組蛋白去乙?；窰DAC11在乳腺癌中的初步研究【摘要】目的：乳腺癌位于我國(guó)發(fā)生在女性癌癥發(fā)病率最高的癌癥之一，一直未有十分有效的治療手段。近年來(lái)，分子靶向治療成為重要的研究手段，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；竻⑴c調(diào)控乳腺癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在眾多研究中，對(duì)于HDAC11在乳腺癌中的研究較少。方法：本論文通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)人組蛋白去乙酰化酶HDAC11進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，包括結(jié)構(gòu)域，同源性，3D結(jié)構(gòu)，在腫瘤的表達(dá)量等，并構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體HDAC11檢測(cè)其在乳腺癌中表達(dá)。結(jié)果：本論文首先對(duì)組蛋白去乙?；窰DAC11作了生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示HDAC11在進(jìn)化上相對(duì)保守，并對(duì)HDAC11的3D結(jié)構(gòu)域和互作蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)，以及預(yù)測(cè)了人的HDAC11基因在腫瘤及乳腺癌中的表達(dá)譜，其在乳腺癌中異常表達(dá)，隨后構(gòu)建了HDAC11載體，成功在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中表達(dá)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)為組蛋白去乙?；窰DAC11在乳腺癌的進(jìn)一步研究做了鋪墊，為乳腺癌的新藥研發(fā)提供了新的理論基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】乳腺癌；去乙?；?；功能預(yù)測(cè)Preliminarystudyofhistonedeacetylaseinbreastcancer[Abstract]Inourcountry,breastcancerisoneofthehighestratesoffemalecancers,andtherearenoveryeffectivetreatments.Inrecentyears,moleculartargetedtherapyhasbecomeanimportantmeansofresearch.Studieshavefoundthathistonedeacetylaseisinvolvedinregulatingtheoccurrenceanddevelopmentofbreastcancertumors.However,innumerousstudies,therearefewstudiesoninbreastcancer.Therefore,inthispaper,thefunctionpredictionofhumanhistonedeacetylasewascarriedoutthroughbioinformaticsanalysis,includingdomain,homology,3Dstructure,expressionamountintumor,etc.,andtheoverexpressionvectorwasconstructedtoexpressinbreastcancer.Resultsandconclusions:Inthispaper,thehistonedeacetylasewasanalyzedandpredictedbybioinformatics.Theresultsshowedthatwasrelativelyconservedinevolution.The3Ddomainandinteractingproteinsofwerepredicted,andtheexpressionprofileofhumangenewaspredictedintumorandbreastcancer.Subsequently,vectorwasconstructedandsuccessfullyexpressedinbreastcancercellsMCF-7.Itpavedthewayforthefurtherstudyofhistoneinbreastcancerandprovidesanewtheoreticalbasisfortheresearchanddevelopmentofnewdrugsforbreastcancer.[Keywords]Breastcancerdeacetylasefunctionprediction目錄1前言 -1-1前言研究背景HDACs能在多種腫瘤組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，是一種應(yīng)用廣泛的組蛋白去乙?；讣易澹撁冈谀[瘤的發(fā)生過(guò)程以及發(fā)展過(guò)程中會(huì)發(fā)揮相應(yīng)作用，根據(jù)該作用，可以推測(cè)HDACs是治療腫瘤的有效靶點(diǎn)。組蛋白去乙?；笇儆诘鞍酌割?lèi)型，HDACs發(fā)揮抗腫瘤作用是通過(guò)改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)并且調(diào)節(jié)基因的表達(dá)過(guò)程的作用機(jī)制進(jìn)行的。在調(diào)控基因動(dòng)態(tài)表達(dá)方面，組蛋白的翻譯后修飾有著重要的作用。組蛋白翻譯后修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、ADP-核糖基化、泛素化和小分子類(lèi)泛素化ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[1]。有研究表明HDAC11可調(diào)控NKG2D-CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)功能，由此發(fā)揮HDAC11抗腫瘤作用ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[2]。HDACs通過(guò)在腫瘤細(xì)胞里實(shí)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)的方式，以增強(qiáng)其去乙?；男Ч?，進(jìn)而抑制其中特定基因的表達(dá)過(guò)程。因此，HDACs能夠影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[3]。HDAC11是第Ⅳ類(lèi)HDAC的唯一代表，是Gao等人于2002年通過(guò)基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)酵母Hos3的同源序列搜索發(fā)現(xiàn)的。HDAC11主要負(fù)責(zé)調(diào)控DNA復(fù)制因子CDT1的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并調(diào)控Interleukin10的表達(dá)ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[4]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目前已發(fā)現(xiàn)18種HDACs，并將HDACs分為四類(lèi)，分別為I類(lèi)（包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8）、II類(lèi)（包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10）、III類(lèi)、IV類(lèi)（僅包含HDAC11）。其中，組蛋白去乙?；?1是HDAC家族中唯一的Ⅳ類(lèi)成員，是現(xiàn)如今發(fā)現(xiàn)的最小的HDAC成員。表1HDAC的分類(lèi)和特點(diǎn)HDACclassificationMemberscharacteristicsⅠclassHDAC1、2、3、8Zn+dependenttype,distributedinthenucleusⅡclassaHDAC4、5、7、9Zn+dependenttype,distributedinthenucleusorcytoplasmⅡclassbHDAC6、10Zn+dependenttype,distributedincytoplasmⅢclassSIRT1、2、3、4、5、6、7NAD+dependenttype,distributedinthenucleus,cytoplasmormitochondriaⅣclassHDAC11Zn+dependenttype,distributedinthenucleusHDAC11是一種生物蛋白，具有多種功能，可以發(fā)揮多種酶活性，HDAC11分布在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼347殘基蛋白與Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)HDAC蛋白，在催化核心區(qū)具有相同的序列相似性。HDAC11可以調(diào)節(jié)組蛋白的去乙酰化，進(jìn)行mRNA的剪切以及非組蛋白結(jié)合ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[5-6]。乳腺癌是最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[7]。乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子的作用下發(fā)生增殖失控而出現(xiàn)的惡性病變，乳房腫塊、腋窩淋巴結(jié)腫大等是其早期表現(xiàn)，晚期會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，危及人們的生命健康[8]。乳腺癌具有高度異質(zhì)性，根據(jù)分子分型主要分為3類(lèi)：三陰性乳腺癌、人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性乳腺癌、激素受體陽(yáng)性乳腺癌ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[9]。根據(jù)分子水平可被分為4種分子亞型，即管腔上皮A型、管腔上皮B型、HER2過(guò)表達(dá)型、三陰性乳腺癌[10]。腫瘤標(biāo)志物可用于乳腺癌篩檢、診療及預(yù)后監(jiān)測(cè)，可細(xì)分為糖類(lèi)抗原153、癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白片段9、糖類(lèi)抗原125和組織多肽特異性抗原、原癌基因人表皮生長(zhǎng)因子2[11]。組蛋白去乙?；敢种苿┦前邢虬┘?xì)胞表觀(guān)基因組的代表性藥物，美國(guó)食品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了以組蛋白與乙?；敢种苿榇淼亩喾N表觀(guān)遺傳藥物用于腫瘤治療。多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與組蛋白去乙?；傅漠惓１磉_(dá)關(guān)系密切，所以抗腫瘤治療方式可以從靶向遺傳異常表達(dá)的HDACs尋找。靶向異常表達(dá)的HDACs已被認(rèn)為是一種有效的抗腫瘤治療方式[12]。目前，組蛋白去乙?；窰DAC11在乳腺癌中的作用機(jī)制及影響的相關(guān)研究較少，在此對(duì)其進(jìn)行相關(guān)預(yù)測(cè)及研究。研究意義中國(guó)是世界上乳腺癌發(fā)病率最高的國(guó)家，并且中國(guó)乳腺癌發(fā)病率正呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，2020年中國(guó)確診乳腺癌總?cè)藬?shù)為416317例,死亡數(shù)則為117174例[13]，所以有必要對(duì)乳腺癌發(fā)病后的作用機(jī)制及影響進(jìn)行探究，從而尋找乳腺癌的治療手段。通過(guò)去獲取乙酰化酶HDAC11CDS序列，對(duì)其結(jié)構(gòu)域，互作蛋白，3D結(jié)構(gòu)，腫瘤表達(dá)譜進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建了過(guò)表達(dá)HDAC11載體并將其導(dǎo)入乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，初步探究HDAC11過(guò)表達(dá)載體能夠在人乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)。本論文深化了對(duì)去乙?；窰DAC11的認(rèn)識(shí)，為拓寬乳腺癌治療途徑提供了理論基礎(chǔ)。

2材料與方法2.1供試材料表2供試材料實(shí)驗(yàn)對(duì)象人乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7）試劑、試劑盒反轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物HDAC11-F(10μM)、引物HDAC11-R(10μM)、引物HDAC11-HA-R(10μM)、2×HieffCanace?

PlusPCRMasterMix(WithDye)、ddH2O、EcoRI酶、XhoI酶、10×buffer、T4ligase、T4ligasebuffer、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Translntro?PL、RIPA裂解液、丙烯酰胺、SDS、Tris-HCl、β-巰基乙醇、甘氨酸、Tris、BCA試劑盒、甲醇、PBS、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、乙酸、脫脂奶粉、H2O2、Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇、紅細(xì)胞裂解液、DEPC處理水、dNTP混合物、RNA反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Oligo(dT)1s、2×SYBRGreenqPCRMix、一抗。儀器、耗材電泳儀、電泳槽、離心機(jī)、離心管、硝酸纖維素膜、勻漿器、剪刀、移液槍、刮棒、PCR儀2.2生物信息學(xué)的分析利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，查找和分析目的基因HDAC11的序列，在Genbank中比對(duì)該序列的同源序列，利用NCBI對(duì)HDAC11進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的分析?；趕ilkdatabase3.0（）在線(xiàn)生物信息學(xué)分析了組蛋白去乙?；窰DAC11，在線(xiàn)網(wǎng)站GEPIA2（/#general）對(duì)人的HDAC11基因在不同腫瘤的表達(dá)譜分析。2.3構(gòu)建過(guò)表達(dá)HDAC11載體2.3.1重組HDAC11載體的構(gòu)建及鑒定cDNA提?。罕?cDNA提取步驟與雙酶切步驟實(shí)驗(yàn)過(guò)程1以Trizol法提取人乳腺癌的細(xì)胞MCF-7總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以此為模板擴(kuò)增HDAC11基因片段。2將第一輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。3以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪帶標(biāo)簽的反向引物的PCR。4將第二輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，經(jīng)上述兩輪PCR后得到HDAC11基因片段。第一輪PCR體系、程序見(jiàn)表4、表5；第二輪PCR體系程序見(jiàn)表6、表7。5以限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和XhoI分別雙酶切HDAC11基因片段和pcDNA3.1+載體，雙酶切體系見(jiàn)表8、表96HDAC11基因與載體的連接及連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：將HDAC11基因和pcDNA3.1+載體雙酶切體系于水浴鍋中37℃反應(yīng)5-6h。切割后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收后在T4ligase連接酶的作用下16℃連接過(guò)夜，連接體系如表10表4PCR體系組分體積（μl）DNA模板2引物HDAC11-F(10μM)2引物HDAC11-R(10μM)22×HieffCanace?

PlusPCRMasterMix(WithDye)25ddH2O19表5PCR程序步驟溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)預(yù)變性98°C3min1變性98°C10sec30退火60°C20sec30延伸72°C45sec30終延伸72°C5min1表6PCR體系組分體積（μl）DNA模板2引物HDAC11-F(10μM)2引物HDAC11-HA-R(10μM)22×HieffCanace?

PlusPCRMasterMix(WithDye)25ddH2O19表7PCR程序步驟溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)預(yù)變性98°C3min1變性98°C10sec30退火60°C20sec30延伸72°C45sec30終延伸72°C5min1表8HDAC11基因雙酶切體系組分體積（μl）HDAC11基因35EcoRI酶2XhoI酶210×buffer6ddH2O5表9pcDNA3.1+載體雙酶切體系組分體積（μl）pcDNA3.1+載體35EcoRI酶2XhoI酶210×buffer6ddH2O5表10連接體系組分體積（μl）酶切pcDNA3.1+載體2.5酶切HDAC11基因5T4ligase0.5T4ligasebuffer1ddH2O1總的RNA提取與cDNA合成：用胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化下來(lái)并收集后，再加入1mLTrizol進(jìn)行裂解。冰上孵育、離心，取上清液。氯仿孵育、離心，小心轉(zhuǎn)移上層水相。紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度和純度。瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA條帶完整度。反轉(zhuǎn)錄成cDNA。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：表11質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟步驟實(shí)驗(yàn)操作1將過(guò)夜連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞與HDAC11質(zhì)粒混合2冰上放置30分鐘342℃金屬浴90s4加入500μlLB培養(yǎng)基后，37℃、2000r搖床2小時(shí)55000轉(zhuǎn)離心4分鐘，棄置420μl上清液6取50μl剩余液涂布于LB培養(yǎng)板（含有氨芐抗生素）上7置于恒溫?fù)u床上37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取獨(dú)立存在的單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR菌落的擴(kuò)大培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的大腸桿菌單菌落進(jìn)行挑菌，將單菌落置于含有1ml氨芐培養(yǎng)基的ep管中，37℃2000轉(zhuǎn)搖床1個(gè)小時(shí)，然后加入100μl搖床后的大腸桿菌至40ml氨芐培養(yǎng)基中，將其搖床擴(kuò)大培養(yǎng)12-16小時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行HDAC11質(zhì)粒的抽取操作。HDAC11質(zhì)粒的抽?。罕?2質(zhì)粒抽取過(guò)程步驟實(shí)驗(yàn)過(guò)程13,000-5,000×g離心10min，收集10~15ml菌體2倒棄培養(yǎng)基。加入500ulBufferP1/RNaseA。高速渦旋使細(xì)菌充分重懸3待細(xì)菌重懸后，往重懸液中加入500μlBufferP2，顛倒混勻10次。室溫放置3分鐘，其間顛倒混勻5次4加入250μlButterLEN3至裂解液中，立即顛倒10~15次513000×g離心10min6轉(zhuǎn)移0.95ml上清液至2.0ml離心管中，加入0.95mlBufferLN4至上清中，顛倒混勻5次7將HiPureDNAMiniColumnⅢ柱套在收集管中，轉(zhuǎn)移750ul混合液至柱子中。13,000xg離心60s8倒棄濾液，把柱子套回收集管中，轉(zhuǎn)移750μl混合液至柱子中。13,000xg離心60s9倒棄濾液，把柱子套回收集管中，加入500μlBufferPW1至柱子中。13,000xg離心60s10倒棄濾液，把柱子套回收集管中，加入650μlBufferPW2至柱子中。13,000xg離心30~60s11倒棄濾液，把柱子套回收集管中，13,000xg離心2min干燥柱子去除乙醇12把柱子套在滅菌的1.5ml離心管中，加入40~80μlElutionBuffer至柱子腹中央。靜置2min，13000×g離心1min洗脫DNA13棄去柱子，把質(zhì)粒保存至-20°C2.3.2重組HDAC11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MCF-7表13細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟步驟實(shí)驗(yàn)過(guò)程1將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)24h，24h后觀(guān)察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度達(dá)到80%，則可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染2轉(zhuǎn)染之前將6孔板中培養(yǎng)基換成不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基3對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋3μg的重組HDAC11質(zhì)粒，混勻。另外使用250μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋5-10μl的HieffTransR脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑4將稀釋的DNA和稀釋的脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑混勻，靜置15min，5將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的混合液加入至6孔板中，于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6細(xì)胞轉(zhuǎn)染5h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，后續(xù)可進(jìn)行蛋白提取操作2.4檢測(cè)HDAC11對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察：用顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染重組HDAC11后人乳腺癌細(xì)胞MCF-7。蛋白提?。罕?4提取蛋白過(guò)程步驟實(shí)驗(yàn)過(guò)程1細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將6孔板中的廢液棄置，每孔用1mlPBS清洗2加入0.5ml胰酶于6孔板中15-30秒，待貼壁細(xì)胞與板脫落，棄置胰酶，每孔加入1mlPBS，反復(fù)吹打，直至貼壁細(xì)胞全部吹打下來(lái)3將吹打下來(lái)的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中，再置于離心機(jī)5000r離心10分鐘，棄置上清液，留下沉淀物。4在另一ep管中配置1200微升細(xì)胞裂解液與12微升的蛋白酶抑制劑的混合溶劑，在每個(gè)帶有沉淀物的ep管中加入90微升的混合溶劑，將混合溶液震蕩15秒5將震蕩后的混合溶液在冰上放置30分鐘6冰上放置30分鐘后于4攝氏度12000r離心15分鐘7離心后，取80微升上清液，加入20微升的SDS

sample

buffer8100攝氏度水浴15分鐘后于-20攝氏度冷藏蛋白免疫印記法檢測(cè)HDAC11的表達(dá)：表15蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)過(guò)程步驟實(shí)驗(yàn)過(guò)程1SDS電泳：根據(jù)表14配制分離膠，將分離膠置于預(yù)制裝置中，30-40min后，待分離膠凝固，再將據(jù)表14配制好的濃縮膠加至于凝固后的濃縮膠，立即插上15mm的梳子，一般在20-30min后可將梳子拔去。后將提取的蛋白上樣，并加上marker，隨后進(jìn)行電泳，電泳時(shí)先低壓80V跑30-40min，隨后120V跑1h30min左右，直至5×loadingbuffer跑出來(lái)2轉(zhuǎn)膜需提前做好準(zhǔn)備：根據(jù)膠體大小將PVDF膜裁剪，先將PVDF膜在甲醇（100%純度）中浸泡10min，并將6張厚度的濾紙（長(zhǎng)寬與PVDF膜相同）和PVDF膜浸入到預(yù)冷的transferbuffer5min3面包夾的制備：先切除濃縮膠，再將分離凝膠放在3層濾紙上，面包夾黑色的一面朝下，PVDF膜置于分離膠的上方，在PVDF膜的右上角做好標(biāo)記，光面朝向分離膠，用鏟膠板趕走存在于PVDF膜與分離膠之間氣泡，最后在PVDF膜上放另3張濾紙，并放入轉(zhuǎn)膜電泳槽中4轉(zhuǎn)膜：連接正負(fù)極，紅色對(duì)準(zhǔn)紅色，黑色對(duì)準(zhǔn)黑色，在4℃的條件下在400mA的條件下轉(zhuǎn)膜100min左右5封閉：用鑷子把轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜取出來(lái)，放到5%脫脂奶粉（1×TBST溶解）中，并放到搖床上常溫封閉30min6孵育一抗：根據(jù)蛋白marker對(duì)PVDF膜進(jìn)行裁剪，并按照抗體的說(shuō)明書(shū)用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⑾♂尩目贵w放入到15mLEP管中，將裁剪的PVDF放入對(duì)應(yīng)的抗體管中，放入4℃搖床，孵育11h。一抗重復(fù)回收利用7洗PVDF膜：將PVDF膜放入10cm的皿上，在20mL1×TBST室溫清洗3次，每次12min8二抗雜交：根據(jù)一抗的來(lái)源，選擇不同的二抗，將膜放入配制好的二抗稀釋液（5%的脫脂奶粉）中雜交，一般孵育時(shí)間在2-4h，常溫雜交即可9洗PVDF膜：將PVDF膜放入10cm的皿上，在20mL1×TBST室溫清洗3次，每次12min10曝光：先把配制好的ECL發(fā)光液置于曝光黑盒中，將洗好的PVDF膜有順序地放入其中，利用儀器進(jìn)行曝光，選取不同的曝光時(shí)間來(lái)保存圖片.表16SDS凝膠的具體配制方法貯存液12%分離膠（mL）5%濃縮膠（mL）ddH2O6.65.430%（w/v）丙烯酰胺8.01.31分離膠溶液5—濃縮膠溶液—1無(wú)水10%SDS0.20.0810%AP0.020.085%TEMED0.0080.008Totalvolume208

3結(jié)果與分析3.1人的HDAC11的同源性分析通過(guò)NCBI將人（Homosapeins）中的HDAC11與昆蟲(chóng)的黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）進(jìn)行同源性序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)人的HDAC11與黑腹果蠅只有52%的保守性，說(shuō)明HDAC11在進(jìn)化上相對(duì)保守，結(jié)果如圖所示（圖1）。圖1同源序列比對(duì)分析結(jié)果3.2HDAC11的3D結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)HDAC11，作為組蛋白去乙?；?，主要負(fù)責(zé)核心組蛋白(H2A,H2B,H3和H4)的N端賴(lài)氨酸殘基的去乙?；?。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期進(jìn)程和發(fā)育事件中起著重要作用。組蛋白去乙?；竿ㄟ^(guò)形成大的多蛋白復(fù)合物起作用。以下是預(yù)測(cè)到HDAC11的3D結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)富含α螺旋和β螺旋的結(jié)構(gòu)域，編碼一個(gè)組蛋白去乙?；竻^(qū)域，參與表觀(guān)遺傳修飾調(diào)控。圖2HDAC11的3D結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)3.3HDAC11互作蛋白預(yù)測(cè)為了探究HDAC11的互相作用蛋白，利用在線(xiàn)網(wǎng)站String數(shù)據(jù)（/）對(duì)質(zhì)之間相互作用的。通過(guò)在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；窰DAC11能夠與HDAC6（Histonedeacetylase6;），KAT2B（HistoneacetyltransferaseKAT2B），SIRT5（NAD-dependentproteindeacylasesirtuin-5），SIRT7（NAD-dependentproteindeacylasesirtuin-7）等蛋白相互作用，推測(cè)其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制和染色體穩(wěn)定性中發(fā)揮核心作用，并且可通過(guò)翻譯后修飾和核小體重塑來(lái)調(diào)調(diào)控其他蛋白表達(dá)。圖3HDAC11的互作蛋白預(yù)測(cè)3.4人的HDAC11基因在腫瘤的表達(dá)譜預(yù)測(cè)利用在線(xiàn)網(wǎng)站GEPIA2（/#general）對(duì)人的HDAC11在不同腫瘤的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，HDAC11相對(duì)于正常的組織，其在乳腺癌中表達(dá)量較高，暗示其可能在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)著一定的生物學(xué)功能。圖4HDAC11在不同腫瘤中的表達(dá)譜預(yù)測(cè)3.5人的HDAC11基因在乳腺癌中的表達(dá)譜預(yù)測(cè)隨后通過(guò)生物信息學(xué)在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)人的HDAC11基因在乳腺癌中的表達(dá)譜情況，紅色選取了1085個(gè)乳腺癌組織，黑色為選取了291個(gè)正常的乳腺組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDAC11在乳腺癌中異常表達(dá)，推測(cè)其在乳腺癌中發(fā)揮著作用。圖5HDAC11在乳腺癌與正常乳腺細(xì)胞中的表達(dá)譜預(yù)測(cè)3.6人的HDAC11的序列分析人的組蛋白去乙酰化酶HDAC11在NCBI上的GenBank為BC009676.1，以下是HDAC11編碼蛋白質(zhì)的基因序列，其中標(biāo)記的為限制性?xún)?nèi)切酶切位點(diǎn)EcoRI和XbaI，通過(guò)雙酶切將其重組到載體pcDNA3.1載體上。堿基序列：GCTCTAGAATGCTACACACAACCCAGCTGTACCAGCATGTGCCAGAGACACGCTGGCCAATCGTGTACTCGCCGCGCTACAACATCACCTTCATGGGCCTGGAGAAGCTGCATCCCTTTGATGCCGGAAAATGGGGCAAAGTGATCAATTTCCTAAAAGAAGAGAAGCTTCTGTCTGACAGCATGCTGGTGGAGGCGCGGGAGGCCTCGGAGGAGGACCTGCTGGTGGTGCACACGAGGCGCTATCTTAATGAGCTCAAGTGGTCCTTTGCTGTTGCTACCATCACAGAAATCCCCCCCGTTATCTTCCTCCCCAACTTCCTTGTGCAGAGGAAGGTGCTGAGGCCCCTTCGGACCCAGACAGGAGGAACCATAATGGCGGGGAAGCTGGCTGTGGAGCGAGGCTGGGCCATCAACGTGGGGGGTGGCTTCCACCACTGCTCCAGCGACCGTGGCGGGGGCTTCTGTGCCTATGCGGACATCACGCTCGCCATCAAGTTTCTGTTTGAGCGTGTGGAGGGCATCTCCAGGGCTACCATCATTGATCTTGATGCCCATCAGGGCAATGGGCATGAGCGAGACTTCATGGACGACAAGCGTGTGTACATCATGGATGTCTACAACCGCCACATCTACCCAGGGGACCGCTTTGCCAAGCAGGCCATCAGGCGGAAGGTGGAGCTGGAGTGGGGCACAGAGGATGATGAGTACCTGGATAAGGTGGAGAGGAACATCAAGAAATCCCTCCAGGAGCACCTGCCCGACGTGGTGGTATACAATGCAGGCACCGACATCCTCGAGGGGGACCGCCTTGGGGGGCTGTCCATCAGCCCAGCGGGCATCGTGAAGCGGGATGAGCTGGTGTTCCGGATGGTCCGTGGCCGCCGGGTGCCCATCCTTATGGTGACCTCAGGCGGGTACCAGAAGCGCACAGCCCGCATCATTGCTGACTCCATACTTAATCTGTTTGGCCTGGGGCTCATTGGGCCTGAGTCACCCAGCGTCTCCGCACAGAACTCAGACACACCGCTGCTTCCCCCTGCAGTGCCCTGAGAATTCCGCDS序列：MLHTTQLYQHVPETRWPIVYSPRYNITFMGLEKLHPFDAGKWGKVINFLKEEKLLSDSMLVEAREASEEDLLVVHTRRYLNELKWSFAVATITEIPPVIFLPNFLVQRKVLRPLRTQTGGTIMAGKLAVERGWAINVGGGFHHCSSDRGGGFCAYADITLAIKFLFERVEGISRATIIDLDAHQGNGHERDFMDDKRVYIMDVYNRHIYPGDRFAKQAIRRKVELEWGTEDDEYLDKVERNIKKSLQEHLPDVVVYNAGTDILEGDRLGGLSISPAGIVKRDELVFRMVRGRRVPILMVTSGGYQKRTARIIADSILNLFGLGLIGPESPSVSAQNSDTPLLPPAVP根據(jù)以上CDS對(duì)應(yīng)的堿基序列利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)出的實(shí)驗(yàn)所需的引物是：HDAC11-F:GCTCTAGAATGCTACACACAACCCAHDAC11-R:CGGAATTCTCAGGGCACTGCAGGGGGAAHDAC11-HR：CGGAATTCTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGGGCACTGCAGGGGGAA（C端帶有HA標(biāo)簽）3.7HDAC11載體的構(gòu)建提取乳腺癌細(xì)胞MCF-7的總RNA，通過(guò)瓊脂糖電泳顯示三條清晰的28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA泳帶（圖6），說(shuō)明所抽提的總RNA樣品符合質(zhì)量要求，并且經(jīng)過(guò)紫外分光光度儀檢測(cè)，各樣總RNA的OD260/OD280值在1.8-2.0之前。圖6RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得約1060bp大小、含HA標(biāo)簽的HDAC1基因片段，與預(yù)期相符，再將其連接至pcDNA3.1質(zhì)粒上，成功構(gòu)建pcDNA3.1-HDAC1-HA過(guò)表達(dá)載體（圖7）。圖7HDAC11的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖3.8HDAC11的測(cè)序結(jié)果將提取的pcDNA3.1-HDAC11-HA送往公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖（圖8）。說(shuō)明重組重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖8HDAC11的測(cè)序結(jié)果圖3.9HDAC11的過(guò)表達(dá)結(jié)果將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞48h后，收集MCF-7細(xì)胞通過(guò)裂解后提取細(xì)胞中的蛋白樣，WesternBlot結(jié)果見(jiàn)圖（圖9），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒成功在乳腺癌細(xì)胞MCF-7表達(dá)，其中空載體作為對(duì)照。圖9WB檢測(cè)HDAC11在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)結(jié)果

4討論現(xiàn)如今諸如外科手術(shù)治療、放療、新輔助化療、靶向治療、內(nèi)分泌治療等，是治療乳腺癌常見(jiàn)的治療手段[14]。但乳腺癌的發(fā)病率及死亡率均逐年上升，所以需尋找更多的治療方法。目前已發(fā)現(xiàn)有多種HDAC抑制劑（HDACls）對(duì)乳腺癌的增殖和遷移有抑制作用，HDACls主要包括環(huán)四肽類(lèi)、羥肟酸類(lèi)、苯酰胺類(lèi)以及短鏈脂肪酸。在這四類(lèi)HDACls之中，是廣譜抑制劑的有環(huán)四肽類(lèi)、羥肟酸類(lèi)、和短鏈脂肪酸，可以將I、II家族所有的HDACs亞型抑制。能夠選擇性抑制I型HDACs中HDACI、HDACII、HDACIII以及部分II型HDACs為選擇性抑制劑，本酰胺類(lèi)是其代表之一[15]。在研究組蛋白去乙酰化酶HDAC11的研究中，