍，作為界定設(shè)計范圍的一部分依據(jù)。

由此獲得的實驗數(shù)據(jù)可作為工藝驗證的預(yù)期結(jié)果和驗收標(biāo)準(zhǔn)。

5.4.1微濾

該操作的目的是通過去除培養(yǎng)液中的細(xì)胞及碎片，獲得高濃度的靶蛋白產(chǎn)物。通過微

濾可提高產(chǎn)物收率和細(xì)胞的聚集度。以下為濾液流控制模式下澄清細(xì)胞培養(yǎng)液的例子

（詳見3.4節(jié)）。在此模式下，TMP值不可控。當(dāng)通過控制TMP值進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)液

澄清操作，操作壓力越大，產(chǎn)品跨膜率越低（即，產(chǎn)品截留液的體積越大），收率越

低。

圖5.4.1-1描述了上述微濾操作中操作和工藝參數(shù)（輸入性和輸出性）的關(guān)系,表

5.4.1-1列舉了這些參數(shù)的測量方法。以下輸入性和輸出性參數(shù)具有典型的分類特征，

但不適用于所有微濾操作。

Figure5.4.1-1ExampleofMicrofiltrationOperationalParametersandPerformanceParameters

INPUTSOUTPUTS

OPERATIONALPARAMETERSPERFORMANCEB\RAMETERS