1、.：.；國內(nèi)外利用不同受體細(xì)胞開發(fā)生物反響器的研討進(jìn)展情況摘要：利用受體作為生物反響器消費(fèi)外源蛋白,包括抗體、疫苗、藥用蛋白等較之其他消費(fèi)系統(tǒng)具有很多優(yōu)越性植物生物反響器是生物反響器研討領(lǐng)域中的一大類, 是指經(jīng)過基因工程途徑, 以常見的農(nóng)作物作為 化學(xué)工廠， 經(jīng)過大規(guī)模種植消費(fèi)具有高經(jīng)濟(jì)附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類及其他一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的方法 。關(guān)鍵詞：受體細(xì)胞;轉(zhuǎn)基因; 生物反響器；基因藥物一 受體細(xì)胞作為生物反響器一、釀酒酵母是第一個用于基因藥物表達(dá)的酵母菌，遺傳背景已相當(dāng)清楚：有17條染色體，1996年完成其全基因組測序，基因組為12068

2、 kb，閱讀開放開架5887個，編碼約6000個基因，比單細(xì)胞的原核生物和古細(xì)菌大一個數(shù)量級。受體細(xì)胞舉例：釀酒酵母GRF18運(yùn)用1981年釀酒酵母表達(dá)了 第一個外源基因一干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統(tǒng)得到表達(dá)。 FDA同意的第一個基因工程疫苗就是釀酒酵母表達(dá)的乙肝疫苗Merck公司上市產(chǎn)品還有人胰島素丹麥Novo Nordisk公司和人粒細(xì)胞集落刺激因子Immunex公司等 存在問題1、外源基因表達(dá)程度不高。緣由：1密碼子運(yùn)用的偏向性tRNA與外源基因密碼子不匹配2乙醇發(fā)酵途徑活潑導(dǎo)致生物大分子合成普遍遭到抑制3質(zhì)粒的不穩(wěn)定性2、重組異源蛋白超糖基化修飾二、巴斯德畢赤酵母Pich

3、ia pastoris是近年來發(fā) 展最為迅速，運(yùn)用最為廣泛的酵母細(xì)胞。是一種甲基營養(yǎng)菌，能在相對較為廉價的甲醇培育基中生長。優(yōu)點除具有普通酵母所具有的特點 外，還有以下幾個優(yōu)點：1、具有目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)厲的啟動子之一 乙醇氧化酶AOX1基因啟動子,外源蛋白表達(dá)量高普通 500-4000mg/L，最高為破傷風(fēng)毒素C到達(dá)12g/l 。 2、表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點穩(wěn)定整合。 3、蛋白產(chǎn)物糖基化修飾作用大多數(shù)情況下接近哺乳動物細(xì)胞且可直接以天然可溶方式分泌到胞外。缺陷發(fā)酵周期長，要添加甲醇分子生物學(xué)根底不清楚，遺傳改造難度大。運(yùn)用 消費(fèi)重組真核藥物蛋白： 近年來，Invitrogon公司開

4、發(fā)了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，短短幾年曾經(jīng)有300多種外源蛋自在該系統(tǒng)得到有效表達(dá)，被以為是目前最有效的酵母表達(dá)系統(tǒng)。 藥物蛋白已有20多種，見 李元P52表。如人IL2、人血潔白蛋白、TNF、HBsAg、EGF、破傷風(fēng)毒素C片斷、人巨細(xì)胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物等，有些即將進(jìn)入市 場。常用畢氏酵母菌 KM71和GS115:都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標(biāo)志。 GS115茵株：具有AOX1基因，是Mut，即甲醇利用 正常型； KM71菌株：AOX1位點被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型 共同特點:為組氨醇脫氫酶缺陷株，與帶有his標(biāo)志基因的表達(dá)質(zhì)粒配合運(yùn)用三、乳酸克魯維酵母

5、具有可穩(wěn)定存在的附加體型質(zhì)粒pKD1載體及高拷貝整合型質(zhì)粒pMIRK1外源基因表達(dá)程度比釀酒酵母高，如由重組乳酸克魯維酵母合成的人IL1是重組釀酒酵母的80100倍。四、多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白糖基化修飾作用接近哺乳動物細(xì)胞。也是一種甲基營養(yǎng)菌。舉例：利用重組酵母消費(fèi)乙肝疫苗第一代乙肝疫苗：病毒攜帶者體內(nèi)提取存在問題：1、來源有限2、提取過程復(fù)雜3、致病潛在危險4、本錢高第二代乙肝疫苗重組乙肝疫苗第一階段：大腸桿菌重組乙肝疫苗。20世紀(jì)70年代末嘗試用大腸桿菌表達(dá)乙肝外表抗原HBsAg，但表達(dá)程度極低第二階段：釀酒酵母重組乙肝疫苗。起始于20世紀(jì)80年代初，將HBsHg或s多肽的編碼序列置于A

6、DH1釀酒酵母的乙醇脫氫酶1基因啟動子或PGK磷酸甘油酯激酶基因啟動子后面，表達(dá)出具有免疫活性的非糖基化HBsHg 。目前已作為乙肝疫苗商品化，商品名為RecombivaxB或EngerixB。第三階段：巴斯德畢赤酵母重組乙肝疫苗HBsAg基因穩(wěn)定整合在巴斯德畢赤酵母染色體上表達(dá)產(chǎn)物量比在釀酒酵母中高1倍，并且表達(dá)蛋白效價高出釀酒酵母數(shù)十倍。常用哺乳動物表達(dá)細(xì)胞能在培育基中無限生長的哺乳動物細(xì)胞系。普通為與正常細(xì)胞生理特性根本接近、無平面接觸抑制特性的腫瘤細(xì)胞系或異倍體延續(xù)細(xì)胞系 有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系有限細(xì)胞系finite cell line：正常細(xì)胞經(jīng)過多次傳代后，普通可延續(xù)培育3050代

7、，就會逐漸失去增殖才干，也就是說它們只能生長有限的時間，經(jīng)過假設(shè)干傳代培育后將老化死 亡，把這類細(xì)胞稱為有限細(xì)胞系。無限細(xì)胞系infinite cell line或延續(xù)細(xì)胞系continuous cell line：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過自然或人為的要素轉(zhuǎn)化為異倍體后，能變?yōu)闊o限細(xì)胞系，沒有分裂次數(shù)的限制。藥物消費(fèi)運(yùn)用的主要細(xì)胞系非洲綠猴腎細(xì)胞COS、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO 、小倉鼠腎細(xì)胞BHK、人胚胎腎細(xì)胞HEK239、 C127 用于基因瞬時表達(dá)： COS、 BHK、 HEK239用于基因穩(wěn)定表達(dá)：CHO一、CHO細(xì)胞 Chinese hamster ovary cells細(xì)胞貼壁培育和懸浮培育 二優(yōu)

8、點1、外源基因整合到宿主細(xì)胞后能穩(wěn)定堅持；2、可分泌表達(dá)外源蛋白，而內(nèi)源蛋白分泌很少。3、蛋 白質(zhì)翻譯后的修飾準(zhǔn)確，表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)造、性質(zhì)和生物活性接近天然。4、培育條件要求低。對剪切力和浸透壓有較高的忍受才干；能在無血清的條件生長。三運(yùn)用有多個衍生突變株運(yùn)用于藥物的消費(fèi)，培育時需求添加脯氨酸。采用二氫葉酸復(fù)原酶 DHFR的缺陷株*CHO/dhFr表達(dá)的藥物有人組織性纖溶酶原激活劑 tPA、 IFN、IFN 、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子等已投放市場?？稍谠诎奔柞｀┻?methotrexate,MTX存在下，添加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白的表達(dá)程度，使外源基因高效表達(dá)。二、BHK

9、細(xì)胞一普通特性： 分別自幼倉鼠的腎臟baby hamster kidney, BHK 成纖維樣細(xì)胞，非整倍體，2n=44。二運(yùn)用：用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白。 兩種重組凝血因子，Bayer的Kogenate FS、Aventis Behring的Helixate分別于1989和1994被FDA獲準(zhǔn)上市，1999年FDA同意Novo Nordisk的重組凝血因子VIIaNovoSeven上市，用于治療血友病。三、C127細(xì)胞一普通特性： 分別自小鼠乳腺腫瘤 上皮樣細(xì)胞，貼壁型生長。 被牛乳頭瘤病毒bovine polyoma virus，BPVDNA載體轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞形狀發(fā)生明顯變化。 二常用

10、細(xì)胞系： C127：LT細(xì)胞系：生長密度高，表達(dá)組成型大T抗原。 C127I細(xì)胞：適宜于牛 乳頭瘤病毒DNA載體的轉(zhuǎn)化。三運(yùn)用：已表達(dá)多種外源基因，Serono公司消費(fèi)rhGHSaizen, Zorbtive于1996年被FDA已被同意進(jìn)入市場。四、雜交瘤細(xì)胞一普通特性： 從小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的交融細(xì)胞中分別獲得雜交瘤細(xì)胞系； 懸浮生長型 容易 轉(zhuǎn)染和培育，能在無血清培育基中高密度懸浮生長；二常用細(xì)胞系：SP2/O、J558L和NS0等。三運(yùn)用：制備抗體、表達(dá)其他外源蛋白如tPA等。五、Vero細(xì)胞一普通特性： 分別自成年非洲綠猴腎 成纖維細(xì)胞，貼壁依賴性，為延續(xù)細(xì)胞系。 多倍體核型，66

11、%細(xì)胞的2n=60 二常用細(xì)胞：Vero E6三運(yùn)用： 1、增殖多種病毒消費(fèi)疫苗，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等。 2、表達(dá)蛋白質(zhì)藥物 3、病毒的檢測六、COS細(xì)胞常用昆蟲表達(dá)細(xì)胞家蠶Sf21和Sf-9來源：秋黏蟲Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢細(xì)胞特點： 1、容易繁衍，倍增時間1824小時 2、可高效表達(dá)外源基因。 TN-5B1-4來源：粉紋夜蛾Trichoplusia ni，TN卵細(xì)胞；特點： 1、培育要求條件低，可用無血清培育基培育 2、快速倍增，能順應(yīng)懸浮培育。 3、分泌表達(dá)重組蛋白的才干比SF9細(xì)胞系高20多倍。二 生物反響器存在的主要

12、問題主要論述植物作為反響器的主要問題2. 1轉(zhuǎn)基因沉默是指轉(zhuǎn)基因在受體植物中往往不能穩(wěn)定表達(dá),有時甚至完全不表達(dá),或者說利用遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入并穩(wěn)定整合進(jìn)受體細(xì)胞中的完好的外源基因在當(dāng)代轉(zhuǎn)化體或在其后代中表達(dá)遭到抑制的景象。其可以經(jīng)過以下途徑處理: 探明影響植物基因表達(dá)的基因調(diào)控元件,加以修飾和開啟控制; 了解轉(zhuǎn)錄過程,以便在轉(zhuǎn)錄程度進(jìn)展基因操作,提高轉(zhuǎn)錄效率; 研討翻譯過程,提高翻譯效率; 構(gòu)建一些新的植物高效表達(dá)系統(tǒng),即各種載體及高效元件。2.2表達(dá)程度低大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)過自交后可以選擇出目的基因純合的后代,可以穩(wěn)定遺傳,使表型得以延續(xù)。但是大部分外源基因的表達(dá)程度在植物體內(nèi)不高,目前沒有

13、得到很好的處理?？梢試L試用如下方法加以處理:采用適當(dāng)?shù)膹?qiáng)啟動子、加強(qiáng)子序列和前導(dǎo)序列,運(yùn)用偏愛密碼子,將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物定向到適宜的細(xì)胞分隔(如細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)外體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、葉綠體液泡等) ,組織器官特異性表達(dá)(如種子、塊莖、果實、橡膠樹乳管等) ,去除mRNA不穩(wěn)定序列,同時表達(dá)有助于產(chǎn)物正確折疊的酶或蛋白質(zhì)(如分子伴侶) 。此外,還可用植物病毒作為載體提高表達(dá)量。雖然這一問題可以處理,但要構(gòu)成一套完好的外源基因在植物體內(nèi)的高效表達(dá)體系還有待深化研討。2.3重組蛋白質(zhì)中糖鏈構(gòu)造的改動植物表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和它的原始序列通常是一樣的,并且在植物中能構(gòu)成類似于人類等哺乳類動物的復(fù)雜型糖鏈構(gòu)造,但是二者

14、在高爾基體中的糖基化過程存在較大差別。植物中糖蛋白短少唾液酸和半乳糖殘基,特異存在2(1, 3) 2巖藻糖和2(1, 2) 2木糖。而唾液酸和半乳糖殘基缺失會影響糖蛋白在人體內(nèi)的穩(wěn)定性及半衰期,使其活性降低;2(1, 3) 2巖藻糖和2( 1, 2) 2木糖的存在那么易引起人體內(nèi)的免疫原性。為了防止植物高爾基體中特異的糖基化過程,人們發(fā)如今表達(dá)蛋白質(zhì)的后面添加KDEL序列,可將蛋白質(zhì)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,從而構(gòu)成對人無免疫應(yīng)對的高甘露糖型糖蛋白質(zhì),同時還可以提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。2. 4下游消費(fèi)本錢高雖然植物消費(fèi)體系具有許多優(yōu)點,但假設(shè)產(chǎn)物需提純,其費(fèi)用還是比較昂貴的,因此有待降低下游消費(fèi)本錢,盡能夠

15、地防止或部分防止表達(dá)產(chǎn)物的純化,如用轉(zhuǎn)基因植物消費(fèi)直接口服疫苗。有時經(jīng)過被修飾植物的直接消化運(yùn)輸生物藥物產(chǎn)物能夠不需求純化,這種生物藥物及可食用疫苗能以種子、塊莖或果實的方式儲存和分配,可以直接利用,這樣就大大簡化了下游的加工本錢。另外,也可將植物種子油脂體作為蛋白或肽類的載體,外源基因以交融蛋白的方式表達(dá),油脂蛋白具有親脂性使其成為高效的多肽純化系統(tǒng)。2.5轉(zhuǎn)基因藥品的平安性問題目前,雖然經(jīng)過植物生物反響器消費(fèi)外源蛋白相對于動物和微生物來講平安性更高一些,但是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的平安性仍存在爭議,如在口服藥物和口服疫苗方面,植物能否含有對直接口服蛋白有影響的因子。公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受和認(rèn)可程度還不

16、夠,從而使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的市場化進(jìn)程遭到影響。因此,一方面要加大宣傳普及力度,另一方面還要對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的潛在危險性進(jìn)展充分評價,開發(fā)清潔載體,防止目的產(chǎn)物遭到污染,同時還要制定相應(yīng)的平安和管理法規(guī)。展望雖然轉(zhuǎn)植物生物反響器仍存在一些問題尚待處理,但利用植物表達(dá)系統(tǒng)已勝利地表達(dá)了多種具有生理活性的外源多肽,而且有些曾經(jīng)進(jìn)展了人體和動物的實驗,其前景是可觀的,隨著人類基因組方案研討的不斷深化,會發(fā)現(xiàn)有更多醫(yī)療價值的蛋白質(zhì),因此利用轉(zhuǎn)基因植物將會成為最具潛力的消費(fèi)系統(tǒng)來消費(fèi)這些藥物,為人類安康做出宏大的奉獻(xiàn)。三 求職應(yīng)有的知識貯藏1.掌握數(shù)學(xué)、物理、化學(xué)等方面的根本實際和根本知識； 2.掌握根底生物學(xué)、

17、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、基因工程、發(fā)酵工程及細(xì)胞工程等方面的根本實際、根本知識和根本實驗技藝，以及生物技術(shù)及其產(chǎn)品開發(fā)的根本原理和根本方法； 3.了解相近專業(yè)的普通原理和知識； 4.熟習(xí)國家生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)政策、知識產(chǎn)權(quán)及生物工程平安條例等有關(guān)政策和法規(guī)； 5.了解生物技術(shù)的實際前沿、運(yùn)用前景和最新開展動態(tài)，以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)開展情況； 6.掌握資料查詢、文獻(xiàn)檢索及運(yùn)用現(xiàn)代信息技術(shù)獲取相關(guān)信息的根本方法；具有一定的實驗設(shè)計，發(fā)明實驗條件，歸納、整理、分析實驗結(jié)果，撰寫論文，參與學(xué)術(shù)交流的才干。參考文獻(xiàn)：1 龐俊峰; 黃東光; 吳燕民; HYPERLINK t _blank 植物生物反響器研討

18、進(jìn)展 HYPERLINK t _blank 生物技術(shù)通報, HYPERLINK t _blank Biotechnology Bulletin, HYPERLINK mailto:SWJT 編輯部郵箱 HYPERLINK t _blank 2021年 01期2 嚴(yán)萍,趙樹進(jìn). 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物抗體上的運(yùn)用J. HYPERLINK t _blank 生命的化學(xué), HYPERLINK t _blank 2006,(01) .3 劉德虎. HYPERLINK t _top 利用轉(zhuǎn)基因植物消費(fèi)藥用蛋白J. HYPERLINK t _blank 生物技術(shù)通報, HYPERLINK t _blank 19

19、99,(04) .4 杜小春; 何正權(quán); 陳磊; 楊曄; 姚偉; HYPERLINK t _blank 植物生物反響器表達(dá)藥用蛋白研討新進(jìn)展 HYPERLINK t _blank 中國生物工程雜志, HYPERLINK t _blank China Biotechnology, HYPERLINK mailto:SWGJ 編輯部郵箱 HYPERLINK t _blank 2021年 09期5 楊晶; 李天航; 熊麗東; 龐實峰; 李校堃; HYPERLINK t _blank 植物生物反響器的研討進(jìn)展 HYPERLINK t _blank 生物工程學(xué)報, HYPERLINK t _blank

20、Chinese Journal of Biotechnology, HYPERLINK mailto:SHWU 編輯部郵箱 HYPERLINK t _blank 2021年 05期6.Stephanopoulos G;Konstantinov K;Sauer U Fermentation data analysis and control , inBiotechnology( Rehm, H. J. Ed) 19937.Konstantinov K B;Artis R;Yoshida T On the selection of variables representing the physio

21、logicalstate of the cell cultures 19928.Stephanopoulos G Metabolic engineering外文期刊 19989.Fell D A Increasing the flux in metabolic pathways: a metabolic control analysis perspective外文期刊 199810.郁靜恰;楊勝利 代謝工程 1996(02)11.Bailey J E Toward a science of metabolic engineering外文期刊 199112.張嗣良.儲炬.莊英萍抗生素發(fā)酵過程優(yōu)化技術(shù)研討期刊論文-中國抗生素雜志 2002(9)13.蔡顯鵬.儲炬.莊英萍.張嗣良鳥苷發(fā)酵代謝過程分析期刊論文-食品與發(fā)酵工業(yè) 2002(9)14.扶教龍.儲炬.劉玉偉.樊濤.莊英萍.彭皓宇.張嗣良金霉素發(fā)酵過程的代謝特性及調(diào)控戰(zhàn)略期刊論文-中國抗生素雜志 2002(3)15.張嗣良發(fā)酵工程技術(shù)開展現(xiàn)狀與趨勢期刊論文-生物產(chǎn)業(yè)技術(shù) 2021(1)16. HYPERLINK f.g.wanfangdata/download