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文檔簡介
《野生動物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》
團體標(biāo)準(zhǔn)編制說明
一、工作簡況
(一)任務(wù)來源
2024年3月,中國科學(xué)院昆明動物研究所申請《野生動物腺病毒
高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》團體標(biāo)準(zhǔn)的立項工作,該標(biāo)準(zhǔn)立項得到科
技部重點研發(fā)項目“高黎貢地區(qū)野生動物全景動態(tài)監(jiān)測體系建設(shè)與安
全評估示范”支持,批準(zhǔn)由中國科學(xué)院昆明動物研究所負(fù)責(zé)《野生動
物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》團體標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。
(二)起草單位
起草單位:中國科學(xué)院昆明動物研究所
協(xié)作單位:無
(三)主要工作過程
1.成立項目組
成立標(biāo)準(zhǔn)制定項目組,明確項目組成員的工作職責(zé),對相關(guān)國家
標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)資料進行調(diào)查與整理。
2.標(biāo)準(zhǔn)起草
通過對前期研究工作的總結(jié)和對收集資料的分析統(tǒng)計,確定野生
動物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程的框架,包括野生動物樣本采集
和保存、樣本處理及核酸提取、病毒DNA建庫、病毒DNA測序、
病毒種類鑒定及全基因組遺傳信息獲取等內(nèi)容,參照標(biāo)準(zhǔn)編寫格式,
起草小組編寫了標(biāo)準(zhǔn)草案稿。
3.實驗驗證
標(biāo)準(zhǔn)草案完成后,中國科學(xué)院昆明動物研究所對有關(guān)各項技術(shù)指
標(biāo)進行了實驗驗證。通過驗證,對存在問題作了研究和驗證,補充完
善本標(biāo)準(zhǔn),形成標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿。
4.專家意見征詢
本標(biāo)準(zhǔn)廣泛征求了中國科學(xué)院昆明動物研究所、中國科學(xué)院武漢
病毒研究所等專業(yè)領(lǐng)域?qū)<业囊庖姡鶕?jù)專家提出的意見和建議,經(jīng)
項目組內(nèi)部充分討論,進行分析、整理和完善,完成《野生動物腺病
毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》送審稿及編制說明,等待召開標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)
審查會。
(四)標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做工作
職務(wù)/
姓名性別工作單位任務(wù)分工
職稱
中國科學(xué)院昆明項目負(fù)責(zé)人,組織項目實施及
楊麗萍女實驗師
動物研究所標(biāo)準(zhǔn)文本起草、標(biāo)準(zhǔn)實驗研究
中國科學(xué)院昆明
楊興婁男研究員組織項目實施及標(biāo)準(zhǔn)文本起草
動物研究所
中國科學(xué)院昆明
李豐邑男博士生主要起草人、標(biāo)準(zhǔn)實驗研究
動物研究所
中國科學(xué)院昆明
趙鍇男博士生主要起草人、標(biāo)準(zhǔn)實驗研究
動物研究所
(五)制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性、目的及意義
制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性:腺病毒(adenovirus,AdV)是腺病毒科
(Adenoviridae)成員的統(tǒng)稱,是無包膜的雙鏈DNA病毒,直徑為70~
90nm的顆粒,由252個殼粒呈20面體排列構(gòu)成。每個殼粒的直徑為
7~9nm。殼粒里是線狀雙鏈DNA分子,約為30~47kb的堿基序列,
兩端各有長約100bp的反向重復(fù)序列。腺病毒科成員感染包括人類
在內(nèi)的各種脊椎動物,主要分為6個屬:Aviadenovirus(主要感染禽
類)、Ichtadenovirus(主要感染魚類)、Mastadenovirus(主要感染包
括人在內(nèi)的哺乳動物)、Atadenovirus(主要感染爬行類、鳥類、反
芻動物及有袋類動物)、Siadenovirus(主要感染兩棲類、鳥類及爬行
類動物)、Testadenovirus(主要感染爬行類)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為腺病毒
的天然宿主通常為單一宿主物種或進化關(guān)系上密切相關(guān)的物種,例如,
人類腺病毒D型的天然宿主僅為人類,牛腺病毒2型的天然宿主僅
為牛和羊。但隨著越來越多的新型腺病毒的發(fā)現(xiàn),也有越來越多的野
生動物攜帶腺病毒能夠跨種感染其他物種甚至人類,并能夠引起一些
顯著的臨床反應(yīng)及疾病。
腺病毒作為呼吸道感染的重要病原之一,目前已報道至少90個
基因型。腺病毒可在任何年齡的人群中引起感染,導(dǎo)致輕度至重度疾
病。主要包括急性呼吸道疾?。ㄈ缦俨《痉窝祝鄄考膊。ㄈ缌餍?/p>
性角膜結(jié)膜炎)和腸胃道疾病(如腺病毒性腸炎)等多種疾病。兒童、
免疫功能低下的患者或已有呼吸道疾病或心臟病的患者風(fēng)險較高。在
免疫功能低下的患者中,腺病毒感染可導(dǎo)致多種臨床綜合征,嚴(yán)重時
引發(fā)腺病毒血癥導(dǎo)致呼吸衰竭、多器官衰竭甚至致死。世界各地曾多
次暴發(fā)與腺病毒有關(guān)的區(qū)域性疫情,嚴(yán)重影響到公眾健康,沖擊了公
共醫(yī)療系統(tǒng),給社會經(jīng)濟發(fā)展帶來了很大損失。在過去十多年中,我
國不同地區(qū)腺病毒感染引起的疾病也頻繁發(fā)生,有多篇文獻報道腺病
毒由動物傳染到人的直接證據(jù)。高黎貢地區(qū)以其生物的多樣性,被學(xué)
術(shù)界譽為“世界物種基因庫”,為世界生物圈保護區(qū)。動物資源豐富
也預(yù)示著其攜帶微生物的多樣性也相對豐富,快速鑒定高黎貢地區(qū)野
生動物樣品(如野生動物糞便、組織等)中腺病毒的攜帶情況,對于
動物疫病的防控和跨種感染的風(fēng)險評估,野生動物健康、公眾健康和
國家生物安全至關(guān)重要。
傳統(tǒng)的腺病毒鑒定方式(如抗原檢測、血清型鑒定等)主要針對
已知、常見的腺病毒,對于更多新型的、未知的腺病毒的鑒定能力尚
未薄弱。近年來,通用PCR的低靈敏度以及二代高通量測序在一定
程度已經(jīng)促進了我們對新發(fā)腺病毒的了解。但傳統(tǒng)PCR鑒定方式在
PCR擴增過程中會引起準(zhǔn)確性有所偏差,二代高通量測序不僅需要
PCR擴增,且要在整個測序過程結(jié)束,測序結(jié)果去接頭序列后過濾序
列而后拼接病毒基因組,比對分析才可知野生動物是否感染和攜帶腺
病毒。得到結(jié)果的時間至少一周以上。本標(biāo)準(zhǔn)的野生動物腺病毒高通
量快速鑒定技術(shù),在上機后5分鐘內(nèi)獲得初步比對結(jié)果,可知野生動
物是否感染和攜帶腺病毒;6h小時內(nèi)獲得初步鑒定結(jié)果;通過進一
步的分析及人工校對,24小時內(nèi)可獲得準(zhǔn)確鑒定結(jié)果。通過高通量
快速鑒定技術(shù)鑒定腺病毒為陰性的動物樣本,普通PCR和二代高通
量測序驗證也為陰性。野生動物樣本病毒分離培養(yǎng),分離培養(yǎng)出腺病
毒的樣本,通過腺病毒高通量快速鑒定技術(shù),可得到高覆蓋度的腺病
毒基因組信息。
制定標(biāo)準(zhǔn)的目的:通過《野生動物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)
程》的制定,為野生動物腺病毒的發(fā)現(xiàn)和科學(xué)研究提供技術(shù)參考,并
推進野生動物攜帶腺病毒快速鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化建設(shè)進程,從而
提高對野生動物腺病毒跨物種傳播導(dǎo)致的潛在傳染性疾病的預(yù)警與
響應(yīng)能力,為高黎貢地區(qū)的生態(tài)安全和生物安全提供保障。
制定標(biāo)準(zhǔn)的意義:野生動物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程的制
定,有利于實現(xiàn)快速鑒定野生動物樣品(如野生動物糞便、組織等)
中是否含有腺病毒,并能實現(xiàn)對樣品中含有的相關(guān)腺病毒進行快速準(zhǔn)
確的分類鑒定,提高野生動物腺病毒鑒定的準(zhǔn)確性,為后期研究腺病
毒的遺傳多樣性分析及風(fēng)險預(yù)警提供數(shù)據(jù)支撐。為高黎貢地區(qū)野外監(jiān)
測野生動物攜帶腺病毒的流行與外溢情況提供重要的補充和佐證。增
強我們對野生動物腺病毒引起的相關(guān)疾病的預(yù)警與響應(yīng)能力。對維護
國家與地區(qū)的生態(tài)安全和生物安全具有重要意義。
傳染病始終是人類最嚴(yán)重的安全威脅。新發(fā)突發(fā)傳染病往往傳播
范圍廣,傳播速度快,對國家安全、政治穩(wěn)定和經(jīng)濟發(fā)展的危害大,
加強對未來傳染病風(fēng)險的預(yù)測,構(gòu)建強大的新發(fā)突發(fā)傳染病防控體系
是維護國家安全和人民生命健康的核心需求。云南省是“動植物王國”,
生物多樣性極為豐富,也是新發(fā)傳染病暴發(fā)的熱點區(qū)域。云南省地處
西南,有4060公里的邊境線,同老撾、越南和緬甸接壤,東南亞國
家暴發(fā)的新發(fā)傳染病輸入風(fēng)險極高。云南省面臨著內(nèi)部爆發(fā)和外部輸
入的雙重風(fēng)險,按照總體國家安全觀的要求,平戰(zhàn)結(jié)合,研防融合,
實現(xiàn)新發(fā)突發(fā)傳染病防控的高水平科技自立自強,亟需持續(xù)提高生物
安全應(yīng)急能力建設(shè)。
二、團標(biāo)主要技術(shù)內(nèi)容及確定依據(jù)
(一)團標(biāo)主要技術(shù)內(nèi)容
1.原理
腺病毒是雙鏈DNA病毒,感染宿主非常廣,感染可導(dǎo)致人類輕
度至重度疾病。各類野生動物(如鼠形動物、蝙蝠等)是腺病毒重要
的自然宿主,尤其是新發(fā)腺病毒。納米孔高通量測序是一種通過電場
力驅(qū)動單鏈核酸分子穿過納米尺寸的蛋白孔道,基于不同的堿基通過
納米孔道時產(chǎn)生的不同阻斷程度的電流信號,識別每條核酸分子上的
堿基信息,從而實現(xiàn)對單鏈核酸分子的進行高通量測序的方法。該方
法可實現(xiàn)對Mb級的DNA進行直接測序,文庫制備簡單高效,可實
現(xiàn)快速、實時輸出測序結(jié)果并鑒定。在檢驗過程中,我們可將不同類
型的野生樣本作為待檢樣品,通過對樣品進行標(biāo)準(zhǔn)化核酸提取、建庫、
測序,待測序開始即可以對輸出數(shù)據(jù)與脊椎動物病毒參考序列的病毒
參考基因組數(shù)據(jù)庫的實時比對,待檢樣本輸出序列比對結(jié)果中出現(xiàn)腺
病毒的參考序列時,則可以判定為腺病毒病毒序列。
2.野生動物腺病毒高通量快速鑒定試驗步驟
2.1樣品的制備及DNA提取
收集野生動物血液、組織(肺、腸等)、肛拭子、咽拭子、糞便、
病毒培養(yǎng)物等材料。使用樣品對應(yīng)的專用商品試劑盒或傳統(tǒng)分子生物
學(xué)技術(shù)手段進行病毒DNA提取。組織樣品DNA的提取,推薦在低
溫研磨、離心后,使用組織樣本DNA病毒核酸提取試劑盒進行DNA
提??;其他樣本推薦在樣品充分渦旋、離心后,使DNA病毒核酸提
取試劑盒進行手動或自動化提取。本標(biāo)準(zhǔn)中采用的樣品病毒DNA提
取試劑盒為VirusDNA/RNAExtractionKit2.0,可進行自由選擇。由
于野生動物樣本可能攜帶有多種未知病毒,具有一定的潛在生物安全
風(fēng)險,推薦在具有生物安全二級實驗室資質(zhì)的實驗室中,遵循生物安
全二級實驗室操作規(guī)定進行野生動物樣本的取用與銷毀、DNA樣品
的制備與取用。
2.2病毒DNA質(zhì)量檢測
提取的基因組DNA濃度用Qubit熒光計測定,核酸濃度宜大于
等于15ng/ul,核酸總量宜為300ng。DNA完整度較好,260/280比
值范圍宜在1.8~2.0;260/230比值范圍宜在2.0~2.2。達到上述條
件的高質(zhì)量DNA宜進行核酸建庫反應(yīng)。
2.3病毒DNA的保存
針對近期使用的DNA,將裝有DNA的離心管保存于-20℃冰
箱中。近期不使用,需長期保存的DNA離心管保存于-80℃超低溫
冰箱中。同時應(yīng)避免DNA反復(fù)凍融,盡可能保證DNA的高質(zhì)量。
2.4病毒DNA樣品測序文庫的制備
本標(biāo)準(zhǔn)中采用的測序儀為成都齊碳科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的納
米孔基因測序儀QNome-3841,因此使用配套開發(fā)的DNA文庫構(gòu)建
試劑盒(QDL-EV1.1)進行測序文庫的制備。
2.5病毒DNA樣品測序文庫的質(zhì)量檢測
制備完成的DNA文庫用Qubit熒光計測定核酸濃度,濃度宜等
于或大于2ng/ul,核酸總量宜不少于25ng。達到上述條件的DNA文
庫可直接進行病毒DNA測序反應(yīng)或放于-20℃冰箱保存。
2.6病毒DNA樣品測序
本標(biāo)準(zhǔn)中采用的測序儀為成都齊碳科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的納
米孔基因測序儀QNome-3841,因此使用配套開發(fā)的DNA文庫測序
試劑盒(QDSV1.1)進行的病毒DNA測序。
2.7病毒DNA序列分析鑒定及全基因組信息獲取
基于我們開發(fā)的具有友好交互界面的實時序列鑒定程序,測序核
酸上機2~3分鐘內(nèi),程序會自動識別測序輸出文件夾中的改變,每
當(dāng)一條DNA序列被測序輸出后,便會立馬使用通用系列對比程序
minimap2與參考數(shù)據(jù)庫進行比對,并將后臺統(tǒng)計的比對結(jié)果累計輸出
至交互界面,直至測序完成。程序?qū)⒃跍y序完成后,繼續(xù)進行如下分
析:
提取已鑒定為同種病毒的納米孔測序短片段堿基系列(reads)到
以該種病毒命名的fasta/fastq文件夾并標(biāo)注。
有參拼接當(dāng)前短片段堿基系列(reads)可以拼接到的最長片段堿
基系列(contig)。
以該最長片段堿基系列(contig)為參考序列,對總的測序短片
段堿基系列(reads)再次比對,以發(fā)現(xiàn)漏掉的與數(shù)據(jù)庫相似度不高的
片段。
再次拼接,以獲得當(dāng)前樣本可獲得的近完整基因組。
為了保證比對速度不影響比對效率,我們所使用的病毒參考序列
數(shù)據(jù)庫來源于Virus-HostDB(https://www.genome.jp/virushostdb/),
選取所有以脊椎動物為宿主的參考病毒范疇,對于每一種病毒,其包
含的信息有:病毒名、病毒NCBI的ID、病毒的分類、宿主名、宿
主NCBI的ID、宿主的分類、信息來源、文章的DOI等。
(二)團標(biāo)確定依據(jù)
該標(biāo)準(zhǔn)適用野生動物血液、組織、病毒分離培養(yǎng)物等樣品及相關(guān)
樣品的核酸提取物中腺病毒的檢測。技術(shù)內(nèi)容包含樣本選取和保存、
樣本處理及核酸提取、病毒DNA建庫、病毒DNA測序、病毒種類
鑒定及全基因組遺傳信息獲取。計劃在立項后6個月完成標(biāo)準(zhǔn)制定,
根據(jù)學(xué)會團體標(biāo)準(zhǔn)制定管理規(guī)定完成后續(xù)征求意見、審核、發(fā)布等工
作。
三、國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)情況簡要說明
2001年國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T14926.27-2001實驗動物小鼠腺病毒檢測
方法》頒布。2012年行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T3307-2012口岸食源性疾病腺
病毒PCR檢測方法》頒布。2021年行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T4027-2021I群禽
腺病毒檢測方法》頒布。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14926.27-2001為小鼠腺病毒
生化檢測技術(shù)方法,兩個行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重于傳統(tǒng)的熒光PCR及病毒分
離方面。在檢測時長、核酸系列信息確定(三代高通量測序)、病毒
類型快速鑒定方面有所欠缺,存在精準(zhǔn)性偏差及用時較長的情況。我
們的技術(shù)是針對檢測野生動物的攜帶的所有型別的腺病毒。
四、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù);
無
五、其他應(yīng)予以說明的事項。
無
《野生動物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》
標(biāo)準(zhǔn)起草小組
2024年4月30日
《野生動物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》
團體標(biāo)準(zhǔn)編制說明
一、工作簡況
(一)任務(wù)來源
2024年3月,中國科學(xué)院昆明動物研究所申請《野生動物腺病毒
高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》團體標(biāo)準(zhǔn)的立項工作,該標(biāo)準(zhǔn)立項得到科
技部重點研發(fā)項目“高黎貢地區(qū)野生動物全景動態(tài)監(jiān)測體系建設(shè)與安
全評估示范”支持,批準(zhǔn)由中國科學(xué)院昆明動物研究所負(fù)責(zé)《野生動
物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》團體標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。
(二)起草單位
起草單位:中國科學(xué)院昆明動物研究所
協(xié)作單位:無
(三)主要工作過程
1.成立項目組
成立標(biāo)準(zhǔn)制定項目組,明確項目組成員的工作職責(zé),對相關(guān)國家
標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)資料進行調(diào)查與整理。
2.標(biāo)準(zhǔn)起草
通過對前期研究工作的總結(jié)和對收集資料的分析統(tǒng)計,確定野生
動物腺病毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程的框架,包括野生動物樣本采集
和保存、樣本處理及核酸提取、病毒DNA建庫、病毒DNA測序、
病毒種類鑒定及全基因組遺傳信息獲取等內(nèi)容,參照標(biāo)準(zhǔn)編寫格式,
起草小組編寫了標(biāo)準(zhǔn)草案稿。
3.實驗驗證
標(biāo)準(zhǔn)草案完成后,中國科學(xué)院昆明動物研究所對有關(guān)各項技術(shù)指
標(biāo)進行了實驗驗證。通過驗證,對存在問題作了研究和驗證,補充完
善本標(biāo)準(zhǔn),形成標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿。
4.專家意見征詢
本標(biāo)準(zhǔn)廣泛征求了中國科學(xué)院昆明動物研究所、中國科學(xué)院武漢
病毒研究所等專業(yè)領(lǐng)域?qū)<业囊庖?,根?jù)專家提出的意見和建議,經(jīng)
項目組內(nèi)部充分討論,進行分析、整理和完善,完成《野生動物腺病
毒高通量快速鑒定技術(shù)規(guī)程》送審稿及編制說明,等待召開標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)
審查會。
(四)標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做工作
職務(wù)/
姓名性別工作單位任務(wù)分工
職稱
中國科學(xué)院昆明項目負(fù)責(zé)人,組織項目實施及
楊麗萍女實驗師
動物研究所標(biāo)準(zhǔn)文本起草、標(biāo)準(zhǔn)實驗研究
中國科學(xué)院昆明
楊興婁男研究員組織項目實施及標(biāo)準(zhǔn)文本起草
動物研究所
中國科學(xué)院昆明
李豐邑男博士生主要起草人、標(biāo)準(zhǔn)實驗研究
動物研究所
中國科學(xué)院昆明
趙鍇男博士生主要起草人、標(biāo)
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