維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM－3凋亡作用的影響【摘要】目的：為了研究維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM-3細(xì)胞凋亡效應(yīng)的影響。方法：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)硼替佐米15nmol/L+10、20、40、80μmol/L維生素C處理KM-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，用流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin-V/PI、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基(ROS)，用分光光度法檢測(cè)Caspase3活性。結(jié)果：硼替佐米對(duì)KM-3細(xì)胞增殖抑制作用降低，24hAnnexin-V陽(yáng)性細(xì)胞比例下降，△ψm降低被阻止，18h活性氧水平下降，16hCaspase-3活性下降。結(jié)論：維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)KM-3細(xì)胞凋亡效應(yīng)具有抑制作用。【關(guān)鍵詞】多發(fā)性骨髓瘤;維生素C;硼替佐米;凋亡;活性氧EffectofVitaminConBortezomib-inducedapoptoticdeathinmultiplemyelomacelllineKM-3[Abstract]Objective:ToinvestigatetheeffectofVitaminConmultiplemyelomacelllineKM-3apoptosisinducedbyBortezomib.Methods:Cellviabilityinhibitionratiowasestimatedbycountingmethod.Annexin-V，mitochondrialtransmembranepotential(Δψm)andreactiveoxygenspecies(ROS)labeledbyDCFHDAwereexaminedbyflowcytometry，andtheactivityofCaspase-3wasdetectedbyspectrophotometry.Results:TheinhibitionofBortezomibonthemultiplemyelomacelllineKM-3proliferationwasdecreased，theratioofAnnexin-Vpositivecellsatthe24thhourdeclined，thedecreaseof△ψmwasprevented，thelevelofROSatthe18thhourdropped，andtheactivityofCaspase-3atthe16thhourdeclined.Conclusion:VitaminCmayabrogatetheabilityofBortezomibtoinduceapoptosisonmultiplemyelomacelllineKM-3.[Keywords]Multiplemyeloma;VitaminC;Bortezomib;Apoptosis;Reactiveoxygen蛋白酶體抑制劑是近年來發(fā)現(xiàn)的一種靶向治療腫瘤的藥物。在真核細(xì)胞中80%以上蛋白降解是通過蛋白酶體介導(dǎo)的，蛋白酶體抑制劑通過對(duì)蛋白酶體的抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。硼替佐米是一種高選擇性，可逆的26S蛋白酶體抑制劑，是第1個(gè)進(jìn)入臨床的該類藥物。目前認(rèn)為硼替佐米的主要作用機(jī)制是抑制I-κB在蛋白酶體內(nèi)降解，使NF-κB停留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，功能受抑制，失去抗凋亡效應(yīng)和刺激細(xì)胞增生作用[1-2]。維生素C是一種多羥基化合物有清除氧自由基，抗氧化作用[3]。研究顯示維生素C能增強(qiáng)三氧化二砷對(duì)高發(fā)性骨髓瘤(MM)療效[4]。本實(shí)驗(yàn)探討抗氧化劑維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤KM-3細(xì)胞株凋亡的影響。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM-3(由上海長(zhǎng)征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈(zèng))置于含10%的胎牛血清(杭州四季青生物工程產(chǎn)品)的RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司產(chǎn)品)中，于37℃、5%CO2和95%空氣濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞以1×105細(xì)胞/ml的密度接種培養(yǎng)。1.2WST-1法檢測(cè)生長(zhǎng)抑制率WST-1(碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)在電子耦合劑存在的情況下，被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深;細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。在450nm處有吸收峰，生長(zhǎng)抑制率如下公式計(jì)算：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%1.3形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞收集至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。1.4Annexin-V分析使用FITC標(biāo)記的Annexin-V和PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，根據(jù)晶美生物工程提供的說明書進(jìn)行操作。即取(5~10)萬個(gè)細(xì)胞，經(jīng)4℃PBS漂洗2次，棄上清，加入250μlAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。取100μl移入流式細(xì)胞儀專用試管，加入5μlAnnexinV-FITC、10μl碘化丙啶染色液輕輕混勻。室溫(20~25℃)避光孵育15分鐘。加入400μlPBS輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。1.5線粒體跨膜電位(Δψm)檢測(cè)JC-1(碧云天生物生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)在線粒體膜電位較高時(shí)聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。用紅綠熒光的相對(duì)比例來衡量線粒體去極化的比例。取(10~60)萬細(xì)胞，重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5mlJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。600g4℃離心3~4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清，用冰浴的JC-1染色緩沖液洗滌2次，再用0.4mlJC-1染色緩沖液重懸后，用流式細(xì)胞儀分析。1.6Caspase3活性檢測(cè)Caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA，pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收，通過測(cè)定pNA吸光度來檢測(cè)Caspase3的活性。根據(jù)碧云天生物生物技術(shù)研究所產(chǎn)品說明操作。600g4℃離心5分鐘收集細(xì)胞，PBS洗滌1次。取200萬細(xì)胞加入100μl裂解液，冰浴裂解15分鐘。4℃16000~20000g離心10~15分鐘，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。取出10μl加入反應(yīng)體系37℃溫育出現(xiàn)變色后，于405nm測(cè)吸光度。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定pNA量。1.7活性氧檢測(cè)DCFHDA(碧云天生物生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化生成DCFH，DCFH不能通透細(xì)胞膜，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比。DCF的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，吸收波長(zhǎng)為525nm。收集一百萬細(xì)胞懸浮于1∶5000無血清培養(yǎng)液稀釋的1mlDCFH-DA中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入200μlPBS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)一萬個(gè)細(xì)胞。2結(jié)果2.1硼替佐米、硼替佐米+維生素C對(duì)KM-3細(xì)胞的抑制作用KM-3細(xì)胞經(jīng)10、25、50、75nmol/L濃度的硼替佐米處理24h后生長(zhǎng)抑制率的3次均值分別為40.83%、44.9%、51.2%和55.17%，48h分別為45.9%、58.7%、71.2%和78.1%。根據(jù)48h半數(shù)抑制濃度選擇藥物作用濃度，因此選擇硼替佐米15nmol/L作為藥物處理濃度。再將KM-3細(xì)胞經(jīng)硼替佐米15nmol/L+維生素C10、20、40、80μmol/L作用24、48h計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率3次均值分別為23.65%、11.1%、7.53%、4.3%;20.3%、9.8%、6.36%、3.40%(圖1)。選擇80μmol/L作為維生素C處理濃度。2.2維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)KM-3細(xì)胞凋亡作用的影響2.2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變收集細(xì)胞涂片，瑞氏染色后光學(xué)顯微鏡下觀察對(duì)照組和維生素C組細(xì)胞形態(tài)正常(圖2A、2B)。硼替佐米+維生素C處理組細(xì)胞形態(tài)正常，偶見凋亡細(xì)胞(圖2C)。硼替佐米處理組可見胞膜皺縮、染色質(zhì)凝集、邊緣化、胞質(zhì)起泡(圖2D)。2.2.2AnnexinV分析24hAnnexinVFITC/PI雙標(biāo)結(jié)果顯示，硼替佐米處理組凋亡細(xì)胞比例重復(fù)3次為(16.3±1.95)%(圖3A)，硼替佐米+維生素C組為(8.46±0.89)%(圖3B)，低于硼替佐米處理組(P<0.01)。對(duì)照組為(5.41±1.3)%(圖3C)。維生素C組為(4.9±1.4)%(圖3D)。2.2.3線粒體跨膜電位變化硼替佐米處理組24h后△ψM檢測(cè)顯示△ψM降低，綠色熒光細(xì)胞比率重復(fù)3次為(11.32±1.86)%(圖4A)，高于硼替佐米+維生素C處理組(5.1±0.91)%(P<0.01)(圖4B)。對(duì)照組為(4.6±0.98)%(圖4C)。維生素C組為3.6±0.84%(圖4D)。2.2.4Caspase-3活性硼替佐米處理組16h后3個(gè)平行組產(chǎn)生的pNA為25.21±0.349μmol。硼替佐米+維生素C處理組為21.79±0.198μmol，低于硼替佐米組(P<0.01)。對(duì)照組為20.67±0.156μmol，維生素C組為20.12±0.17μmol。2.2.5活性氧水平變化18h后平均熒光強(qiáng)度硼替佐米+維生素C處理組為30.2±1.96(圖5A)低于硼替佐米處理組為52.23±1.9(圖5B)(P<0.01);對(duì)照組為28.4±1.87(圖5C);維生素C組為21.3±1.6(圖5D)低于對(duì)照組(P<0.01)。3討論維生素C是具有許多生物學(xué)功能水溶性的葡萄糖類物質(zhì)。Sestili等[5]認(rèn)為高劑量維生素C有親氧化作用，低劑量有抗氧化作用。維生素C既能防止化療藥物對(duì)腫瘤及正常組織的損傷[6]，又能協(xié)同化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[7]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，低濃度的維生素C(4mmol/L)對(duì)SW620纖維瘤細(xì)胞有保護(hù)作用，而高劑量(>20mmol/L)對(duì)細(xì)胞有殺傷作用[8]。本實(shí)驗(yàn)中AnnexinV/PI分析顯示加入維生素C后，細(xì)胞早期凋亡率明顯下降。硼替佐米處理24h后細(xì)胞呈典型凋亡改變，加入維生素C后細(xì)胞形態(tài)大體正常。所以認(rèn)為維生素C在較低濃度(80μmol/L)下有抑制硼替佐米對(duì)KM-3凋亡的誘導(dǎo)作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有3種信號(hào)通路：死亡受體信號(hào)通路、線粒體信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路，目前認(rèn)為線粒體途徑在凋亡過程發(fā)揮樞紐作用[9]。氧化刺激、Ca2+過量攝取等誘導(dǎo)因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，都有線粒體跨膜電位消失。因而線粒體跨膜電位的消失標(biāo)志著一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的凋亡過程。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加入維生素C后線粒體膜電位崩潰的綠色熒光細(xì)胞比率較硼替佐米處理組顯著降低。Caspase蛋白酶家族是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，實(shí)驗(yàn)顯示KM-3細(xì)胞經(jīng)硼替佐米作用16h后pNA產(chǎn)生增加Caspase-3活性較對(duì)照升高，加入維生素C后pNA產(chǎn)生減少，酶活性下降。正常情況下NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞質(zhì)中與抑制劑I-κB相互作用形成復(fù)合體，防止NF-κB進(jìn)入核內(nèi)，NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用被阻斷;一旦I-κB磷酸化與NF-κB解離，NF-κB進(jìn)入核內(nèi)誘導(dǎo)抗凋亡蛋白的合成，細(xì)胞增生并表達(dá)黏附分子導(dǎo)致細(xì)胞增生、存活;而在MM瘤細(xì)胞中NF-κB組成性激活，導(dǎo)致瘤細(xì)胞不斷增生。如果I-κB在蛋白酶體內(nèi)降解受抑制，NF-κB停留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，功能受抑制，失去抗凋亡效應(yīng)和刺激細(xì)胞增生作用[10-11]。目前認(rèn)為這是硼替佐米的主要作用機(jī)制，但硼替佐米并不僅僅通過抑制該通路發(fā)揮作用，還存在其他作用機(jī)制?；钚匝跏羌?xì)胞凋亡的信號(hào)之一，活性氧的產(chǎn)生可直接或間接改變線粒體膜電位，促進(jìn)CytC從線粒體內(nèi)釋放，啟動(dòng)線粒體信號(hào)通路[12]。陳麗娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米可改變多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞株內(nèi)氧化還原狀態(tài)，導(dǎo)致線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生活性氧增多，從而誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。由此推測(cè)，線粒體途徑參與了硼替佐米誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)中用DCFHDA作為熒光探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)維生素C降低了硼替佐米產(chǎn)生的活性氧水平，降低了無誘導(dǎo)因素作用的對(duì)照組細(xì)胞活性氧水平。因而認(rèn)為維生素C能清除胞內(nèi)活性氧，正是該作用降低硼替佐米誘發(fā)的活性氧水平，阻止了線粒體膜電位的崩潰。本實(shí)驗(yàn)探討了維生素C在體外環(huán)境、低濃度下對(duì)硼替佐米作用影響，至于高濃度及體內(nèi)條件下的作用需進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]HideshimaT，ChauhanD，RichardsonP，etal.NF-kappaBasatherapeutictargetinmultiplemyeloma[J].JBiolChem，2021，277(19):16639-16647.[2]HideshimaT，MitsiadesC，AkiyamaM，etal.Molecular冠心病病人血清脂聯(lián)素和補(bǔ)體激活產(chǎn)物濃度的變化來源：醫(yī)學(xué)論文發(fā)表——?jiǎng)?chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng)/王元松1,王紅巧2，朱京偉3,劉成玉4作者單位：(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東青島2660711臨床技能學(xué)實(shí)驗(yàn)室;2青島市海慈醫(yī)療集團(tuán);3附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院檢驗(yàn)科;4診斷學(xué)教研室)【摘要】目的探討冠心病(CHD)病人血清脂聯(lián)素(APN)與補(bǔ)體激活產(chǎn)物濃度的變化和意義。方法采用ELISA法檢測(cè)96例CHD病人血清APN和可溶性補(bǔ)體激活產(chǎn)物(sC5b9)的變化，其中急性心肌梗死(AMI)20例，陳舊性心肌梗死(OMI)24例，不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)28例，穩(wěn)定型心絞痛(SAP)24例，并以36例健康人檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照。結(jié)果CHD病人血清APN濃度顯著低于對(duì)照組，sC5b9濃度明顯高于對(duì)照組(t′=5.624、6.448，P<0.01);不同類型CHD病人APN和sC5b9濃度差異有顯著性(F=56.258、69.724，q=5.665～11.259，P<0.01)。有并發(fā)癥的CHD病人血清APN濃度明顯低于無并發(fā)癥病人，sC5b9濃度明顯高于無并發(fā)癥病人，差異有顯著性(t′=6.934、6.455，P<0.01)。CHD病人血清APN與sC5b9濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.548，P<0.01);SAP組、UAP組和AMI組血清APN與sC5b9濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.513～-0.625，P<0.05、0.01)。結(jié)論APN和sC5b9參與了冠心病的發(fā)生與發(fā)展，且與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。【關(guān)鍵詞】冠狀動(dòng)脈疾病;脂聯(lián)素;補(bǔ)體;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定CHANGESOFADIPONECTINANDCOMPLEMENTACTIVATIONCOMPONENTINPATIENTSWITHCORONARYHEARTDISEASEWANGYUANSONG,WANGHONGQIAO,ZHUJINGWEI,etal(LabofClinicalSkills,QingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266071,China);[ABSTRACT]ObjectiveToexplorethechangesandsignificanceofserumadiponectin(APN)andcomplementactivationcomponent(sC5b9)inpatientswithcoronaryheartdisease(CHD).MethodsBymeansofenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA),theserumAPNandsC5b9in96patientswithCHDweredetected,ofwhich,20patientsweresufferingfromacutemyocardialinfarction(AMI),24fromoldenmyocardialinfarction(OMI),28withunstableangina(UAP),and24patientswithstableangina(SAP).Thefindingswerecomparedwith36healthysubjects.ResultsSerumconcentrationofAPNwassignificantlylower,andthatofsC5b9wassignificantlyhigherinpatientswithCHDthanthoseinthecontrol(t′=5.624,6.448;P<0.01).ThelevelsofserumAPNandsC5b9amongthediferenttypesofCHDweredifferent(F=56.258,69.724;q=5.665-11.259;P<0.01).SerumconcentrationofAPNwassignificantlylower,andsC5b9higherinCHDpatientswithcomplicationsthanthosewithoutcomplications(t′=6.934,6.455;P<0.01).TherewasanegativecorrelationbetweenAPNandsC5b9inpatientswithCHD(r=-0.548,P<0.01),APNcorrelatednegativelywithsC5b9inSAP,UAPandAMIgroups(r=-0.513--0.625,P<0.05,0.01).ConclusionAPNandsC5b9involveintheonsetanddevelopmentofCHD,andrelatetothestateoftheillness.[KEYWORDS]coronaryarterydisease;adiponectin;atherosclerosis;enzymelinkedimmunosorbentassay脂聯(lián)素(APN)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種膠原樣血漿激素蛋白。KUMI等[1]研究表明，APN不僅與肥胖、2型糖尿病和胰島素抵抗有關(guān)，而且還具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的作用。吳素華等[2]研究結(jié)果表明，補(bǔ)體參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，補(bǔ)體激活是心肌缺血損傷的一種急性反應(yīng)，而且不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)病人血清可溶性補(bǔ)體激活產(chǎn)物(sC5b9)明顯增高[3]。為了進(jìn)一步研究APN與補(bǔ)體激活在冠心病(CHD)發(fā)病中的作用，本文檢測(cè)了96例CHD病人血清APN和sC5b9濃度變化，并探討二者之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1資料與方法1.1對(duì)象及分組2021年8月—2021年5月，選擇經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)為CHD的病人96例，男50例，女46例;年齡51～72歲，平均(60.4±12.5)歲。據(jù)國(guó)際心臟協(xié)會(huì)WHO臨床命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)分為4組：急性心肌梗死(AMI)20例，男10例，女10例，年齡(66.7±12.8)歲;陳舊性心肌梗死(OMI)24例，男12例，女12例，年齡(63.3±9.7)歲;不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)28例，男16例，女12例，年齡(62.6±11.8)歲;穩(wěn)定型心絞痛(SAP)24例，男12例，女12例，年齡(62.5±11.8)歲。96例病人中，并發(fā)高血壓者21例，糖尿病者15例，并發(fā)高血壓、糖尿病者9例。所有病人均排除免疫性疾病和近期感染。選健康體檢者36例作為對(duì)照組，男20例，女16例，年齡53～70歲，平均(61.6±8.1)歲，均為無心、腦、肝、腎、內(nèi)分泌及血液系統(tǒng)疾病。1.2APN和sC5b9檢測(cè)方法對(duì)照組和CHD病人均于清晨采集空腹肘靜脈血5mL，室溫靜置30min，3000r/min離心分離血清，于-20℃冰箱保存。APN測(cè)定采用ELISA方法，試劑盒購(gòu)自美國(guó)TPI試劑公司，嚴(yán)格按照說明書操作。sC5b9測(cè)定采用ELISA法，試劑盒由丹麥DaKo公司提供。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用PPMS1.5[4]統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以±s表示。數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，相關(guān)關(guān)系采用直線相關(guān)分析。2結(jié)果2.1不同類型CHD病人血清APN和sC5b9濃度比較CHD病人的血清APN濃度明顯低于對(duì)照組，sC5b9濃度明顯高于對(duì)照組，差異有顯著意義(t′=5.624、6.448，P<0.01)。不同類型CHD病人血清APN和sC5b9濃度相比較差異也有顯著意義(F=56.258、69.724，q=5.665～11.259，P<0.01)。見表1。有并發(fā)癥的CHD病人血清APN濃度明顯低于無并發(fā)癥病人，sC5b9濃度明顯高于無并發(fā)癥病人，差異有顯著意義(t′=6.934、6.455，P<0.01)。見表2。2.2血清APN與sC5b9的相關(guān)性CHD病人血清APN與sC5b9濃度之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.548，P<0.01);SAP組、UAP組和AMI組病人血清APN與sC5b9濃度之間也均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.513～-0.625，P<0.05、0.01)。表1不同類型CHD病人血清APN和sC5b9濃度比較3討論本文檢測(cè)結(jié)果顯示，CHD病人血清APN濃度明顯低于對(duì)照組，sC5b9濃度明顯高于對(duì)照組，且不同類型CHD病人血清APN和sC5b9濃度比較差異有顯著意義，提示血清APN和sC5b9濃度變化與CHD的發(fā)展及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。APN作為一種炎性細(xì)胞因子引起眾多關(guān)注。已有研究結(jié)果表明，APN具有抗AS、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用，低APN血癥是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。低濃度APN還與許多心血管疾病的危險(xiǎn)因素有關(guān)，如肥胖、男性、糖尿病、血脂異常、高血壓、胰島素抵抗等。本文研究結(jié)果顯示，CHD病人血清APN濃度明顯低于對(duì)照組，且不同類型CHD病人血清APN濃度差異有顯著性，以AMI組和UPA組病人降低最明顯。提示APN濃度與CHD的穩(wěn)定性有關(guān)，低水平APN可引起粥樣斑塊的不穩(wěn)定性增加，與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。APN抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能的機(jī)制如下。①APN可以通過抑制TNFα誘導(dǎo)的NFκB抑制蛋白IκBα的磷酸化及NFκB激活，降低黏附分子的表達(dá)，抑制血小板黏附于損傷的動(dòng)脈血管壁[6]。②APN通過阻斷人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)內(nèi)TNFα介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HBEGF)mRNA的表達(dá)[7]，使HBEGF生成減少而抑制血管平滑肌細(xì)胞(SMCs)的增殖與遷移，發(fā)揮保護(hù)血管的作用。③APN抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和氧化型低密度脂蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用[89]。本文結(jié)果顯示，CHD病人血清sC5b9濃度明顯增高，且不同類型CHD血清sC5b9濃度差異有顯著性，表明sC5b9濃度增高參與了CHD的發(fā)生與發(fā)展。HOFFMEISTER等[10]的研究表明，CHD病人血清sC5b9濃度明顯增高，并與預(yù)后有關(guān)，且動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中亦有大量sC5b9沉積。CHD病人血清sC5b9濃度增高與其抑制物CD59減少、CRP水平增高有關(guān)[10]。因此，血清sC5b9濃度增高可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，以及激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，共同引起冠狀動(dòng)脈血栓的形成，參與了CHD的發(fā)生，這也可能是粥樣病灶不穩(wěn)定的因素之一。劉艷英等[11]研究表明，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55和CD59可抑制補(bǔ)體活化和sC5b9形成，防止自身組織受到補(bǔ)體活化的損傷，且APN與CD55表達(dá)呈正相關(guān)。因此，CD55和CD59表達(dá)降低可減少APN的生成。本文研究結(jié)果顯示，CHD病人血清APN與sC5b9之間呈負(fù)相關(guān)，提示APN與sC5b9共同參與了CHD的發(fā)生與發(fā)展。因此，檢測(cè)血清APN和sC5b9濃度可作為觀察CHD病人病情變化、判斷預(yù)后及隨訪病情變化的指標(biāo)之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]KUMIK,SHINICHIROM,ATSUSHII,etal.Associationbetweencardiacfunctionandmetabolicfactorsincludingadiponectininpatientswithacutemyocardialinfarction[J].JCardiol,2021,53(1):6571.[2]吳素華,馬虹,董吁鋼,等.急性冠脈綜合征與補(bǔ)體激活[J].中國(guó)病理生理雜志,2021,23(9):16921694.[3]劉成玉,劉雪麗,姜忠信.不穩(wěn)定心絞痛病人血管性血友病因子與可溶性補(bǔ)體激活產(chǎn)物的變化[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2021,42(3):189193.[4]周曉彬,紀(jì)新強(qiáng),徐莉.PPMS1.5統(tǒng)計(jì)軟件的功能及其應(yīng)用[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2021,45(1):9193.[5]KUMADAM,KIHARAS,SUMITSUJIS,etal.Associationofhypoadiponectinemiawithcoronaryarterydiseaseinmenarteriosclerosis[J].ThrombVascBiol,2021,23:8589.[6]OUCHIN,KIHARAS,ARITAY,etal.Adiponectin,anadipocytederivedplasmaprotein,inhibitsendothelialNFκBsignalingthroughacAMPdependentpathway[J].Circulation,2021,102:1296.[7]MATSUDAM,SCHIMOMURAI,SATAM,etal.Roleofadiponectininpreventingvascularstenosisthemissinglinkofadipovascularaxis[J].BiolChem,2021,277:374873749.[8]OUCHIN,KIHARAS,AROTAY,etal.Adipocytederivedplasmaprotein,adiponectin,suppresseslipidaccumulationandclassAscavengerreceptorespressioninhumanmonocytederivedmacrophages[J].Circulation,2021,103(8):10571063.[9]EKMEKCIH,EKMEKCIOB.Theroleofadiponectininatherosclerosisandthrombosis[J].ClinApplThrombHemost,2021,12:163168.[10]HOFFMEISTERHM,EHLERSR,BUTTCHERK,etal.ComparisonofCreactiveproteinandterminalcomplementcomplexinpatientswithunstableanginapectorisversusstableanginapectoris[J].AmJCardiol,2021,89:909912.[11]劉艷英,劉永銘,楊京港.高脂血癥患者補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59表達(dá)與脂肪細(xì)胞因子的關(guān)系研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2021,29(13):16221624.新生兒溶血病患者的免疫血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果研究來源：醫(yī)學(xué)論文發(fā)表——?jiǎng)?chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng)/孔慶芳作者單位：545005廣西柳州,廣西壯族自治區(qū)血液中心【摘要】目的探討不同群體新生兒溶血病(HDN)患者中ABOHDN患者的檢出率。方法采用免疫血液學(xué)的有關(guān)試驗(yàn)，鑒定HDN患者的ABO血型，定性檢測(cè)HDN患者紅細(xì)胞上結(jié)合的及血液中游離的病理性IgG抗A(B)。結(jié)果本組HDN患者中，ABOHDN患者的總體檢出率為79.29%,按性別分類,男性及女性患者中ABOHDN患者的檢出率分別為78.48%、79.89%,按ABO血型分類,A型及B型患者中ABOHDN患者的檢出率分別為79.42%、80.73%。結(jié)論不同群體的HDN患者中ABOHDN患者的檢出率均較高，都大于78%?！娟P(guān)鍵詞】免疫血液學(xué);ABO新生兒溶血病;檢出率StudyondetectionresultsofimmunohematologyofpatientswithhaemolyticdiseaseofthenewbornKONGQing-fang.BloodCenterofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Liuzhou545005,China【Abstract】ObjectivesToinvestigatethedetectionrateofpatientswithABOhaemolyticdiseaseofthenewborn(ABOHDN)indifferentgroupsofpatientswithhaemolyticdiseaseofthenewborn(HDN).MethodsUsingtherelatedtestofimmunohematology，ABObloodtypeweredeterminedinpatientswithHDN,anti-A(B)ofpathologicalIgGbindingtoerythrocyteandfreeinbloodweredeterminedqualitativelyinpatientswithHDN.ResultsInthisgroupsofpatientswithHDN,totaldetectionrateofpatientswithABOHDNwas79.29%,accordingtogender,detectionrateofpatientswithABOHDNinmaleandfemalepatientswere78.48%and79.89%respectively,accordingtoABObloodtype,detectionrateofpatientswithABOHDNinbloodtypeAandbloodtypeBpatientswere79.42%and80.73%respectively.ConclusionAllofthedetectionrateofpatientswithABOHDNindifferentgroupsofpatientswithHDNwererelativelyhigh,andweremorethan78%.【Keywords】immunohematology;ABOhaemolyticdiseaseofthenewborn;detectionrate新生兒出生后出現(xiàn)溶血性黃疸癥狀，這類疾病稱為新生兒溶血病(haemolyticdiseaseofthenewborn,HDN),按引起HDN的原因分類，可將HDN分為若干類型,其中最常見的類型為母嬰ABO血型不合,由IgG抗A(B)所引起的ABOHDN[1,2]。一般認(rèn)為，采用ABO正定型試驗(yàn)、熱放散試驗(yàn)、直接抗人球蛋白試驗(yàn)(DAT)及間接抗人球蛋白試驗(yàn)(IAT)等免疫血液學(xué)試驗(yàn)聯(lián)合運(yùn)用，可以診斷HDN中的ABOHDN，因此這些免疫血液學(xué)試驗(yàn)，通常被稱為是診斷ABOHDN的免疫血液學(xué)常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。近期筆者采用這個(gè)辦法，對(duì)942例HDN患者的血樣進(jìn)行檢測(cè)，以探討不同群體的HDN患者中ABOHDN患者的檢出率，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料與方法1.1標(biāo)本HDN患者血樣共942份，按性別分類：男性患者血樣395份，女性患者血樣547份;按ABO血型分類：A型患者血樣413份,B型患者血樣519份,O型患者血樣7份,AB型患者血樣3份;其中在HDN患者發(fā)病3天內(nèi)抽取的血樣占60%,4天后抽取的血樣占40%。1.2試劑2%～3%A型紅細(xì)胞懸液、2%～3%B型紅細(xì)胞懸液及2%～3%O型紅細(xì)胞懸液等自制;1%菠蘿酶溶液及抗人球蛋白試劑(抗IgG+C3d)等由上海血液中心提供。1.3檢測(cè)方法采用ABO正定型試驗(yàn)鑒定HDN患者的ABO血型，采用DAT及熱放散試驗(yàn)定性檢測(cè)HDN患者紅細(xì)胞上結(jié)合的病理性IgG抗A(B)，采用IAT定性檢測(cè)HDN患者血液中游離的病理性IgG抗A(B)，采用1%菠蘿酶溶液預(yù)處理試劑紅細(xì)胞。上述免疫血液學(xué)試驗(yàn)的操作方法，均參照文獻(xiàn)[3]中的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。1.4ABOHDN的診斷方法[1，4]HDN患者的免疫血液學(xué)常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果,出現(xiàn)下列任何一種情況者，均可將HDN患者診斷為ABOHDN患者：(1)A(B、AB)型，DAT、IAT及熱放散試驗(yàn)均陽(yáng)性;(2)A(B、AB)型，DAT陰性，IAT及熱放散試驗(yàn)均陽(yáng)性;(3)A(B、AB)型，DAT及IAT均陰性，熱放散試驗(yàn)陽(yáng)性;(4)A(B、AB)型,DAT及熱放散試驗(yàn)均陰性,IAT陽(yáng)性;(5)A(B、AB)型，DAT及熱放散試驗(yàn)均陽(yáng)性，IAT陰性。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用四格表χ2檢驗(yàn)。2結(jié)果942例HDN患者中,按性別分類：男性患者395例，女性患者547例，其免疫血液學(xué)部分常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目的結(jié)果見表1。表1男性及女性HDN患者的免疫血液學(xué)部分常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果(略)注:*與*比較,χ2=0.2775，P>0.50;**與**比較,χ2=28.034，P<0.005942例HDN患者中,按ABO血型分類：A型患者413例,B型患者519例,O型患者7例,AB型患者3例，其免疫血液學(xué)常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目的結(jié)果見表2。表2不同ABO血型的HDN患者的免疫血液學(xué)常規(guī)檢查項(xiàng)目結(jié)果(略)注:*與*比較,χ2=0.2293，P>0.50;**與**比較,χ2=11.159，P<0.0053討論本組HDN患者中ABOHDN患者的總體檢出率為79.29%,由此可見在HDN中,ABOHDN的發(fā)病率較高,其他類型的HDN發(fā)病率較低,與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[4]。本組HDN患者按性別分類,男性及女性患者中ABOHDN患者的檢出率分別為78.48%、79.89%，兩者比較差異無顯著性(P>0.50)，男性ABOHDN患者的構(gòu)成比與女性ABOHDN患者的構(gòu)成比比較差異有顯著性(P<0.005)，女性ABOHDN患者比男性ABOHDN患者多。本組HDN患者按ABO血型分類，A型及B型患者中ABOHDN患者的檢出率分別為79.42%、80.73%，兩者比較差異無顯著性(P>0.50)，A型ABOHDN患者的構(gòu)成比與B型ABOHDN患者的構(gòu)成比比較差異有顯著性(P<0.005)，B型ABOHDN患者比A型ABOHDN患者多.在本組檢出的ABOHDN患者中，有部分患者的DAT陰性或熱放散試驗(yàn)陰性,對(duì)此筆者認(rèn)為是由于患者紅細(xì)胞上結(jié)合的病理性IgG抗A(B)量較少所致;有部分患者的IAT陰性,對(duì)此筆者認(rèn)為是由于患者血液中游離的病理性IgG抗A(B)量較少所致。ABOHDN多發(fā)于O型母親所生的A型或B型新生兒[1,4]。由于ABOHDN的發(fā)病率較高,因此醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)高度重視。ABOHDN的病情進(jìn)展速度較快，易形成核黃疸，故在確診后應(yīng)立即采取適當(dāng)?shù)墓獐?、藥療及輸血治療，這是預(yù)防核黃疸形成的重要措施。就輸血治療而言，通常主張換血治療，其目的主要是清除ABOHDN患者體內(nèi)過高的未結(jié)合膽紅素、游離的病理性IgG抗A(B)及其致敏紅細(xì)胞，以降低未結(jié)合膽紅素、減輕溶血及糾正貧血，因此換血治療對(duì)預(yù)防核黃疸的形成及促進(jìn)患兒康復(fù)相當(dāng)有益[5]。診斷ABOHDN應(yīng)在新生兒出現(xiàn)黃疸癥狀時(shí)就抽血樣檢查，筆者認(rèn)為最遲不超過3天,這樣發(fā)生漏檢而誤診的可能性較小，若在3天后才抽血樣檢查,則發(fā)生漏檢而誤診的可能性較大。本組病例,有部分在3天后才抽血樣檢查,可能有一些ABOHDN患者漏檢?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1劉達(dá)莊.免疫血液學(xué).上海:上海科技出版社,2021，128-137.2肖星甫等譯.輸血技術(shù)手冊(cè).北京:人民衛(wèi)生出版社,1985，280-330.3中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中國(guó)輸血技術(shù)規(guī)程(血站部分).天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社,2021，40-120.4金漢珍，樊紹曾.新生兒母嬰血型不合溶血病.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1981，120-130.5WalkerRH.TechnicalManual,12thed.Alington:AABB,2021.老年冠心病患者血清脂聯(lián)素及肺炎衣原體抗體等水平的觀察來源：醫(yī)學(xué)論文發(fā)表——?jiǎng)?chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng)/劉俊恒倪黎剛史恒川作者單位：210024江蘇省南京市，江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院檢驗(yàn)科【摘要】目的探討老年冠心病(CHD)患者血清脂聯(lián)素、肺炎衣原體(Cpn)抗體及細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)等水平的變化及其臨床意義。方法臨床確診的老年CHD病人300例，以342例健康查體者為對(duì)照組，放免法測(cè)定其血清脂聯(lián)素，ELISA法檢測(cè)血清Cpn抗體及ICAM1、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素6(IL6)水平，同時(shí)對(duì)其作血脂分析。結(jié)果老年CHD患者血清CpnIgA抗體陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，IgM抗體則與對(duì)照組無顯著差異;急性心肌梗死(AMI)及不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)者CpnIgG抗體陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。CHD病人血清脂聯(lián)素明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，而ICAM1、CRP及IL6則明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論Cpn抗體高陽(yáng)性率及脂聯(lián)素的降低與老年冠心病之間存在聯(lián)系,而患者血清ICAM1、CRP及IL6水平的升高也提示炎癥反應(yīng)在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用?！娟P(guān)鍵詞】冠心病;脂聯(lián)素;肺炎衣原體;黏附分子SerumadiponectinandchlamydiapneumoniaantibodydeterminationinelderlypatientswithcoronaryheartdiseaseLIUJunheng,NILigang,SHIHengchuan.DepartmentofClinicalLaboratory,JiangsuProvinceOfficialHospital,Nanjing210024,China【Abstract】ObjectiveTodetermineserumadiponectin,chlamydiapneumonia(Cpn)antibodyandintercellularadhesionmolecule1(ICAM1)levelsinelderlypatientswithcoronaryheartdisease(CHD),andtofinditsclinicalsignificance.MethodsSerumadiponectin,Cpnantibody,ICAM1,Creactiveprotein(CRP)andinterleukin6(IL6)weredeterminedbyRIAorELISAin300CHDpatientsand342normalsubjects.Thebloodlipidlevelwasalsomeasuredatthesametime.ResultsThepositiverateofCpnIgAantibodyinelderlyCHDpatientswassignificantlyhigherthanthatinnormalpeople(P<0.01),buttherewasnodifferenceinIgMantibody.ThepositiverateofCpnIgGantibodyinpatientswithacutemyocardialinfarction(AMI)orunstableanginapectoris(UAP)wasalsosignificantlyhigherthanthatinnormalpeople(P<0.05).SerumadiponectininCHDpatientswaslowerthanthatinnormalpeople.ThelevelsofICAM1,CRPandIL6weresignificantlyhigherinCHDpatientsthanthoseinnormalpeople(P<0.05).ConclusionsThereisanrelationshipbetweenelderlyCHDandhighpositiverateofCpnantibodyorlowerlevelofserumadiponectin.TheseresultsindicatethathighlevelsofICAM1,CRP,IL6andinflammationplayanimportmentroleinelderlyCHD.【Keywords】coronaryheartdisease;adiponectin;chlamydiapneumonia;adhesionmolecule冠心病(CHD)以動(dòng)脈粥樣硬化(AS)為病理基礎(chǔ)。AS是由于各種損傷因子反復(fù)不斷刺激引發(fā)的一種以血管內(nèi)局部細(xì)胞增殖、纖維增生為基本病變的保護(hù)性炎癥反應(yīng)。肺炎衣原體(Cpn)感染可能作為損傷因素之一，觸發(fā)炎癥反應(yīng),并通過與機(jī)體免疫系統(tǒng)及局部細(xì)胞間的相互作用促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展[1];而脂聯(lián)素是由脂肪組織分泌、對(duì)血管壁損傷后的內(nèi)膜增生及AS斑塊形成具有拮抗作用[2]。本文對(duì)南京地區(qū)300例CHD患者血清脂聯(lián)素、Cpn抗體、部分炎癥因子及血脂水平作初步觀察，旨在探討它們?cè)贑HD的發(fā)生、發(fā)展中的作用。1對(duì)象和方法1.1研究對(duì)象2021～2021年我院及江蘇省人民醫(yī)院心內(nèi)科收治的CHD患者300例，其中男171例，女129例，年齡52～89歲，平均(70.3±7.4)歲，符合世界衛(wèi)生組織(WHO)CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)。300例患者中，急性心肌梗死組(AMI組)67例，不穩(wěn)定型心絞痛組(UAP組)124例，穩(wěn)定型心絞痛組(SAP組)109例。其中冠脈造影確診227例，造影正常73例。以上病例均排除其他器質(zhì)性心臟病、各種急慢性感染性疾病、嚴(yán)重腎功能不全、腫瘤、內(nèi)分泌疾病等對(duì)炎性因子水平影響較大的患者。對(duì)照組342例，其中男198例，女144例，均為健康體檢人員，年齡50～87歲，平均(68.9±7.1)歲。1.2主要試劑CpnIgA、IgG、IgM抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)EUROIMMUN公司，脂聯(lián)素檢測(cè)試劑購(gòu)自北京東雅，白細(xì)胞介素6(IL6)檢測(cè)試劑購(gòu)自法國(guó)IMMUNOTECH，細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)檢測(cè)試劑由美國(guó)R&D提供，超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)試劑由芬蘭ORION提供，血脂分析試劑由日本第一化學(xué)提供。1.3方法CHD患者和對(duì)照組均取晨空腹靜脈血2份，1h后分離血清，其中1份在ROCHEMODULARP自動(dòng)生化分析儀上酶法測(cè)定三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)，透射比濁法測(cè)定脂蛋白a[Lp(a)]、hsCRP;另1份-20℃凍存，4周內(nèi)ELISA法測(cè)定CpnIgA、IgG、IgM抗體、IL6、ICAM1，放免法測(cè)定脂聯(lián)素。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理CpnIgA、IgG、IgM抗體檢測(cè)結(jié)果以陰、陽(yáng)性表示，屬計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)分析。脂聯(lián)素、ICAM1、hsCRP、IL6及血脂分析結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析和q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1Cpn抗體檢測(cè)CHD患者血清CpnIgA抗體陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。與對(duì)照組相比，AMI組及UAP組病人IgG抗體陽(yáng)性率明顯升高(P<0.05)，而SAP組則差別不明顯(P>0.05)。各組CHD患者血清CpnIgM抗體陽(yáng)性率與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，見表1。表1各組CHD患者與對(duì)照組血清Cpn抗體水平的比較(略)注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.012.2脂聯(lián)素及炎癥相關(guān)因子的測(cè)定與對(duì)照組相比，CHD患者血清脂聯(lián)素明顯降低而ICAM1、CRP、IL6水平明顯升高。CHD各組間脂聯(lián)素?zé)o明顯差異。AMI組血清ICAM1、hsCRP、IL6顯著高于SAP組和UAP組(P均<0.01);UAP組ICAM1、IL6明顯高于SAP組(P<0.05)，而hsCRP則與SAP組無顯著差異(P>0.05)，見表2。表2各組CHD患者與對(duì)照組血清脂聯(lián)素ICAM1、hsCRP、IL6水平的比較(略)注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01;與SAP組比較，△P<0.05,△△P<0.012.3血脂分析CHD患者血清TC、TG、LDLC及Lp(a)水平均明顯高于對(duì)照組。AMI組、UAP組及SAP組TC、TG、Lp(a)水平無顯著差異，AMI組及UAP組LDLC水平明顯高于SAP組(P<0.05)，見表3。表3CHD患者血脂水平與對(duì)照組的比較(略)注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01;與SAP組比較，△P<0.053討論較多的研究證據(jù)表明，AS及CHD是多因素共同作用的結(jié)果，其中包括血脂異常升高、感染及炎癥、部分不良生活習(xí)慣等。近年來CHD的炎癥學(xué)說得到了廣泛重視。在致炎癥因素中，病原微生物感染是一個(gè)單獨(dú)危險(xiǎn)因素。這些感染性病原微生物包括巨細(xì)胞病毒以及Cpn[3]。自1988年Saikku等第一次報(bào)道血清Cpn抗體和CHD相關(guān)以來，已有大量的流行病學(xué)、病理學(xué)、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)等研究結(jié)果從不同的側(cè)面初步證明了Cpn感染與AS、CHD的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[4]。本研究結(jié)果顯示，CHD患者血清CpnIgA抗體陽(yáng)性率顯著高于同齡對(duì)照組，且AMI組及UAP組病人IgG抗體陽(yáng)性率也明顯升高，表明CHD可能與Cpn的慢性、持續(xù)性感染有關(guān)。Cpn還可通過誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(包括ICAM1、IL6)的產(chǎn)生[5]，加速血漿急性時(shí)相蛋白的合成，刺激促凝血物質(zhì)的表達(dá)以及引發(fā)脂質(zhì)代謝異常等方式間接促進(jìn)CHD的形成。循環(huán)中白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的黏附是AS的炎癥基礎(chǔ),這一過程主要由ICAM介導(dǎo)[6]。激活的EC高表達(dá)ICAM1，通過受體機(jī)制與單核/巨噬黏附，形成泡沫細(xì)胞。IL6具有極強(qiáng)的促炎癥反應(yīng)，可作用于多種靶細(xì)胞。它不僅促進(jìn)細(xì)胞增值分化，還能促進(jìn)T細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放IFNγ、IL1、TNF等炎癥因子,進(jìn)一步促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)。hsCRP是機(jī)體存在炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)志物，它可與血管內(nèi)皮細(xì)胞的受損部位結(jié)合。由于hsCRP具有激活補(bǔ)體、調(diào)理吞噬等作用，在清除外來致病因子的過程中，也單獨(dú)或者與體內(nèi)其他物質(zhì)協(xié)同促進(jìn)體內(nèi)免疫細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子，從而引起血管EC損傷加劇，對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成有促進(jìn)作用[1]。近來，許多臨床研究證實(shí)血中脂聯(lián)素水平往往與hsCRP、IL6等炎性因子呈負(fù)相關(guān)，并且脂聯(lián)素通過增加抗炎分子IL10的表達(dá)來拮抗炎癥因素對(duì)AS的成因[7]。本研究結(jié)果表明，與同齡正常人相比，CHD患者血清脂聯(lián)素顯著降低而血脂水平以及血清ICAM1、hsCRP、IL6明顯升高(SAP組CRP、IL6的結(jié)果與部分學(xué)者報(bào)道不完全一致，是否因分組標(biāo)準(zhǔn)或hsCRP測(cè)定方法不同所引起還有待進(jìn)一步探討)，提示炎癥反應(yīng)可能是CHD的病理生理基礎(chǔ)，高濃度的血液脂質(zhì)更易沉著于損傷的血管內(nèi)壁?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1]StassenFR,VainasT,BruggemanCA,etal.Infectionandatherosclerosis.Analternativeviewonanoutdatedhypothesis[J].PharmacolRep,2021,60(1):85[2]劉巖，鄒大進(jìn)，李慧，等.低脂聯(lián)素血癥是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2021，21(1)：58.[3]MamataY,HakkiA,NewtonC,etal.DifferentialeffectsofChlamydiapneumoniaeinfectiononcytokinelevelsinhumanTlymphocyteandmonocytederivedcellcultures[J].IntJMedMicrobiol，2021，297(2):109115.[4]ZhongG,FanP,JiH,etal.Identificationofachlamydialproteaselikeactivityfactorresponsibleforthedegradationofhosttranscriptionfactors[J].JExpMed，2021，193(8):935942.[5]馬愛國(guó).冠心病與肺炎衣原體感染關(guān)系的研究[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2021，19(1)：270271.[6]張紅，張平，陳亞紅，等.血清ICAM1和VCAM1聯(lián)合檢測(cè)在冠心病中的應(yīng)用[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2021，28(9)：782787.[7]李健洪，劉映峰，繆緋，等.超敏C反應(yīng)蛋白、脂蛋白(a)和脂聯(lián)素集成檢測(cè)診斷冠心病的價(jià)值[J].心臟雜志，2021，20(2)：210212.維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM－3凋亡作用的影響來源：醫(yī)學(xué)論文發(fā)表——?jiǎng)?chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng)/朱云鴻，徐瑞容黃紅銘，丁潤(rùn)生，陸偉作者單位：南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，南通226001【摘要】目的：為了研究維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM-3細(xì)胞凋亡效應(yīng)的影響。方法：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)硼替佐米15nmol/L+10、20、40、80μmol/L維生素C處理KM-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，用流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin-V/PI、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基(ROS)，用分光光度法檢測(cè)Caspase3活性。結(jié)果：硼替佐米對(duì)KM-3細(xì)胞增殖抑制作用降低，24hAnnexin-V陽(yáng)性細(xì)胞比例下降，△ψm降低被阻止，18h活性氧水平下降，16hCaspase-3活性下降。結(jié)論：維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)KM-3細(xì)胞凋亡效應(yīng)具有抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】多發(fā)性骨髓瘤;維生素C;硼替佐米;凋亡;活性氧EffectofVitaminConBortezomib-inducedapoptoticdeathinmultiplemyelomacelllineKM-3ZHUYunhong，XURuirong，HUANGHongming，etal(DepartmentofHematology，theAffiliatedHospitalofNantongUniversity，Nantong226001)[Abstract]Objective:ToinvestigatetheeffectofVitaminConmultiplemyelomacelllineKM-3apoptosisinducedbyBortezomib.Methods:Cellviabilityinhibitionratiowasestimatedbycountingmethod.Annexin-V，mitochondrialtransmembranepotential(Δψm)andreactiveoxygenspecies(ROS)labeledbyDCFHDAwereexaminedbyflowcytometry，andtheactivityofCaspase-3wasdetectedbyspectrophotometry.Results:TheinhibitionofBortezomibonthemultiplemyelomacelllineKM-3proliferationwasdecreased，theratioofAnnexin-Vpositivecellsatthe24thhourdeclined，thedecreaseof△ψmwasprevented，thelevelofROSatthe18thhourdropped，andtheactivityofCaspase-3atthe16thhourdeclined.Conclusion:VitaminCmayabrogatetheabilityofBortezomibtoinduceapoptosisonmultiplemyelomacelllineKM-3.[Keywords]Multiplemyeloma;VitaminC;Bortezomib;Apoptosis;Reactiveoxygen蛋白酶體抑制劑是近年來發(fā)現(xiàn)的一種靶向治療腫瘤的藥物。在真核細(xì)胞中80%以上蛋白降解是通過蛋白酶體介導(dǎo)的，蛋白酶體抑制劑通過對(duì)蛋白酶體的抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。硼替佐米是一種高選擇性，可逆的26S蛋白酶體抑制劑，是第1個(gè)進(jìn)入臨床的該類藥物。目前認(rèn)為硼替佐米的主要作用機(jī)制是抑制I-κB在蛋白酶體內(nèi)降解，使NF-κB停留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，功能受抑制，失去抗凋亡效應(yīng)和刺激細(xì)胞增生作用[1-2]。維生素C是一種多羥基化合物有清除氧自由基，抗氧化作用[3]。研究顯示維生素C能增強(qiáng)三氧化二砷對(duì)高發(fā)性骨髓瘤(MM)療效[4]。本實(shí)驗(yàn)探討抗氧化劑維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤KM-3細(xì)胞株凋亡的影響。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM-3(由上海長(zhǎng)征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈(zèng))置于含10%的胎牛血清(杭州四季青生物工程產(chǎn)品)的RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司產(chǎn)品)中，于37℃、5%CO2和95%空氣濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞以1×105細(xì)胞/ml的密度接種培養(yǎng)。1.2WST-1法檢測(cè)生長(zhǎng)抑制率WST-1(碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)在電子耦合劑存在的情況下，被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深;細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。在450nm處有吸收峰，生長(zhǎng)抑制率如下公式計(jì)算：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%1.3形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞收集至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。1.4Annexin-V分析使用FITC標(biāo)記的Annexin-V和PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，根據(jù)晶美生物工程提供的說明書進(jìn)行操作。即取(5~10)萬個(gè)細(xì)胞，經(jīng)4℃PBS漂洗2次，棄上清，加入250μlAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。取100μl移入流式細(xì)胞儀專用試管，加入5μlAnnexinV-FITC、10μl碘化丙啶染色液輕輕混勻。室溫(20~25℃)避光孵育15分鐘。加入400μlPBS輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。1.5線粒體跨膜電位(Δψm)檢測(cè)JC-1(碧云天生物生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)在線粒體膜電位較高時(shí)聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。用紅綠熒光的相對(duì)比例來衡量線粒體去極化的比例。取(10~60)萬細(xì)胞，重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5mlJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。600g4℃離心3~4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清，用冰浴的JC-1染色緩沖液洗滌2次，再用0.4mlJC-1染色緩沖液重懸后，用流式細(xì)胞儀分析。1.6Caspase3活性檢測(cè)Caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA，pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收，通過測(cè)定pNA吸光度來檢測(cè)Caspase3的活性。根據(jù)碧云天生物生物技術(shù)研究所產(chǎn)品說明操作。600g4℃離心5分鐘收集細(xì)胞，PBS洗滌1次。取200萬細(xì)胞加入100μl裂解液，冰浴裂解15分鐘。4℃16000~20000g離心10~15分鐘，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。取出10μl加入反應(yīng)體系37℃溫育出現(xiàn)變色后，于405nm測(cè)吸光度。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定pNA量。1.7活性氧檢測(cè)DCFHDA(碧云天生物生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化生成DCFH，DCFH不能通透細(xì)胞膜，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比。DCF的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，吸收波長(zhǎng)為525nm。收集一百萬細(xì)胞懸浮于1∶5000無血清培養(yǎng)液稀釋的1mlDCFH-DA中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入200μlPBS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)一萬個(gè)細(xì)胞。2結(jié)果2.1硼替佐米、硼替佐米+維生素C對(duì)KM-3細(xì)胞的抑制作用KM-3細(xì)胞經(jīng)10、25、50、75nmol/L濃度的硼替佐米處理24h后生長(zhǎng)抑制率的3次均值分別為40.83%、44.9%、51.2%和55.17%，48h分別為45.9%、58.7%、71.2%和78.1%。根據(jù)48h半數(shù)抑制濃度選擇藥物作用濃度，因此選擇硼替佐米15nmol/L作為藥物處理濃度。再將KM-3細(xì)胞經(jīng)硼替佐米15nmol/L+維生素C10、20、40、80μmol/L作用24、48h計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率3次均值分別為23.65%、11.1%、7.53%、4.3%;20.3%、9.8%、6.36%、3.40%(圖1)。選擇80μmol/L作為維生素C處理濃度。2.2維生素C對(duì)硼替佐米誘導(dǎo)KM-3細(xì)胞凋亡作用的影響2.2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變收集細(xì)胞涂片，瑞氏染色后光學(xué)顯微鏡下觀察對(duì)照組和維生素C組細(xì)胞形態(tài)正常(圖2A、2B)。硼替佐米+維生素C處理組細(xì)胞形態(tài)正常，偶見凋亡細(xì)胞(圖2C)。硼替佐米處理組可見胞膜皺縮、染色質(zhì)凝集、邊緣化、胞質(zhì)起泡(圖2D)。2.2.2AnnexinV分析24hAnnexinVFITC/PI雙標(biāo)結(jié)果顯示，硼替佐米處理組凋亡細(xì)胞比例重復(fù)3次為(16.3±1.95)%(圖3A)，硼替佐米+維生素C組為(8.46±0.89)%(圖3B)，低于硼替佐米處理組(P<0.01)。對(duì)照組為(5.41±1.3)%(圖3C)。維生素C組為(4.9±1.4)%(圖3D)。2.2.3線粒體跨膜電位變化硼替佐米處理組24h后△ψM檢測(cè)顯示△ψM降低，綠色熒光細(xì)胞比率重復(fù)3次為(11.32±1.86)%(圖4A)，高于硼替佐米+維生素C處理組(5.1±0.91)%(P<0.01)(圖4B)。對(duì)照組為(4.6±0.98)%(圖4C)。維生素C組為3.6±0.84%(圖4D)。2.2.4Caspase-3活性硼替佐米處理組16h后3個(gè)平行組產(chǎn)生的pNA為25.21±0.349μmol。硼替佐米+維生素C處理組為21.79±0.198μmol，低于硼替佐米組(P<0.01)。對(duì)照組為20.67±0.156μmol，維生素C組為20.12±0.17μmol。2.2.5活性氧水平變化18h后平均熒光強(qiáng)度硼替佐米+維生素C處理組為30.2±1.96(圖5A)低于硼替佐米處理組為52.23±1.9(圖5B)(P<0.01);對(duì)照組為28.4±1.87(圖5C);維生素C組為21.3±1.6(圖5D)低于對(duì)照組(P<0.01)。3討論維生素C是具有許多生物學(xué)功能水溶性的葡萄糖類物質(zhì)。Sestili等[5]認(rèn)為高劑量維生素C有親氧化作用，低劑量有抗氧化作用。維生素C既能防止化療藥物對(duì)腫瘤及正常組織的損傷[6]，又能協(xié)同化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[7]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，低濃度的維生素C(4mmol/L)對(duì)SW620纖維瘤細(xì)胞有保護(hù)作用，而高劑量(>20mmol/L)對(duì)細(xì)胞有殺傷作用[8]。本實(shí)驗(yàn)中AnnexinV/PI分析顯示加入維生素C后，細(xì)胞早期凋亡率明顯下降。硼替佐米處理24h后細(xì)胞呈典型凋亡改變，加入維生素C后細(xì)胞形態(tài)大體正常。所以認(rèn)為維生素C在較低濃度(80μmol/L)下有抑制硼替佐米對(duì)KM-3凋亡的誘導(dǎo)作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有3種信號(hào)通路：死亡受體信號(hào)通路、線粒體信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路，目前認(rèn)為線粒體途徑在凋亡過程發(fā)揮樞紐作用[9]。氧化刺激、Ca2+過量攝取等誘導(dǎo)因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，都有線粒體跨膜電位消失。因而線粒體跨膜電位的消失標(biāo)志著一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的凋亡過程。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加入維生素C后線粒體膜電位崩潰的綠色熒光細(xì)胞比率較硼替佐米處理組顯著降低。Caspase蛋白酶家族是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，實(shí)驗(yàn)顯示KM-3細(xì)胞經(jīng)硼替佐米作用16h后pNA產(chǎn)生增加Caspase-3活性較對(duì)照升高，加入維生素C后pNA產(chǎn)生減少，酶活性下降。正常情況下NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞質(zhì)中與抑制劑I-κB相互作用形成復(fù)合體，防止NF-κB進(jìn)入核內(nèi)，NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用被阻斷;一旦I-κB磷酸化與NF-κB解離，NF-κB進(jìn)入核內(nèi)誘導(dǎo)抗凋亡蛋白的合成，細(xì)胞增生并表達(dá)黏附分子導(dǎo)致細(xì)胞增生、存活;而在MM瘤細(xì)胞中NF-κB組成性激活，導(dǎo)致瘤細(xì)胞不斷增生。如果I-κB在蛋白酶體內(nèi)降解受抑制，NF-κB停留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，功能受抑制，失去抗凋亡效應(yīng)和刺激細(xì)胞增生作用[10-11]。目前認(rèn)為這是硼替佐米的主要作用機(jī)制，但硼替佐米并不僅僅通過抑制該通路發(fā)揮作用，還存在其他作用機(jī)制?；钚匝跏羌?xì)胞凋亡的信號(hào)之一，活性氧的產(chǎn)生可直接或間接改變線粒