1、Abstract由於 T-bet 已經(jīng)被證實(shí)可與調(diào)控IFN-g 的啟動(dòng)子結(jié)合，因此被認(rèn)為會(huì)與pIFN-g結(jié)合(3)，初期實(shí)驗(yàn)是想利用轉(zhuǎn)錄因子：T-bet和IFN-g 啟動(dòng)子的作用來(lái)探討 Yeast one hybrid 的系統(tǒng)是否可以偵測(cè)到兩者的作用。若可行，我們將利用此系統(tǒng)進(jìn)一步來(lái)篩選其他能夠和IFN-g 啟動(dòng)子作用的基因，與研究這些基因的產(chǎn)物是否可以促進(jìn)T細(xì)胞從 Th 0 細(xì)胞分化到 Th1 細(xì)胞。Introduction 圖一：T 細(xì)胞分化的流程圖。T細(xì)胞的分化與人體免疫有密不可分關(guān)係。 人體的免疫反應(yīng)可分為細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)（Cellular immunity）及體液調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)（H

2、umoral immunity），T在這兩種調(diào)節(jié)系統(tǒng)中T細(xì)胞扮演細(xì)胞是人類免疫反應(yīng)的重要的角色。重要樞紐，可分為以細(xì)胞當(dāng)作媒介或是以抗體當(dāng)作媒介兩種，他們T細(xì)胞在胸腺發(fā)育後經(jīng)過(guò)正選及負(fù)選（Positive and negative selection）而成熟，之後然後這些成熟的 T細(xì)胞會(huì)從胸腺轉(zhuǎn)移到周圍的組織。在接受抗元原(Antigen)的刺激後，原始的輔助性 T 細(xì)胞 （Native CD4+ T helper cells；Th0）會(huì)因不同的細(xì)胞激素（Cytokine）刺激而分化成不同的輔助性T細(xì)胞（例如Th1 和 Th2），Th1細(xì)胞會(huì)分泌第二型干擾素（IFN-g），白介素2號(hào)（IL-2

3、），淋巴毒素（LT）和癌細(xì)胞死亡因子（TNF-a 和 TNF-b）。這些細(xì)胞激素可調(diào)控B細(xì)胞及其他類型的免疫細(xì)胞，然而，在極不正常的情況之下，這些細(xì)胞也可能造成自體免疫的疾?。ɡ纾侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、糖尿病和實(shí)驗(yàn)性急性腦炎）和發(fā)炎的免疫反應(yīng)。Th2 細(xì)胞則會(huì)分泌其它白介素4、5、10和13，這些細(xì)胞是涉及抗體的產(chǎn)生以及抗發(fā)炎反應(yīng)，失調(diào)時(shí)會(huì)引起過(guò)敏(1)。（參見圖一） T細(xì)胞由從未受刺激的Th0細(xì)胞發(fā)展到 Th1細(xì)胞的分化過(guò)程中，第二型干擾素啟動(dòng)子（Interferon gamma promoter；pIFN-g ）會(huì)被活化而導(dǎo)致IFN-g 的產(chǎn)生。一些例子顯示調(diào)控T細(xì)胞分化的分子也同時(shí)具

4、有調(diào)控細(xì)胞激素的表現(xiàn)。例如：T-bet 可以促進(jìn) T細(xì)胞從 Th0 細(xì)胞分化到 Th1 細(xì)胞，也可以控制 IFN-g 的表現(xiàn)。T-bet（Tbx21，Tbt1或TBLym）是由530個(gè)氨基酸所組成的轉(zhuǎn)錄因子，它具有T-box DNA結(jié)合區(qū)（T-box DNA binding domain）可與基因啟動(dòng)子上的T-box序列（consensus T-box site; aatttcacacctaggtgtgaaatt）結(jié)合(2-4)。為了找出可使 T細(xì)胞由 Th0發(fā)展到 Th1 的分子，因此我們實(shí)驗(yàn)室想要利用Yeast one hybrid 的系統(tǒng)(5)來(lái)找尋能與IFN-g promoter 序列

5、結(jié)合的蛋白質(zhì)。Yeast one hybrid 系統(tǒng)的原理如圖二：圖二：Yeast one hybrid 系統(tǒng)的示意圖。此系統(tǒng)是將特別的 DNA 片段放在報(bào)導(dǎo)基因（Reporter gene）之前，再將這個(gè)構(gòu)築的載體嵌入酵母菌的染色體中，然後帶有這個(gè)片段的酵母菌可被含有此段特別基因的DNA結(jié)合區(qū)（Binding domain; BD）及活化區(qū)（Activation domain; AD）之質(zhì)體所表達(dá)的融合蛋白結(jié)合，最後我們可藉由實(shí)驗(yàn)觀察報(bào)導(dǎo)基因的表現(xiàn)與否，來(lái)篩選會(huì)與這段特別DNA片段作用的基因。Materials and Methods(1) 構(gòu)築含有第二型干擾素啟動(dòng)子的質(zhì)體（pIFN-g/p

6、LacZ）：（圖三） 設(shè)計(jì)合適的Primers，利用PCR技術(shù)來(lái)釣出Genomic DNA 內(nèi)的第二型干擾素啟動(dòng)子。pIFN-g 5primer：5gga ctt cct cac caa att gtt c3pIFN-g 3primer：5cct tta gac tcc ttg ggt cct t3 將IFN-g promoter 嵌入pLacZi載體（或pHISi、pHISi-1） 或 pLacZi 載體之中。選擇適當(dāng)?shù)南拗平退貙⑤d體直線化後，再利用接合酵素將PCR產(chǎn)物連接起來(lái)，然後根據(jù)pLacZi載體上帶有的Ampicillin抗生素篩選指標(biāo)來(lái)作篩選。圖三：pIFN-g/pLacZ質(zhì)體的構(gòu)

7、築。首先利用PCR技術(shù)將IFN-g promoter序列由genomic DNA釣出，然後將此序列選殖入直線化的載體pLacZi中，然後利用載體抗藥性基因（Ampicillin）來(lái)篩選正確的菌株。(2) 將帶有報(bào)導(dǎo)基因和IFN-g promoter的核酸序列嵌入酵母菌的染色體：（圖四） 將pIFN-g/pLacZ質(zhì)體直線化（Linearization）：用適當(dāng)?shù)南拗平退兀≧estriction enzyme）將質(zhì)體直線化。pLacZi : Nco I 或 Apa I 轉(zhuǎn)形作用（Transformation）：利用轉(zhuǎn)形作用將直線化的pIFN-g/pLacZ核酸序列嵌入酵母菌YM4271染色體中，

8、並將之培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)慕湍妇Y選培養(yǎng)基上。pLacZi : SD/-Ura 培養(yǎng)基。 篩選帶有嵌入基因片段的酵母菌株：圖四：第二型干擾素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)型及酵母菌的篩選。首先將pIFN-g/pLacZ 質(zhì)體利用限制酵素直線化，然後將此直線化的質(zhì)體利用轉(zhuǎn)型作用嵌入酵母菌YM4271中。其係利用相似性重組（Homologous recombination）的方式嵌入酵母菌的染色體中。因?yàn)閜LacZi含有可製造Uracil 的基因，因此可利用缺少Uracil的培養(yǎng)基來(lái)做篩選。若是構(gòu)築完成的載體沒(méi)有嵌入酵母菌的染色體之中，則酵母菌無(wú)法在此選擇性培養(yǎng)基中存活。根據(jù)酵母菌是否帶有嵌入報(bào)導(dǎo)基因的表現(xiàn)，然後在適當(dāng)?shù)暮Y選

9、培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。若有，則表示此酵母菌株帶有嵌入的報(bào)導(dǎo)基因;反之，則無(wú)。pLacZi 則是含有可製造 Ura 的基因，因此可利用缺少 Ura 的培養(yǎng)基來(lái)做篩選。(3) 構(gòu)築含 T-bet 和 GAL4 AD 的載體（T-bet BD/GAL4 AD）（圖五）由於載體pGAD424上含有轉(zhuǎn)錄作用的活化區(qū)(Activation domain; AD)，而 T-bet 是已知的轉(zhuǎn)錄因子，因此將其DNA-binding domain(BD)與pGAD424 的AD 接合在一起，以產(chǎn)生帶有BD-AD的融合蛋白質(zhì)以活化pIFN-g 下游的報(bào)導(dǎo)基因LacZ （b-galactosidase）。 設(shè)計(jì)合適的Pri

10、mers，利用RT-PCR技術(shù)將Genomic DNA 內(nèi)的 T-bet 的DNA 結(jié)合區(qū) (DNA-binding domain)核酸序列釣出。T-bet BD 5primer: 5aga gtc gcg ctc agc aac cac3T-bet BD 3primer: 5aaa gtt ctc ccg gaa tcc tt3 將含T-bet DNA-binding domain的核酸序列連接至 pGAD424載體中。 篩選帶有T-bet DNA-binding domain核酸序列的pGAD424菌株：圖五: T-bet BD/GAL4 AD 質(zhì)體的構(gòu)築。首先利用RT-PCR技術(shù)將T-b

11、et BD核酸序列釣出，接著利用接合酵素將其與直線化的pGAD424質(zhì)體接合在一起，最後利用pGAD424質(zhì)體上的抗藥性基因（Ampicillin）進(jìn)行篩選。因?yàn)閜GAD424載體本身帶有抗Ampicillin的基因，因此我們可在培養(yǎng)基內(nèi)添加Ampicillin 來(lái)篩選正確的T-bet BD/GAL4 AD 菌株。(4) 測(cè)試 T-bet BD 和 IFN-g promoter 的作用：將構(gòu)築好的T-bet BD/GAL4 AD質(zhì)體轉(zhuǎn)型至帶有pIFN-g/pLacZ序列的酵母菌株(YM4271/pIFN-g/pLacZ)，以觀察T-bet BD/GAL4 AD所表現(xiàn)出的融合蛋白是否可活化YM4

12、271/pIFN-g/pLacZ 的報(bào)導(dǎo)基因：LacZ 的產(chǎn)物 b-galactosidase的表現(xiàn)。因此，我們可利用帶有b-galactosidase受質(zhì): X-gal的培養(yǎng)基做為篩選的指標(biāo)。若b-galactosidase被活化而表現(xiàn)，則其可將X-gal分產(chǎn)解而產(chǎn)生藍(lán)色的產(chǎn)物，因此我們可以選擇帶有藍(lán)色酵母菌株。Result and Discussion(1) 構(gòu)築pIFN-g/LacZ及T-bet BD/GAL4 AD質(zhì)體： pIFN-g/LacZ質(zhì)體（7277bp）的構(gòu)築：圖六：T-bet BD 和 IFN-g promoter 的作用示意圖。將構(gòu)築好的T-bet BD/GAL4 AD

13、質(zhì)體，利用轉(zhuǎn)型作用將其殖入酵母菌株（YM4271/pIFN-g/pLacZi）中，然後將其塗在選擇性培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Ura）上培養(yǎng)，觀察是否有藍(lán)色的菌落出現(xiàn)。根據(jù)我們所設(shè)計(jì)IFN-g promoter 的引子，我們可以得到327 bp長(zhǎng)的核酸序列，將所得到的PCR片段接到pLacZi載體（6900 bp）的MCS site（Mutlicloning site），然後利用載體本身所帶有的抗藥性基因（AmpR）來(lái)作篩選，最後挑選單一菌株進(jìn)行小量DNA的純化，再利用限制酵素分析所獲得的質(zhì)體是否正確。 T-bet BD/GAL4 AD質(zhì)體（7173bp）的構(gòu)築：利用我們所設(shè)計(jì)的T-bet D

14、NA-binding domain之引子，進(jìn)行PCR可以得到573 bp長(zhǎng)的核酸序列，將此片段接到pGAD424載體（6600 bp）中，然後將其轉(zhuǎn)型至大腸桿菌內(nèi)，利用載體本身所帶有的抗藥性基因（AmpR）來(lái)作篩選，最後挑選單一菌株進(jìn)行小量DNA的純化，再利用限制酵素分析挑選正確的菌株。(2) YM4271/pIFN-g/pLacZ菌株的製作： YM4271與pIFN-g/pLacZi的轉(zhuǎn)型（Transformation）：用Yeast one-hybrid系統(tǒng)來(lái)尋找會(huì)與特殊DNA序列作用的Cis-acting element，必需將此特殊的DNA序列插入酵母菌的染色體中，在此我們先將構(gòu)築的p

15、IFN-g/pLacZ質(zhì)體，利用限制酵素將其直線化，根據(jù)電泳的分析，我們可以在7227 bp看到Single band，如此即可確認(rèn)此質(zhì)體完全直線化，然後將直線化的pIFN-g/pLacZ轉(zhuǎn)型至YM4271酵母菌株內(nèi)。 YM4271/pIFN-g/pLacZ的篩選： 我們所構(gòu)築的pIFN-g/pLacZ質(zhì)體帶有URA3報(bào)導(dǎo)基因，此基因在YM4271菌株內(nèi)被突變而具有缺失。因此，若我們成功的將直線化的pIFN-g/pLacZ嵌入YM4271酵母菌株，則此基因可表現(xiàn)orotindine-5-phosophate decarboxylase來(lái)合成Urial，如此即可在未含Urial 的選擇培養(yǎng)基中生

16、長(zhǎng)。反之，因YM4271菌株的URA3基因有缺陷，所以無(wú)法在未含Urial 的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。 (3)檢測(cè) T-bet BD/GAL4 AD 與pIFN-g 序列的作用： 轉(zhuǎn)形作用(Transformation)：將構(gòu)築好的T-bet BD/GAL4 AD質(zhì)體，利用PEG/LiAc的方法轉(zhuǎn)型至YM4271/pIFN-g/pLacZ酵母菌株內(nèi)，然後將其塗在選擇培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Ura）上。 篩選（Screening）:因?yàn)門-bet BD/GAL4 AD質(zhì)體本身帶有合成Leucine所需的LEU基因，又YM4271/pIFN-g/pLacZ 菌株帶有合成Uracil所需的URA3基因。

17、因此送入的T-bet BD/GAL4 AD質(zhì)體因可表現(xiàn)T-bet BD/GAL AD 融合蛋，所以應(yīng)該可與YM4271/pIFN-g/pLacZ 染色體的pIFN-g 核酸序列作用，進(jìn)而活化下游的LacZ基因，因此可將培養(yǎng)基上的X-gal 分解成藍(lán)色的產(chǎn)物。Reference1.Abbas, A. K., Murphy, K. M., and Sher, A. (1996) Nature 383, 787-7932.Shier, P., Hofstra, C. L., Ma, X. J., Wu, Y., Ngo, K., and Fung-Leung, W. P. (2000) Immunogenetics 51, 771-7783.Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., and Glimche