外源鈣對(duì)低溫下山定子根系氮代謝的影響

氮代謝是高等植物最重要的代謝過程之一，直接影響樹木對(duì)氮素的吸收和同化，影響水果的產(chǎn)量和質(zhì)量。近年來,關(guān)于低溫條件下添加鈣素對(duì)細(xì)胞保護(hù)酶活性以及緩解低溫脅迫的研究很多,但有關(guān)鈣對(duì)低溫條件下氮代謝功能影響的研究較少。因此,本試驗(yàn)以北方地區(qū)常用蘋果砧木山定子為試材,研究低溫條件下鈣對(duì)根系氮代謝的影響。1材料和方法1.1水培試驗(yàn)方法試驗(yàn)于2009年3~7月進(jìn)行,山定子種子經(jīng)層積催芽后,播種到育苗基質(zhì)中,待長(zhǎng)到5片真葉時(shí)挑選生長(zhǎng)一致的幼苗移入裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽(12cm×13cm)中,待根系充滿營養(yǎng)缽時(shí),小心沖洗出根系進(jìn)行水培試驗(yàn)。水培試驗(yàn)于人工氣候箱中進(jìn)行,培養(yǎng)溫度為25℃(晝)和15℃(夜),光照強(qiáng)度400μmol·m-2·s-1,光照時(shí)間12h,相對(duì)濕度70%~80%。處理營養(yǎng)液以Hoagland全營養(yǎng)液為基礎(chǔ)(其中鈣濃度為4mmol·L-1),設(shè)計(jì)4個(gè)鈣濃度處理Ca1、Ca2、Ca3、Ca4,分別添加4mmol·L-1、8mmol·L-1、12mmol·L-1、16mmol·L-1硝酸鈣[Ca(NO3)2]。各處理分別水培一周后轉(zhuǎn)入低溫處理,處理溫度為10℃(晝)和2℃(夜),以始終處在常溫25℃(晝)和15℃(夜)的植株為對(duì)照,分別于低溫處理3d后取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo),每處理10株,所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。1.2氨基酸的提取根系活力采用TTC染色法測(cè)定,蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,游離氨基酸含量采用茚三酮比色法測(cè)定,游離氨基酸種類采用5%磺基水楊酸提取,濾膜過濾后用日立L8800型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。1.3粗酶液的提取硝酸還原酶采用磺胺比色法測(cè)定。取根系0.5g,加入10ml磷酸緩沖液,真空充氣10min,中間放氣2~4次,置于暗室20min,取出后加入30%三氯乙酸1ml,立即振蕩,取浸提液2ml置于試管中,加入1%的磺胺試劑4ml和0.02%的α-萘胺試劑4ml,振蕩搖勻靜置30min,在540nm下測(cè)定其吸光度。按ZhangCF等介紹的方法在根系中提取粗酶液,每克鮮樣加入3ml提取緩沖液。粗酶液用于GS、NADH-GOGAT、NADH-GDH活性測(cè)定。GS活性參照Rhodes等的方法測(cè)定,一個(gè)GS活性單位定義為該反應(yīng)條件下,每分鐘催化形成1μmol的γ-谷氨酰異羥肟酸(γ-glutamylhydroxamate)所需要的酶量。NADH-GOGAT活性采用Singh和Srivastava的方法測(cè)定,以每分鐘反應(yīng)混合液于30℃減少1μmol的NADH為一個(gè)酶活性單位?？侼ADH-GOGAT活性計(jì)算以每分鐘每毫克酶液催化NADH減少多少μmol表示。NADH-GDH活性參照Loulakakis和Roubelakis的方法測(cè)定,GDH活性以每分鐘在30℃下氧化1μmol的NADH為一個(gè)酶活性單位。1.4xyma型氧電極參照Bouma和毛志泉等的方法進(jìn)行測(cè)定,儀器采用英國HANSATECH公司生產(chǎn)的液相OxyLab型氧電極。根系測(cè)定時(shí)取直徑1.5mm左右,長(zhǎng)度約2~3cm的吸收根,用雙面刀將根切成2mm左右根段(0.05g),迅速稱取0.05g放入反應(yīng)杯,加蓋并啟動(dòng)測(cè)量程序。反應(yīng)杯中反應(yīng)液溫度用恒溫浴控制在25℃,每個(gè)處理3個(gè)(株)重復(fù)。1.5磷酸戊糖途徑和酸循環(huán)反應(yīng)緩沖液的合成參照余讓才和潘瑞熾的方法進(jìn)行測(cè)定。糖酵解途徑(EMP)、三羧酸循環(huán)(TCA)和磷酸戊糖途徑(PPP)分別用0.5mol·L-1的NaF、丙二酸和Na3PO4抑制,反應(yīng)介質(zhì)為0.2mol·L-1pH6.8的磷酸緩沖液。每個(gè)途徑測(cè)定3次。2結(jié)果與分析2.1外源鈣對(duì)根系活力的影響如圖1所示,低溫使山定子根系活力降低,與常溫對(duì)照差異顯著,添加外源鈣后山定子根系活力有所增加,添加4mmol·L-1鈣時(shí)根系活力高于對(duì)照,與對(duì)照沒有顯著差異,添加8mmol·L-1鈣時(shí)根系活力雖低于常溫對(duì)照,但仍高于低溫對(duì)照,當(dāng)外源鈣濃度增加到12mmol·L-1和16mmol·L-1時(shí)根系活力降低,與對(duì)照呈顯著差異。2.2外源鈣對(duì)gs活性的影響如圖2所示,低溫降低了山定子根系NR活性,但與常溫相比沒有明顯差異。添加外源鈣能提高根系NR活性,四個(gè)鈣濃度處理根系NR活性均高于低溫對(duì)照和常溫對(duì)照,添加4mmol·L-1鈣處理與低溫對(duì)照呈顯著差異,但各個(gè)濃度鈣處理與常溫對(duì)照均無顯著差異。低溫明顯增加了山定子根系GS活性,與相同處理的常溫對(duì)照呈顯著差異。添加外源鈣與常溫對(duì)照相比均提高了根系GS活性,且增加的幅度與鈣濃度成正比。但添加外源鈣處理與同溫度的對(duì)照相比在低濃度時(shí)降低了根系GS活性,而高濃度時(shí)(16mmol·L-1)GS活性略有增加。添加4mmol·L-1鈣和8mmol·L-1鈣處理與同溫度的對(duì)照呈顯著差異;除添加4mmol·L-1鈣處理外均與常溫對(duì)照差異顯著。由圖2可知,低溫顯著降低了山定子根系NADH-GOGAT活性,與相同處理的常溫對(duì)照差異顯著。添加不同濃度外源鈣對(duì)根系NADH-GOGAT活性的影響不同,但根系NADH-GOGAT活性均低于常溫對(duì)照;與低溫對(duì)照相比,添加4mmol·L-1鈣、添加12mmol·L-1鈣和16mmol·L-1鈣處理根系NADH-GOGAT活性有所增加,但添加8mmol·L-1鈣處理根系NADH-GOGAT活性降低,添加外源鈣處理與相同溫度的對(duì)照相比均沒有顯著差異,但添加8mmol·L-1鈣和添加12mmol·L-1鈣處理根系NADH-GOGAT活性與常溫對(duì)照差異顯著。低溫降低了山定子根系NADH-GDH活性,與相同處理的常溫對(duì)照沒有明顯差異。外源鈣影響根系NADH-GDH活性,添加4mmol·L-1鈣和添加8mmol·L-1鈣時(shí)根系NADH-GDH活性高于低溫對(duì)照,但沒有顯著差異,當(dāng)鈣濃度增加時(shí)根系NADH-GDH活力明顯降低,與其他處理差異顯著。2.3外源鈣在低濃度內(nèi)降低根系gs/3gh比如圖3所示,低溫和外源鈣均未改變山定子根系氮代謝途徑。低溫后根系GS/GDH比值增加,與常溫對(duì)照差異顯著。外源鈣在低濃度內(nèi)降低了根系GS/GDH比值,與低溫對(duì)照呈顯著差異,而與常溫對(duì)照沒有明顯差異;但鈣濃度增加后GS/GDH比值迅速增加,與低溫對(duì)照差異顯著。2.4對(duì)子根系可溶性蛋白質(zhì)含量的影響由圖4可知,低溫降低了山定子根系可溶性蛋白質(zhì)含量,與常溫對(duì)照呈顯著差異。添加外源鈣處理與相同溫度的對(duì)照相比增加了山定子根系可溶性蛋白質(zhì)含量,其中4mmol·L-1鈣處理與低溫對(duì)照呈顯著差異,其余處理與低溫對(duì)照沒有明顯差異。低溫加鈣處理可溶性蛋白質(zhì)含量均低于常溫對(duì)照。由圖5可知,低溫降低了山定子根系游離脯氨酸含量,但與常溫對(duì)照沒有顯著差異。添加鈣處理增加了根系游離脯氨酸含量,其中添加4mmol·L-1鈣處理和8mmol·L-1鈣處理與低溫對(duì)照和常溫對(duì)照均差異顯著。2.5外源加鈣對(duì)根系呼吸速率的影響如圖6所示,低溫降低了山定子根系總呼吸速率,與常溫對(duì)照相比呈顯著差異。外源加鈣處理改變了根系總呼吸速率,4mmol·L-1鈣處理和8mmol·L-1鈣處理增加了根系總呼吸速率,與低溫對(duì)照呈顯著差異;而高濃度鈣處理使根系總呼吸速率降低,與低溫對(duì)照沒有顯著差異,但與常溫對(duì)照差異顯著。2.6外源鈣素對(duì)emp途徑的影響由圖7可知,低溫和外源鈣均未改變山定子根系呼吸途徑,山定子根系呼吸仍然以由EMP進(jìn)入TCA途徑為主。低溫處理后TCA途徑所占比例明顯降低,而EMP途徑所占比例增加,均與對(duì)照呈顯著差異。添加外源鈣素后,EMP途徑所占比例增加,但TCA途徑所占比例有所降低,使EMP途徑明顯高于TCA途徑和PPP途徑所占比例,從而使EMP進(jìn)入TCA和PPP受阻。添加4mmol·L-1鈣處理、8mmol·L-1鈣處理和12mmol·L-1鈣處理根系PPP途徑所占比例均低于低溫對(duì)照,且4mmol·L-1鈣處理和8mmol·L-1處理與低溫對(duì)照呈顯著差異。3結(jié)論和討論3.1ca2+對(duì)植物免疫酶活性的影響鈣是植物體必需的營養(yǎng)元素之一,它對(duì)果樹氮代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)、抗病性的影響已有廣泛報(bào)道。Juanetal.的研究發(fā)現(xiàn)番茄根系NR、NiR、GS、GOGAT、PEPC活性隨溶液中鈣濃度的提高而增加。魯翠濤等研究也表明,不同濃度Ca2+培養(yǎng)后,小麥葉片含Ca2+/CaM-PK的激酶活性上升趨勢(shì)與NR、GS活性上升趨勢(shì)一致,但當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到1mmol·L-1后,酶活性不再持續(xù)升高,說明依賴于Ca2+/CaM-PK的蛋白激酶對(duì)NR和GS具有一定的調(diào)節(jié)作用。近年來研究表明,鈣對(duì)低溫的響應(yīng)很敏感,低溫刺激后細(xì)胞中有個(gè)Ca2+濃度迅速升高的過程,此過程在時(shí)間、機(jī)制上和冷脅迫感應(yīng)過程緊密聯(lián)系,因此,人們推測(cè)Ca2+作為第二信使參與了植物低溫信號(hào)傳導(dǎo),同時(shí)Ca2+還參與植物冷馴化應(yīng)答和快速冷耐受反應(yīng),提高植物對(duì)低溫的抗逆性。本試驗(yàn)結(jié)果表明,添加外源鈣對(duì)山定子根系氮代謝的影響因鈣濃度不同而有差異,添加低濃度鈣可以提高低溫下根系活力、NR、NADH-GOGAT和NADH-GDH活性、可溶性蛋白質(zhì)含量和游離脯氨酸含量,同時(shí)降低根系GS活性和GS/GDH比值,而添加高濃度鈣的結(jié)果與之相反。低濃度鈣對(duì)根系氮代謝活性的影響基本抵消了低溫引起的氮代謝關(guān)鍵酶活性變化,使之接近常溫對(duì)照的水平,對(duì)低溫下根系氮代謝功能有明顯的改善作用,而高濃度鈣處理則表現(xiàn)出對(duì)氮代謝的抑制作用,這與閆童等的研究結(jié)果一致,可能是鈣離子作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)根系起保護(hù)作用,而高濃度鈣可能導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化而引起氮代