植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基本步驟

一、母液的配置

1、MS大量元素母液的配制

將大量元素配制成10倍的母液，使用時(shí)再稀釋10倍。按照配方表中用量依次分別稱取擴(kuò)大10倍的：NH4NO38.250g、KNO39.500g、KH2PO40.850g、MgSO4·7H2O1.850g、CaCl2·2H2O2.20g，所有藥品稱取完畢后用蒸餾水逐個(gè)溶解，待全部溶解后，最后定容至500ml，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2、MS微量元素母液的配制

將微量元素配制成100倍的母液，使用時(shí)再稀釋100倍。按照配方表中用量分別依次稱?。篗nSO4·4H2O1.1150g、ZnSO4·7H2O0.4300g、H3BO30.3100g、KI0.0415g、CuSO4·5H2O0.00125g、CoCl2·6H2O0.00125g，用蒸餾水逐個(gè)溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至500ml，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3、MS鐵鹽母液配制

將鐵鹽配制成100倍的母液，使用時(shí)再稀釋100倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大100倍的：稱FeSO4·7H2O1.390g和Na2·EDTA1.865g，把FeSO4·7H2O和Na2·EDTA·2H2O分別置于200ml蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之溶解（磁力攪拌器，邊加熱，邊攪拌）。保持加熱，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2·EDTA溶液中并不斷攪拌，接近沸騰時(shí)停止加熱，待溶液冷卻后加蒸餾水到最終容積500ml，置于棕色細(xì)口瓶中，用力振蕩1～2min，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名。在室溫下避光保存一段時(shí)間令其充分反應(yīng)后，再置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4、MS有機(jī)化合物母液的配制

將有機(jī)化合物配制成100倍的母液，使用時(shí)再稀釋100倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大100倍的：肌醇5.000g、維生素B10.025g、煙酸0.025g、甘氨酸0.100g、維生素B60.005g、蔗糖15.000g，用蒸餾水依次溶解并定容至500ml后，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

二、植物激素的配置

常見激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）、激動(dòng)素（6-糠氨基嘌呤、KT）、6－芐氨基嘌呤（6－BA）、赤霉素（GA3）、

1、生長素類：

（1）、生長素類在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)細(xì)胞的驗(yàn)儀器一起滅菌。

1、檢查滅菌鍋外層鍋內(nèi)水位，水量過少時(shí)應(yīng)加水。把分裝好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋的消毒桶內(nèi)。

2、蓋上鍋蓋，注意按照說明操作并確定已蓋好，設(shè)置好溫度和時(shí)間參數(shù)，開啟電源加熱滅菌。

3、滅菌時(shí)間到后，先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，待滅菌鍋壓力表指針降到0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，開啟鍋蓋，取出已滅菌的培養(yǎng)基。4、在培養(yǎng)基凝固之前加入一定量的植物激素后密封瓶口，放置在水平桌面上自然冷卻。

四、無菌操作技術(shù)和接種1、接種前，用75%酒精棉球擦拭超凈工作臺臺面，將培養(yǎng)基及接種用具放入超凈工作臺臺面，打開超凈工作臺紫外燈及接種房間紫外燈，照射約30min，然后關(guān)閉紫外燈。打開房間換氣扇及微開超凈工作臺的玻璃擋板，通風(fēng)20min后，即可進(jìn)行無菌操作。（此步由專人統(tǒng)一負(fù)責(zé)）

2、接種室滅菌過程中同時(shí)對外植體進(jìn)行表面滅菌。先將接種材料在流動(dòng)的自來水下涮洗干凈，吸干水份后切成大約70mm長的片段放進(jìn)500ml燒杯中，用蒸餾水沖洗2次，倒掉蒸餾水后倒入0.1%的升汞水消毒，將材料淹沒浸泡約10分鐘（期間用鑷子攪拌幾次）。

3、把在消毒液中的接種材料轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上。用無菌鑷子將已完成滅菌的接種材料轉(zhuǎn)移到燒杯中，用無菌水清洗3次，每次不少于1分鐘，洗時(shí)不斷搖動(dòng)燒杯以確保完全除去消毒液。最后一次清洗后轉(zhuǎn)移到無菌托碟上，將接種材料切成一定大?。ɑㄍ?.5cm2、莖段0.5-1cm）。

4、取下培養(yǎng)瓶的蓋子用火燒灼瓶口。用鑷子將外植體輕輕插入到瓊脂上，立即蓋上蓋子。

5、操作完后將鑷子等器械浸入75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是將浸于酒精中的器械取出后置于酒精燈火焰上充分灼燒，待冷卻后方可使用。

6、將培養(yǎng)瓶放到培養(yǎng)箱里，在要求溫度下培養(yǎng)，觀察記錄五、所需實(shí)驗(yàn)儀器及額外藥品電子分析天平、PH測試儀器、電磁爐、高壓蒸汽滅菌鍋、藥匙、玻璃棒、膠頭滴管、移液槍、燒杯、培養(yǎng)瓶、棕色瓶、吸水紙、標(biāo)簽、記號筆、剪刀、鑷子、三角瓶、培養(yǎng)皿、藍(lán)蓋瓶、