香菇多糖的研究進(jìn)展

糖的研究已有100多年的歷史。近20年來，隨著膜化學(xué)功能、免疫物質(zhì)化學(xué)研究的進(jìn)展，以及新藥物資源的不斷開發(fā)和研究，結(jié)果表明，糖對(duì)生物體的作用不僅是能量資源和結(jié)構(gòu)材料，而且還包括各種生命現(xiàn)象中的細(xì)胞活動(dòng)，包括各種生物學(xué)功能。多糖一般由十個(gè)分子以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物。多糖按來源大致可分為植物多糖、動(dòng)物多糖、海藻多糖、微生物多糖即細(xì)菌多糖和真菌多糖等。其中,具有很強(qiáng)生物活性的真菌多糖的研究日益受到重視,真菌多*通訊作者,范雷法,E-mail:fanleifa@,Tel:86-571-86404319。糖從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離,是一類可以控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老的活性多糖。真菌多糖作為藥物研究始于20世紀(jì)50年代,在60年代以后成為免疫促進(jìn)劑受到廣泛關(guān)注,其中香菇多糖(lentinan,LNT)是研究得較透徹的多糖之一。香菇[Lentinusedodes(Berk.)Sing]為擔(dān)子菌綱傘形科真菌,是世界名貴食用菌兼藥用菌之一。1968年日本千原吳郎首先利用熱水從香菇子實(shí)體中浸提出6種胞外多糖,1970年Chihard和Sasaki用熱水浸提結(jié)合有機(jī)溶劑沉淀從香菇中提取到另外4種多糖,20世紀(jì)80年代以來,LNT的研究受到廣泛的重視,取得了一系列進(jìn)展。1山羊糖的結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)1.1x-射線衍射分析有關(guān)香菇多糖的成分和結(jié)構(gòu)報(bào)道甚多,但已明確結(jié)構(gòu)與免疫活性關(guān)系的只有β-葡聚糖物質(zhì)。該多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有β-(1→3)連接的吡喃葡聚糖主鏈,在主鏈中葡萄糖的C6位上含有支點(diǎn)(每5個(gè)葡萄糖有2個(gè)支點(diǎn)),其側(cè)鏈?zhǔn)怯搔?(1→6)鍵和β-(1→3)鍵相連的葡萄糖聚合體組成,在側(cè)鏈上也含有少數(shù)內(nèi)部β-(1→6)鍵(圖1)。X-射線衍射分析證明,其立體結(jié)構(gòu)為右旋三重螺旋的六方晶系,晶格常數(shù)a=b=1.5nm,c=0.6nm。采用高分辨13C-核磁共振(13CNMR)研究表明,其二級(jí)結(jié)構(gòu)為凝結(jié)型的單螺旋構(gòu)象。Surenjav等從4種香菇中分離出的4種高分子抗腫瘤活性多糖,經(jīng)檢測(cè)都是(1→3)-β-D-葡聚糖,并含有4.6%~15.2%的蛋白質(zhì)。但4種多糖分別被破壞了三螺旋(1→3)-β-D-構(gòu)型、被超聲波打成碎片、被除去結(jié)合蛋白質(zhì)后,檢測(cè)它們的抗腫瘤活性,發(fā)現(xiàn)比天然物質(zhì)有所降低。這就表明,多糖的構(gòu)型、相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)合蛋白質(zhì)也可能影響其抗腫瘤活性。1.2水溶液的濕性和有機(jī)溶劑濃度香菇多糖為白色或棕黃色粉末,對(duì)光和熱穩(wěn)定,具吸濕性,相對(duì)分子質(zhì)量較大,無甜味和還原性,部分能溶于水,在水中的溶解度隨分子質(zhì)量增大而降低,水溶液為中性,不溶于甲醇、已醇、丙酮等有機(jī)溶劑。2蘑菇糖的生物活性2.1ctl的產(chǎn)生香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)活性是其生物活性的重要基礎(chǔ)。香菇多糖是典型的T細(xì)胞激活劑,體內(nèi)外均能促進(jìn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生,提高CTL的殺傷活力,增強(qiáng)正?；蛎庖吖δ艿拖滦∈蟮倪t發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH),提高抗體依賴性細(xì)胞毒細(xì)胞(ADDC)活性。Oka等通過體外香菇多糖與宿主細(xì)胞共培養(yǎng),流式細(xì)胞儀免疫熒光檢測(cè),研究香菇多糖免疫調(diào)節(jié)活性的觸發(fā)機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)香菇多糖能結(jié)合到人單核細(xì)胞上,認(rèn)為香菇多糖結(jié)合到人單核細(xì)胞上可能是其影響免疫系統(tǒng)的首要因素。2.2香菇多糖的藥代動(dòng)力學(xué)香菇多糖能有效預(yù)防化學(xué)性或病毒性腫瘤的發(fā)生,對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑制率高達(dá)70%~100%,其中90%小鼠的腫瘤完全消退;還能抑制化學(xué)致癌劑3-甲蔥酮的致癌作用,防止小鼠腸潰瘍惡化導(dǎo)致的結(jié)腸癌的發(fā)生。作為免疫輔助藥物,香菇多糖與化療劑聯(lián)合使用有減毒增效的作用,主要被用來抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移,通過免疫調(diào)節(jié)作用或影響一些關(guān)鍵酶的活性來提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性,改善患者的身體狀況,延長(zhǎng)其壽命。香菇多糖在治療胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等方面具有良好的療效,能夠延長(zhǎng)腫瘤患者的存活時(shí)間,特別是胃癌和結(jié)腸直腸癌。目前香菇多糖抗腫瘤活性的機(jī)理還沒有完全搞清楚,但香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)功能是抗腫瘤活性的基礎(chǔ)這一點(diǎn)得到了一致的認(rèn)可。2.3香菇多糖的作用機(jī)理據(jù)資料報(bào)道,香菇多糖可用于治療結(jié)核桿菌感染,能使耐藥性結(jié)核病人痰菌轉(zhuǎn)陰,病人外周血嗜中性粒細(xì)胞吞噬活性增加。香菇多糖還能延長(zhǎng)李司忒氏菌感染小鼠的生存時(shí)間,這與其提高巨噬細(xì)胞功能有關(guān),其抗感染的機(jī)制與多糖本身的特性有關(guān)。香菇多糖的作用機(jī)理可能是多糖分子表面與病原體表面發(fā)生粘附作用,阻截了病原體與正常細(xì)胞表面糖分子的結(jié)合,從而阻斷其感染途徑。硫酸化香菇多糖具有顯著抗HIV作用,體外10mg/L就能完全抑制HIV抗原的表達(dá),其作用機(jī)理可能是干擾HIV對(duì)宿主細(xì)胞的粘附作用,抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。2.4血清轉(zhuǎn)氨酶活性香菇多糖可以增強(qiáng)機(jī)體的排毒能力,降低由CCl4升高的血清轉(zhuǎn)氨酶活性,刺激被切除部分肝的老鼠的殘留肝再生,增強(qiáng)對(duì)洋地黃毒素的抵抗能力。香菇多糖藥用功效多樣,除上述外,還可以降血脂、抗衰老、抗病毒等。3對(duì)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)研究顯示,香菇多糖雖無直接的細(xì)胞毒副作用,但可激活多種活性免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞,使動(dòng)物腫瘤縮小及提高宿體免疫功能。國內(nèi)外已開發(fā)了多種香菇多糖制劑,如能治難、天地欣等。3.1降酶作用及藥物降酶作用香菇多糖配合其他藥物治療慢性乙型肝炎,可提高乙肝病毒標(biāo)志物的轉(zhuǎn)陰作用,減少抗病毒藥物的副作用,降酶作用快而且穩(wěn)定。在臨床應(yīng)用中證明,香菇多糖加干擾素用于控制慢性乙型肝炎,可達(dá)到滿意的療效。3.2手術(shù)后重建t細(xì)胞亞群在圍手術(shù)期將香菇多糖溶解于5%葡萄糖液中靜脈滴注,每次2mg,每周2次,連續(xù)用藥12~16mg為1療程,結(jié)果有助于提高中晚期腫瘤患者術(shù)后NK,LAK細(xì)胞活性,促進(jìn)LTR的恢復(fù),也可恢復(fù)手術(shù)創(chuàng)傷引起的T細(xì)胞亞群分布異常,從而有利于改善患者的細(xì)胞免疫功能,促進(jìn)患者手術(shù)后的恢復(fù),延長(zhǎng)癌癥患者的生存時(shí)間并提高其生存質(zhì)量。肺癌患者在化療過程中加用香菇多糖,可明顯改善腫瘤患者的免疫狀態(tài)、生活質(zhì)量以及生存率,尤其對(duì)小細(xì)胞肺癌患者的治療效果更為顯著。在化療前3d,將2mg香菇多糖溶解于5%葡萄糖溶液250mL中,靜脈滴注,每周2次,連續(xù)8周,則可以增強(qiáng)化療的療效,同時(shí)使患者的白細(xì)胞下降概率、胃腸毒性、肝功能損害及嘔吐發(fā)生等明顯降低,表明香菇多糖與化療并用,可以增效、減毒、增強(qiáng)患者機(jī)體的免疫功能等。3.3反復(fù)呼吸道感染患兒臨床療效分析符耀華研究表明,糖尿病并發(fā)感染的患者在口服降糖藥或注射胰島素抑制血糖的同時(shí),應(yīng)用香菇多糖可改善機(jī)體全身狀況,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,從而使感染得到有效控制,加快疾病的康復(fù)。應(yīng)用香菇多糖沖劑治療反復(fù)呼吸道感染患兒60例,臨床觀察總有效率達(dá)96.7%,表明香菇多糖對(duì)反復(fù)呼吸道感染患兒有廣泛的免疫刺激作用。另據(jù)資料報(bào)道,香菇多糖注射液與抗生素合用,能有效防治反復(fù)呼吸道感染的發(fā)生。3.4治療非定常性疾病采用口服香菇多糖加二氧化碳激光治療尖銳濕疣,比單獨(dú)用二氧化碳激光治療的疾病復(fù)發(fā)率明顯降低?？诜愎蕉嗵墙Y(jié)合皮膚處外用皮質(zhì)類固醇制劑治療銀屑病,有效率達(dá)92.11%。4發(fā)展大規(guī)模生產(chǎn)香菇多糖多從子實(shí)體中提取,也有研究者用香菇下腳料提取多糖,潘繼紅等以香菇柄為原料,用蒸餾水、0.5%草酸銨溶液兩種提取劑提取香菇柄粗多糖,其提取率分別為0.103%,0.164%,表明香菇柄有一定的開發(fā)價(jià)值。香菇子實(shí)體生產(chǎn)周期長(zhǎng),產(chǎn)量及多糖提取率均較低。采用深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)香菇菌絲體,不僅發(fā)酵液中含有與子實(shí)體相同且含量更高的營養(yǎng)成分,且可利用農(nóng)副產(chǎn)品作原料,成本低,周期短,易于大規(guī)模生產(chǎn),已得到廣泛重視及應(yīng)用。邵偉等采用液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法獲得香菇發(fā)酵液(LEL),發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌絲體,并從菌絲體中提取胞內(nèi)粗多糖(LEPI)。劉美琴等將從香菇菌絲體中提取的粗多糖,經(jīng)DE52柱層析,得到均一的多糖成分,命名為L(zhǎng)E。為了提高發(fā)酵過程中香菇多糖的產(chǎn)量,滕利榮等通過正交設(shè)計(jì)法對(duì)香菇發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源最佳配比進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)香菇多糖的產(chǎn)量在發(fā)酵130h時(shí)最大,其濃度可達(dá)25.1mg/mL,經(jīng)分離純化得到兩種組分的香菇多糖。鄭典元等采用正交設(shè)計(jì)法研究了香菇菌絲液體發(fā)酵碳源對(duì)香菇多糖產(chǎn)量的影響,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),發(fā)酵生產(chǎn)香菇多糖的最佳碳源為6%葡萄糖,4%淀粉,2%蔗糖,添加淀粉作碳源有利于香菇菌絲生長(zhǎng)發(fā)育和多糖的積累。孫永林等在培養(yǎng)基中加入木質(zhì)纖維素后,香菇胞外多糖含量最多可提升0.99g/L。從子實(shí)體和發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體中分離的多糖分子結(jié)構(gòu)有一定的差異。目前對(duì)香菇多糖研究較多的是一種商品名為L(zhǎng)entinan的β-(1→3)-D-葡聚糖。Shida等用3%三氯乙酸和1mol/LNaOH溶液,從香菇子實(shí)體中分別提取出一種雜半乳糖和α-(1→3)-D-葡聚糖。Tomati等將從發(fā)酵香菇菌絲體中得到的香菇多糖進(jìn)行一維及二維NMR分析,確定兩種多糖分別為木聚糖及葡聚糖。5多糖的分離多糖的分離提純涉及兩個(gè)方面:(1)將多糖與低分子有機(jī)物、無機(jī)鹽等成分分離,或者與蛋白質(zhì)、酯類等高分子量的自然產(chǎn)物分離;(2)單一多糖的分離提純。5.1超聲波提取法香菇多糖一般采用不同溫度的水或稀堿溶液提取。在其浸提參數(shù)中,溫度是影響多糖提取的主要因素,另外浸提固液比、浸提時(shí)間等也均影響提取率。此外,還有其他的一些提取方法。曾智平等發(fā)現(xiàn)微波法的提取率高于傳統(tǒng)熱水法,并且縮短提取時(shí)間和減少能耗。念保義等研究了超聲波提取香菇多糖,發(fā)現(xiàn)將香菇粉末用功率為80W的熱水超聲提取13min,可以防止多糖降解和多糖活性的降低,并且能縮短提取時(shí)間,減小料液比,提高提取效率,降低生產(chǎn)成本。張欣等采取復(fù)合酶解法結(jié)合熱水浸提法提取香菇柄多糖,提取率達(dá)71.3%,是熱水浸提法的3.43倍,酶解的最適條件為pH4.5、溫度46℃、提取時(shí)間80min。Yap和Ng將水提醇沉后的香菇粗多糖在液氮中凍干,凍干物用熱水溶解,離心除去不溶物,上清液用等體積的95%乙醇在4℃下沉淀過夜,離心,將沉淀物凍干后得β-D-葡聚糖,其純度經(jīng)糖柱分析后可達(dá)到87.5%,與傳統(tǒng)的方法相比這種方法更加省時(shí)、高效、成本低。5.2發(fā)揮作用多糖分離常用的純化方法有:沉淀法、柱層析法、制備性高效液相法、制備性區(qū)域電泳法、超濾法等。目前多采用各種不同的凝膠層析柱色譜和離子交換柱色譜。凝膠色譜是一種分辨率低、載樣量少的分離技術(shù),但方法簡(jiǎn)單、快速。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose),以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑,使不同大小的多糖分子得到分離純化。離子交換色譜是通過載體表面帶電基團(tuán)與樣品離子和淋洗離子進(jìn)行可逆交換、離子偶極作用和離子吸附,來實(shí)現(xiàn)色譜分離。不同多糖尤其是多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的復(fù)合多糖,在一定pH條件下所帶電荷不同,根據(jù)各多糖上電荷的差異來達(dá)到分離目的。燕航等將香菇多糖粗制品用DEAE-纖維素柱層析,經(jīng)NaCl洗脫,得到6個(gè)香菇多糖級(jí)分A~F;然后用SephadexG-200柱進(jìn)一步純化香菇多糖B級(jí)分,得到香菇多糖亞級(jí)分B-1和B-2。邵偉等采用液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法獲得香菇胞內(nèi)粗多糖,再經(jīng)DEAE柱層析和Supdex200凝膠層析到一種蛋白多糖復(fù)合物。劉美琴等將香菇粗多糖進(jìn)行DE52柱層析,得到均一的多糖成分,其平均分子量為5.08×105。阮征等用香菇水提物,經(jīng)過DEAE-SephadexA-25和SephadexG-200凝膠柱色譜得到均一多糖級(jí)分L-2A。超濾技術(shù)是一種膜過濾技術(shù),其原理主要是篩分作用,其中分子大小是其分離的主要依據(jù),但分子形狀和電荷也起著重要作用。利用膜的選擇性,通過在膜兩側(cè)存在的能量差而造成溶液中各組分通過膜的遷移速率的不同,實(shí)現(xiàn)非均相物系的分離。利用超濾分離技術(shù),易獲得多糖粗品,得糖率高,工藝流程簡(jiǎn)單,工序少,提取時(shí)間短。李志洲利用超濾膜分離裝置進(jìn)行香菇多糖的提取分離,建立了香菇多糖提取液超濾過程修正凝膠極化模型,這種工藝的香菇多糖提取率達(dá)6.10%,多糖粗品含量在90%以上。鄭宗昆等采用螺旋卷式超濾器對(duì)香菇多糖進(jìn)行提取研究,結(jié)果在此試驗(yàn)范圍內(nèi),用微濾作預(yù)處理的好于離心法處理,用超濾溫度為25℃,pH值接近浸提介質(zhì)的pH值,超濾壓力為0.15~0.18MPa,制得的香菇多糖純度達(dá)74.4%,回收率為79.6%。謝紅旗等采用截留分子量為50kD和300kD的兩種陶瓷膜,將預(yù)處理過的香菇料液分成三種不同分子量范圍的多糖。6基于lentican的多糖最佳提取工藝隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和香菇多糖研究的不斷深入,科學(xué)家們已經(jīng)開始在基因水平探討香菇多糖生物活性的機(jī)制。多糖生物活性與結(jié)構(gòu)間的關(guān)系的研究還落后于核酸與蛋白質(zhì)的研究。目前主要集中在香菇中β-(1→3)-D-葡聚糖的研究上,其他多糖組分與生物活性之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的明確。目前多糖的提取率普遍不高,提高香菇多糖的提取率已成為多糖產(chǎn)品開發(fā)需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。不僅可以考慮將多種提取手段結(jié)合起來優(yōu)化提取工藝,還可以通過遺傳育種、基因重組、物種誘變等手段選育出高產(chǎn)多糖的香菇菌株,提高香菇的多糖含量,以增加多糖的提取率,降低