專題4基因工程蘇云金桿菌毒蛋白基因毒蛋白殺死害蟲棉花細胞抗蟲棉的培育什么是目的基因？什么是受體細胞？什么是目的基因的表達產(chǎn)物？基因工程的概念

基因工程是指按照人們的愿望，通過體外_________等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做__________技術(shù)。

例如，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以實現(xiàn)利用大腸桿菌生產(chǎn)人的胰島素。在此實例中，目的基因是_______________，受體細胞是_______________，目的基因的表達產(chǎn)物是__________。

轉(zhuǎn)基因重組DNA人胰島素基因大腸桿菌細胞人胰島素理論基礎(chǔ)1.DNA的基本組成單位相同(都是四種脫氧核苷酸)2.都遵循堿基互補配對原則3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)

理論基礎(chǔ)1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位2.遺傳信息傳遞都遵循中心法則3.生物界幾乎共用一套遺傳密碼3.3.1重組DNA技術(shù)的基本工具一、限制酶二、DNA連接酶三、運載體（質(zhì)粒、標(biāo)記基因）DNA重組技術(shù)的基本工具

漢水丑生作品（QQ:70939118）四、單酶切和雙酶切磷酸酯鍵基因工程是在DNA上進行的______水平的設(shè)計施工，需要有專門的工具。分子

限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱__________）限制酶限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的。限制酶是細胞的一種防御性工具。當(dāng)原核細胞遭到外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效。EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個字母R型菌株從中分離的第一個限制酶

限制酶的專一性體現(xiàn)在：一種限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的______________，并且使每一條鏈中特定部位的兩個__________之間的_____________斷開。

大腸桿菌中的一種叫做EcoRI的限制酶，能夠?qū)Ｒ蛔R別DNA中的__________序列，并在G和A之間將這段序列切開（實質(zhì)是在____________與14______________之間切斷磷酸二酯鍵）。特定核苷酸序列核苷酸磷酸二酯鍵GAATTC鳥嘌呤脫氧核苷酸腺嘌呤脫氧核苷酸基因的“剪刀”（5′）黏性末端5′5′平末端5′3′5′3′中心軸線EcoRⅠ5′3′5′3′SmaⅠ基因的“剪刀”SmaI能夠?qū)Ｒ蛔R別DNA中的___________序列，并在________之間將這段序列切開（實質(zhì)是在鳥嘌呤脫氧核苷酸與胞嘧啶脫氧核苷酸之間切斷磷酸二酯鍵）。

當(dāng)限制酶在它識別序列的__________________將DNA的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是______末端，而當(dāng)限制酶在它識別序列的_____________切開時，產(chǎn)生的則是平末端。EcoRI切割DNA產(chǎn)生______末端，SmaI切割DNA產(chǎn)生______末端。GGGCCCG和C中心軸線兩側(cè)黏性中心軸線處黏性平基因的“剪刀”同尾酶限制酶的識別序列通常為6個核苷酸，也有的為4個核苷酸或8個核苷酸一、限制酶二、DNA連接酶三、運載體（質(zhì)粒、標(biāo)記基因）DNA重組技術(shù)的基本工具

漢水丑生作品（QQ:70939118）四、單酶切和雙酶切

現(xiàn)有來自兩種生物的DNA片段1和DNA片段2，用同一種限制酶處理后，DNA片段1和2帶有______的黏性末端。在一個混合體系中，DNA片段1和2隨機碰撞在一起時，黏性末端之間會自發(fā)形成______，但不同DNA片段骨架上的缺口無法自動連接。DNA連接酶的作用是：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被________切開的兩個__________之間的____________。相同氫鍵限制酶核苷酸磷酸二酯鍵基因的“針線”類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源________________________功能只縫合____________縫合____________和____________結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯鍵5′5′5′5′3′3′5′5′T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源________________________功能只縫合____________縫合____________和____________結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯鍵3′3′5′5′5′5′5′5′T4DNA連接酶DNA連接酶的作用示意圖DNA聚合酶的作用示意圖同尾酶

練習(xí)1、已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。

（1）則能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；

（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。

（3）DNA1被限制酶I切割，DNA2被限制酶II切割，加入DNA連接酶可得到DNA1和DNA2的重組DNA片段，該重組DNA片段__________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割，_______（能/不能/不一定能）被限制酶II切割。能不一定能能不一定

練習(xí)1、已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。（3）DNA1被限制酶I切割，DNA1被限制酶II切割，加入DNA連接酶可得到DNA1和DNA2的重組DNA片段，該重組DNA片段__________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割，_______（能/不能/不一定能）被限制酶II切割。能不一定—GGATCX——CCTAGX——XGATCX——XCTAGX——G—CCTAGGATCX—

X——GGATCC——CCTAGG—與DNA相關(guān)的五種酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶磷酸酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈一、限制酶二、DNA連接酶三、運載體（質(zhì)粒、標(biāo)記基因）DNA重組技術(shù)的基本工具

漢水丑生作品（QQ:70939118）四、單酶切和雙酶切

通常是利用______作為載體，將目的基因送入受體細胞中。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或細菌擬核DNA之外，并具有___________能力的很小的雙鏈______DNA分子。

在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有________________、_________等。質(zhì)粒自我復(fù)制環(huán)狀噬菌體動植物病毒一段特殊的DNA序列，DNA聚合酶的識別和結(jié)合位點基因的“運輸車”質(zhì)粒作為運載體的優(yōu)點：

①質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點，便于_____________________；

②質(zhì)粒含有復(fù)制原點，可在受體細胞中進行自我復(fù)制，或整合到受體細胞______________；

③質(zhì)粒DNA分子上有特殊的____________，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，供重組DNA的________________。外源DNA片段（目的基因）插入染色體DNA上標(biāo)記基因鑒定和選擇基因的“運輸車”思考：形成一個重組質(zhì)粒會形成_____個磷酸酯鍵？4

練習(xí)2、普通的細菌一般是對抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基中______（能/不能）生長。如果給普通細菌導(dǎo)入一個含有四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒，四環(huán)素抗性基因的____________可使細菌獲得抵抗四環(huán)素的性狀。敏感不能表達產(chǎn)物2016課標(biāo)I卷40、

某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：

結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞不能區(qū)分的，其原因是__________________________________________________________；并且____________________和_____________________________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是__________________________________。二者均不含氨芐青霉素抗性基因，二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不能生長

在該培養(yǎng)基上均能生長

含有質(zhì)粒載體

含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒

在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有＿＿＿＿的固體培養(yǎng)基。四環(huán)素一、限制酶二、DNA連接酶三、運載體（質(zhì)粒、標(biāo)記基因）DNA重組技術(shù)的基本工具

漢水丑生作品（QQ:70939118）四、單酶切和雙酶切

練習(xí)4、圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（1）在基因工程的操作中，不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞__________和________________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________________。目的基因質(zhì)粒上的抗生素抗性基因目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中關(guān)于限制酶的選擇

練習(xí)4、圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（3）由于反應(yīng)體系中含有大量的外源DNA片段和質(zhì)粒，加入PstI一種限制酶后，會得到大量的目的基因片段和質(zhì)粒片段，再加入DNA連接酶后，除了會形成目的基因與質(zhì)粒連接的環(huán)狀產(chǎn)物外，還會形成________________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物以及_______________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物。此外，目的基因與質(zhì)粒的連接既可以是正向連接，也可以是______________，后者可能會導(dǎo)致目的基因無法正常表達。??…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG

AATTCGGCATAC…GCCGTATG…????…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG目的基因

AATTCGGCATAC…GCCGTATG……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG目的基因

AATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG目的基因單酶切：同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒在反應(yīng)體系中會加入大量的含目的基因的DNA片段和大量的質(zhì)粒，加入同一種限制酶和DNA連接酶后，會出現(xiàn)質(zhì)粒自身首尾成環(huán)、兩個質(zhì)粒成環(huán)、目的基因片段首尾成環(huán)、兩個目的基因片段成環(huán)、目的基因正向插入質(zhì)粒、目的基因反向插入質(zhì)粒等多種情況。BamHⅠGGATCCAAGCTTGGGCCTAGGTTCGAACCCCCCAAGCTTGGGTTCGAAHindⅢHindⅢBamHⅠBt基因HindⅢXbaⅠSmaⅠ多克隆位點動子啟終子止標(biāo)R記基因Kan復(fù)制原點Bt基因Bt基因AGCTTAGGATCCACCTAGGTTCGABt基因Bt基因Bt基因DNA連接酶同一種限制酶切（單酶切）BtBtBt基因Bt基因Bt基因Bt基因同兩種限制酶切（雙酶切）質(zhì)粒與質(zhì)粒連接后的運載體過大，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化難以發(fā)生，故不予考慮避免自身環(huán)化，增大目的基因和運載體連接的概率，少能避免反向連接AGCTTAGCCTAGBt基因5′5′Bt基因

練習(xí)4、圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（3）由于反應(yīng)體系中含有大量的外源DNA片段和質(zhì)粒，加入PstI一種限制酶后，會得到大量的目的基因片段和質(zhì)粒片段，再加入DNA連接酶后，除了會形成目的基因與質(zhì)粒連接的環(huán)狀產(chǎn)物外，還會形成________________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物以及_______________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物。此外，目的基因與質(zhì)粒的連接既可以是正向連接，也可以是______________，后者可能會導(dǎo)致目的基因無法正常表達。目的基因與目的基因質(zhì)粒片段與質(zhì)粒片段反向連接

練習(xí)4、圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（4）為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接，可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，例如可選擇用__________和__________這兩種限制酶。PstⅠEcoRⅠ實驗原理可以利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在理化性方面的差異，對它們進行提取DNA不溶于酒精，某些蛋白質(zhì)溶于酒精DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液中在一定的溫度下（沸水?。?，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑DNA的粗提取與鑒定1．30g洋蔥切碎＋10mL研磨液，充分研磨。2．雙層紗布過濾，4℃放置幾分鐘，取上清液。加入等體積冷酒精，靜置2～3min，用玻璃棒沿一個方向攪拌卷起絲狀物?？商鎿Q操作：1500r/min離心5min，取上清液。然后10000r/min離心5min，取管底沉淀物晾干。DNA的粗提取與鑒定3．2M的NaCl

5mL＋絲狀物或沉淀物。再加二苯胺試劑4mL混勻，沸水浴5min，冷卻后觀察到藍色（不加DNA做對照）。DNA重組技術(shù)的基本工具1944年，艾弗里（O.Avery，1877-1955)等人通過肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗，不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉(zhuǎn)移。1958年，梅塞爾森（M.Meselson，1930-）和斯塔爾（F.W.Stahl。1929-）用實驗證明了DNA的半保留復(fù)制。隨后不久，克里克提出中心法則。1961年，尼倫伯格（M.W.Nirenberg，1927-2010）和馬太（J.H.Matthaei，1929-）破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子，截止1966年64個密碼子均倍破譯。1970年，科學(xué)家在細菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限1972年，伯格（P.Berg，1926-）首先在體外進行了DNA改造的研究，成功構(gòu)建了第一個體外重組DNA分子。1973