(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(10)申請公布號CN120204474A(21)申請?zhí)?02510688804.3(71)申請人華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院地址430000湖北省武漢市解放大道1277號(72)發(fā)明人喬韓華邱翔李高鋒范鵬凝董念國(74)專利代理機構(gòu)北京鑫瑞森知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11961專利代理師張旭A61L27/34(2006.01)(54)發(fā)明名稱一種促內(nèi)皮化的組織工程心臟瓣膜及其制備方法和應(yīng)用本發(fā)明公開了一種促內(nèi)皮化的組織工程心臟瓣膜及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。包括以下步驟：S1、紅細胞膜囊泡膜NP-CHS-DHV的制備；通過該方法即可獲得促內(nèi)僅提高了血液相容性，減少了血小板粘附和免疫識別，還實現(xiàn)了內(nèi)皮化的加速。本發(fā)明提供了一GUNP-Chs-DHVGUNP-Chs-DHV21.一種促內(nèi)皮化組織工程心臟瓣膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：取全血1000-3000rpm離心10-20min,重懸于含EDTA-K2的PBS緩沖液中，4-8℃孵育20-L、50-150μM的CLS-PEG-SA,15-20℃下反應(yīng)20-40min,洗滌得RBCM-Biotin;取SA與生物素化CD144抗體混合，20-30℃下孵育20-40min形成SA-抗體復(fù)合物，取50-100μg復(fù)合物與1-5mLRBCM-Biotin混合，15-20℃下反應(yīng)20-40min獲得RBCM-Ab;以NaCl溶解的終濃度為100-300mg/mL的2dDR溶液為內(nèi)水相W1;以添加乙醇、且含有1-超聲10-50s得初乳；以含泊洛沙姆188的NaCl溶液作為外水相W2;將初乳注入外水相W2中，40-60W下冰浴超聲10-50s,500-1500rpm攪拌10-20h得復(fù)乳；1-5℃、5000-15000rpm離心10-取1-5mLRBCM-Ab和1-10mg2dDR-PLGA-NPs混合1-10min,擠出器擠壓得RBCM-Ab/制備OChS;將DHV與10-20%的OChS溶液以質(zhì)量體積比為0.5:1-1:1比例混合，30-40℃孵育12-36h得Chs-DHV;將1-5gChs-DHV與終濃度為0.05-0.15M的EDC/NHS溶液混合，35-40℃、100-150rpm反應(yīng)1-5h,加入1-5mg步驟S3所得，孵育12-36h,洗滌即得NP-CHS-DHV。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中取全血在4℃下、2000rpm離心10min,用PBS溶液洗滌3次獲得純化紅細胞，將其重懸于含有100mMEDTA-K2的3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，向所述1mLRBCM懸液中加入50μL、濃與10μg生物素化CD144抗體混合，25℃下孵育30min形成SA-抗體復(fù)合物，取60μg復(fù)合物與4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中以0.5%NaCl溶解的終油相0。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述初乳為取75μL的內(nèi)水相W1滴入375μL的油相0中，在50W功率下冰浴超聲30s獲得；外水相W2為含有2%泊洛沙姆188的5%NaCl溶液；將450μL初乳注入4.5mL的W2外水相中以50W功率下再次冰浴超聲30s、然后1000rpm下磁力攪拌12h獲得復(fù)乳；將復(fù)乳在4℃下、以10000rpm子水洗滌3次、-80℃下凍干24h獲得2dDR-PLGA-NPs納米顆粒。32dDR-PLGA-NPs納米顆粒超聲混合5min,使用擠出器經(jīng)200nm聚碳酸酯膜擠壓20次獲得7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S4中將生物瓣膜材料置于的TRIS-HCl緩沖液中，室溫震蕩處理24h,獲得脫細胞心臟以質(zhì)量體積比為0.8:1的比例混合在37℃下孵育24h獲得Chs-DHV;將2.5gChs-DHV與終濃9.一種促內(nèi)皮化組織工程心臟瓣膜，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述制備方法制備獲得。10.權(quán)利要求9所述的組織工程心臟瓣膜在制備抗血栓、促內(nèi)皮化以及抗鈣化功能材料中的應(yīng)用。4技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種促內(nèi)皮化的組織工程心臟瓣膜及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]當前的組織工程心臟瓣膜(TEHVs)為一種替代傳統(tǒng)人工瓣膜的有前景的材料，但異種去細胞瓣膜(xDHVs)的內(nèi)皮化延遲嚴重限制了其臨床應(yīng)用。內(nèi)皮化依賴于骨髓來源的祖細胞(EPCs)和心內(nèi)膜細胞的遷移，現(xiàn)有的策略尚未能有效解決細胞招募和粘附不足的問發(fā)明內(nèi)容第一個方面，本發(fā)明提供了一種促內(nèi)皮化組織工程心臟瓣膜的制備方法，包括以下步驟：取全血在4-8℃下、1000-3000rpm離心10-20min,用PBS溶液洗滌獲得純化紅細胞，將純化紅細胞重懸于含有50-150mMEDTA-K2的PBS緩沖液中，4-8℃孵育20-40min,在該溫度下11000-13000rpm離心10-20min,收集沉淀即得RBCM;向1-2mLRBCM懸液中加入40-60μL、濃度為50-150μM的CLS-PEG-SA,15-20℃下振蕩反應(yīng)20-40min,PBS洗滌獲得生物素功能化囊泡RBCM-Biotin;將40-60μ40min形成SA-抗體復(fù)合物，取50-100μg復(fù)合物與1-5mLRBCM-Biotin混合，15-20℃下反應(yīng)S2、2dDR-PLGA-NPs納米顆粒的制備：用0.1-0.5%NaCl溶液溶解2dDR至2dDR終濃度為100-300mg/mL獲得內(nèi)水相W1;含350-400μL的油相0中，在40-60W功率下冰浴超聲乳化10-50s獲得初乳；以含1-5%泊洛沙姆188的1-10%NaCl溶液作為外水相W2;將初乳注入外水相W2中，40-60W功率下冰浴超聲乳化10-50s,500-1500rpm下磁力攪拌10-20h獲得復(fù)乳；在1-5℃下以5000-15000rpm離心10-將生物瓣膜材料置于30-50mM含有1-5%CHAPS和1-5mmol/1TnBP的TRIS-HCl緩沖液中，室溫震蕩處理12-36h,無菌水漂洗5-10次，每次5-15min,再將其置于30-50mM含有1-5的比例混合，在30-40℃下孵育12-36h獲得Chs-DHV;將1-5gChs-DHV與終濃度為0.05-[0004]進一步的，所述步驟S1中取全血在4℃下、2000rpm離心10min,用PBS溶液洗滌3次獲得純化紅細胞，將其重懸于含有100mMEDTA-K2的0.25×PBS溶液中，4℃下孵育30min、振蕩反應(yīng)30min,PBS洗滌3次獲得RBCM-Biotin;將50μgSA與10μg生物素化CD144抗體混合，25℃下孵育30min形成SA-抗體復(fù)合物，取60μg復(fù)合物與1mLRBCM-Biotin混合，18℃下反應(yīng)[0012]第三個方面，本發(fā)明還提供了所述的組織工程心臟瓣膜在制備抗血栓、促內(nèi)皮化以及抗鈣化功能材料中的應(yīng)用。[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明公開了一種促進心臟瓣膜內(nèi)皮化的方法及人造細胞膜修飾的納米顆粒加速內(nèi)皮細胞的粘附和遷移，采用抗VE-cadherin抗體功能化的紅6過紅細胞膜殼層的功能性設(shè)計，不僅提高了血液相容性，減少了血小板粘附和免疫識別，還實現(xiàn)了內(nèi)皮化的加速。該方法提供了一種創(chuàng)新的策略，可顯著提高組織工程心臟瓣膜的內(nèi)皮化效率和臨床應(yīng)用前景。附圖說明圖2為本發(fā)明實施例1中NP-Chs-DHV結(jié)構(gòu)與形貌表征結(jié)果；圖3為本發(fā)明實施例1中NP-Chs-DHV成分表征結(jié)果；圖4為本發(fā)明實施例2中兔頸動脈植入模型實驗示意圖；圖5為本發(fā)明實施例2中NP-Chs-DHV在體內(nèi)血液相容性表征結(jié)果；圖6為本發(fā)明實施例2中NP-Chs-DHV進行腹主動脈移植28天后，組織學(xué)染色結(jié)果；圖7為本發(fā)明實施例2中NP-Chs-DHV進行腹主動脈移植28天后，對巨噬細胞表型，一型膠原蛋白、內(nèi)皮細胞以及間質(zhì)細胞進行染色分析的結(jié)果。具體實施方式[0015]為對本發(fā)明進行更好的說明，特列舉實施例如下。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的一部分，而不是全部實施例，基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。[0016]下面通過附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。[0017]實施例1雙功能化脫細胞納米粒交聯(lián)工程瓣膜組(NP-Chs-DHV)的制備1.CD144抗體工程化紅細胞膜囊泡(RBCM-Ab)的制備為增強內(nèi)皮細胞粘附性，采用雙末端修飾連接劑Chol-PEG-Biotin對紅細胞膜囊7.4的PBS溶液洗滌3次獲得純化紅細胞；(2)低滲裂解：將純化紅細胞重懸于含EDTA-K2(100mM)的0.25×PBS中，4℃孵育(3)抗體偶聯(lián)：PEG-SA(MW2000Da),于18℃溫和振蕩反應(yīng)30min,隨后用PBS洗滌3次以去除未結(jié)合的連接抗體組裝：以1:1摩爾比將50μg鏈霉親和素(SA)與10μg生物素化CD144抗體(廠飾到紅細胞膜上。7[0020]2.2dDR-PLGA-NPs納米顆粒的制備2-脫氧-D-核糖(2dDR)載藥PLGA納米顆粒(2dDR-PLGA-NPs)采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法[0021](1)內(nèi)水相(W1):采用0.5%NaCl溶液溶解2dDR至2dDR終濃度為200mg/mL;(2)油相(O):含有5%PLGA(LA:GA=50:50,PLGA分子量MW:3000-6000Da,貨號：P134566)的乙酸乙酯溶液，添加5%乙醇增強相容性；(4)外水相(W2):5%NaCl溶液含2%泊洛沙姆188;(5)復(fù)乳(W/0/W):450μL初乳注入4.5mL的W2相二次超聲(相同參數(shù)),磁力攪拌(1000rpm,12h)揮發(fā)溶劑；(6)純化：在4℃下、以10000rpm離心20min,離心后去除上清，去離子水洗滌3[0022]3.紅細胞膜囊泡RBCM-Ab包裹納米顆粒的制備采用擠出法制備。條件下超聲5min;將豬主動脈瓣置于含有2%3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)和2mmol/1三丁基膦(TnBP)的TRIS-HCl緩沖液(40mM,pH7.8)中，在室溫下持續(xù)震蕩去細胞處基磺基甜菜堿(ASB-14)和2%硫代甜菜堿10(SB3-10)的TRIS-HCl緩沖液(40mM,pH7.8)中，在室溫下繼續(xù)震蕩去細胞處理24h,獲得脫細胞心臟瓣膜DHV。[0025]5.雙功能化脫細胞納米粒交聯(lián)工程瓣膜NP-Chs-DHV的制備(1)氧化硫酸軟骨素0ChS制備：采用高碘酸鈉(NaIO?)氧化法制備氧化硫酸軟骨素(2)功能化：將脫細胞瓣膜DHV與15%的OChS溶液以質(zhì)量體積比為0.8:1的比例混(3)納米粒交聯(lián)：取2.5g瓣膜Chs-DHV與終濃度為0.1MEDC/NHS溶液在37℃、110rpm下反應(yīng)3h;加入3mgRBCM-Ab/2dDR@PLGA納米粒孵育24h;去離子水洗滌3次，獲得[0026]以DHV、Chs-DHV作為對照組，以實施例1制備獲得的雙功能化脫細胞納米粒交聯(lián)工程瓣膜組(NP-Chs-DHV)為實驗組，分別進行結(jié)構(gòu)和形貌表征。[0027]結(jié)果如圖2所示：圖2中，A圖為大體照片，通過修飾后都不會明顯改變DHV的原本樣貌；B圖為去細胞心臟瓣膜表面及截面SEM圖，表面形貌能夠觀察到交聯(lián)以及修飾不會破壞8[0029]實施例2心臟瓣膜內(nèi)皮化以及抗鈣化效果驗證以脫細胞心臟瓣膜組(DHV組)、戊二醛交聯(lián)去細胞心臟瓣膜組(GLU組)作為對照組，以實施例1制備獲得的雙功能化脫細胞納米粒交聯(lián)工程瓣膜組(NP-Chs-DHV)作為實驗組進行后續(xù)實驗。[0030]DHV組以實施例1中步驟4.脫細胞心臟瓣膜DHV的制備方法進行制備。[0031]GLU組的制備方法為：將上述制備好的DHV擦凈表面水分，取2gDHV放入1.5mL的0.625%戊二醛溶液中，37℃溫箱110rpm交聯(lián)24h,獲得GLU。[0032]1.建立兔頸動脈植入模型，評價支架在血流動力學(xué)環(huán)境下的性能。[0033]動物來源：日本大耳白兔(體重2.5-3.5kg,雄),購自武漢市萬千佳興生物科技有[0034]飼養(yǎng)條件：溫度22±2℃,濕度50±10%,12小時光照/黑暗循環(huán)；單籠飼養(yǎng)，籠具尺寸≥60×40×40cm,配備無菌墊料(每日更換);標準顆粒飼料(粗蛋白≥16%)喂養(yǎng)，自由飲水(滅菌飲用水);實驗前至少7天適應(yīng)環(huán)境，減少應(yīng)激反應(yīng)。瓣膜卷植入動靜脈短路中，在循環(huán)血下運行3h,3h后取出瓣膜卷，檢測瓣膜表面紅細胞黏附[0037]2周后，對支架進行CD31和DAPI免疫熒光染色。4周后，進行多普勒超聲檢查支架的通暢程度，然后對支架進行Masson和VonKossa染[0038]對脫細胞心臟瓣膜(DHV組)、戊二醛交聯(lián)去細胞心臟瓣膜(GV組)以及雙功能化脫細胞納米粒交聯(lián)工程瓣膜組(NP-Chs-DHV組)進行的血液相容性表征，結(jié)果如圖5所示。的血栓，而NP-Chs-DHV展現(xiàn)出優(yōu)異的抗血栓能力；C圖為對頸動脈循環(huán)2h后的樣品表面進行SEM分析結(jié)果，結(jié)果表明NP-Chs-DHV展現(xiàn)出優(yōu)異的抗血栓形成的能力；D圖顯示通過體外血小板黏附實驗也表明，NP-Chs-DHV能夠有效抑制血小板黏附與激活。[0040]2.建立大鼠腹主動脈移植模型動物來源：SD大鼠(體重150-180g,雄),購自武漢市貝恩特生物科技有限公司；實驗方案通過機構(gòu)動物倫理委員會審批，符合ARRIVE指南。[0041]飼養(yǎng)條件：溫度22±2℃,濕度50±10%,12小時光照/黑暗循環(huán)；單籠飼養(yǎng)，籠具尺寸465×285×230mm,配備無菌墊料(每日更換);標準顆粒飼料(粗蛋白≥16%)喂養(yǎng)，自由飲水(滅菌飲用水);實驗前至少7天適應(yīng)環(huán)境，減少應(yīng)激反應(yīng)。[0043]1)麻醉與備皮9麻醉：腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)或異氟烷吸入誘導(dǎo)(4%)+維持麻醉兩，異氟烷吸入(1.5-2%);2)腹主動脈暴露切口：腹中線切口(長度3-4cm),逐層分離肌肉暴露腹腔；定位：將腸道輕柔推至右側(cè)，暴露腹主動脈(腎動脈分叉至骼動脈分叉段);游離血管：鈍性分離腹主動脈周圍結(jié)締組織，預(yù)留約15mm游離段；3)瓣膜管道制備瓣膜塑形：將5×5mm瓣膜片NP-Chs-DHV卷成管狀(內(nèi)徑≈1.5mm),PDS8-0線連續(xù)縫合邊緣固定；預(yù)處理：將管道浸泡于肝素化生理鹽水(50U/mL)10min;4)血管移植(端端吻合)阻斷血流：微型血管夾阻斷腹主動脈近心端和遠心端；截斷血管：在阻斷段中央橫向切斷腹主動脈(長度≈5mm);吻合操作(顯微鏡下):點方向);遠心端：將卷成管狀的瓣膜片以同法完成吻合，確保內(nèi)膜對合整齊，無扭曲或張[0044]5)術(shù)中處理防痙攣：吻合口滴注罌粟堿(0.5mg/mL)緩解血管收縮；6)實驗終點與樣本采集安樂死：CO?吸入過量法或戊巴比妥鈉(150取材：完整切取移植段血管(含兩端吻合口);采用4%多聚甲醛固定(組織學(xué))或液氮速凍(分子檢測);[0045]圖6為腹主動脈移植28天后，組織學(xué)染色結(jié)果。從圖6的結(jié)果能夠看出NP-Chs-DHV能夠有效抑制瓣膜鈣化，和DHV相比也能夠有效的抑制瓣膜降解，同時滿足細胞浸潤的需[0046]圖7為腹主動脈移植28天后，對巨噬細胞表型、一型膠原蛋白、內(nèi)皮細胞以及間質(zhì)細胞進行染色分析的結(jié)果。從圖7的結(jié)果能夠看出，NP-Chs-DHV組能夠顯著誘導(dǎo)巨噬細胞向M2表型極化，能夠有效促進一型膠原再生，同時在植入14天出現(xiàn)了部分的內(nèi)皮化，在植入28天后實現(xiàn)了完整的內(nèi)皮化，展現(xiàn)出優(yōu)異的再生能力。[0047]以上所述的實施例僅是對本發(fā)明的優(yōu)選方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不