腫瘤靶向性藥物個體化治療李智第1頁/共56頁人類基因組計(jì)劃(HGP)：1996-2003

確定人類基因組所攜帶的全部遺傳信息，并確定、闡明和

記錄組成人類基因組的全部DNA序列

細(xì)胞染色體細(xì)胞染色體蛋白質(zhì)生命的分子40-60萬億細(xì)胞每個細(xì)胞:染色體：46條DNA：2m堿基對：30億（A,T,C,G）編碼基因：3萬（編碼執(zhí)行生命功能的所有蛋白質(zhì)）第2頁/共56頁人類基因組研究人類基因組計(jì)劃，1996完成人類基因組的常染色體測序.Nature2004;431(7011):931-945.國際人類基因組單體型圖計(jì)劃，2005旨在確定和編目人類遺傳的相似性和差異性。利用HapMap獲得的信息，研究人員將能夠發(fā)現(xiàn)與人類健康、疾病以及對藥物和環(huán)境因子的個體反應(yīng)差異相關(guān)的基因。目標(biāo)是通過比較不同個體的基因組序列來確定染色體上共有的變異區(qū)域Nature2005:437(7063):1299-1320DNA元素百科全書

(ENCODE)計(jì)劃2003建立人類基因組1%目的基因中生物功能關(guān)鍵性元素目錄

Nature2007;447(7146):799-816千人基因組計(jì)劃，2008國際千人DNA測序.查出千個人中基因組的差異Science2008;319(5863):395Source:U.S.DOE(),HumanGenomeProjectInformation第3頁/共56頁美國FDA批準(zhǔn)的靶向性治療藥物方框內(nèi)藥物為美國FDA要求和推薦檢測藥物分子靶標(biāo)的遺傳變異情況。藥物名稱商品名稱分子靶點(diǎn)藥物性質(zhì)針對腫瘤類型帕尼（Panitumucetumab)維克替比（Vectibix）曲妥珠（trastuzumab)貝伐（bevacizumab)利妥昔（rituximab)替伊莫（ibritumomabtiuxetan)托西莫（tositumomab-I131）吉妥（gemtuzumabozogamicin）almtuzumab伊馬替尼（imatinibmesylate)吉非替尼（gefitinib)埃羅替尼（erlotinb)舒尼替尼（sunitinb)索拉非尼（sorafenib)硼替佐米（bortezomib)赫賽汀(Herceptin)阿瓦斯?。ˋvastin)美羅華（Rituxan)澤娃靈（Zevalin)Bexxar麥羅塔（Mylotarg)坎帕斯（Campath)格列衛(wèi)（Gleevec)易瑞沙（Iressa)特羅凱（Tarceva)Sutent多吉美（Nexavar)萬珂（Velcade)EGFRHER-2(c-erB2)VEGFRCD20CD20CD20CD33CD52BCR-ABL、KIT、PDGFREGFREGFRVEGFR、KIT、FR、FLT3VEGFR2、PDGFR28SproteasemAbmAbSMISMISMISMISMImAbmAbmAbmAbmAbmAbSMI結(jié)直腸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌乳腺癌白血病非小細(xì)胞肺癌非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌胃腸間質(zhì)瘤、腎癌腎癌多發(fā)性骨髓瘤結(jié)直腸癌B細(xì)胞淋巴癌B細(xì)胞淋巴癌B細(xì)胞淋巴癌急性粒細(xì)胞白血病B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病胃腸間質(zhì)瘤、慢性粒細(xì)胞B-raf、FLT3西妥昔（cetuximab)愛必妥（Erbitux）EGFRmAb結(jié)直腸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌第4頁/共56頁腫瘤靶向性治療藥物作用機(jī)制臨床研究處在的EGFR類靶向藥物：H447、MDX210（雙能EGFR抗體，嵌合CD64抗體）。目前由超過20種EGFR抗體藥物正在研發(fā)中；小分子靶向治療藥物:吉非替尼、埃羅替尼和依馬替尼分別作用于EGFR和c-KIT受體。第5頁/共56頁腫瘤靶向性藥物個體化治療檢測臨床應(yīng)用西妥昔、帕尼療效預(yù)測吉非替尼、埃羅替尼療效預(yù)測伊馬替尼療效預(yù)測曲妥珠單抗療效預(yù)測第6頁/共56頁腫瘤靶向性藥物個體化治療一、K-ras基因檢測與結(jié)直腸癌靶向性藥物治療第7頁/共56頁CRC靶向性藥物治療

結(jié)直腸癌（CRC）靶向藥物治療：

--EGFR（epidermalgrowthfactor）抑制劑：小分子化合物和EGFR抗體

--血管生成抑制劑：VEGFR抗體（貝伐單抗Bevacizumab）

EGFR抗體：

--Cetuximab

（西妥昔單抗）：鼠源性嵌合型抗體

--Panituximab(帕尼單抗）：人源化抗體

臨床研究表明，anti-EGFR靶向治療可使CRC患者生存期延

長1倍（無基因突變）

當(dāng)患者EGFR信號通路出現(xiàn)基因突變時(shí)，anti-EGFR可能抗

體不起作用。第8頁/共56頁KRAS蛋白BRAF蛋白AA細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡增殖遷移血管增生PTEN蛋白10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因蛋白磷酸肌醇3激酶EGFR信號傳導(dǎo)通路第9頁/共56頁

EGFR相關(guān)基因突變與EGFR抗體療效EGFR：

突變頻率：10~15%

療效：沒影響？更好？BRAF：

突變頻率：8~10%

療效：可能相關(guān)PI3K：

突變頻率：10~15%

療效：相關(guān)與否？PTEN：突變頻率：10~15%療效：相關(guān)與否？RAS原癌基因： 突變頻率：KRAS~40%；NRAS3~5%；HRAS0~1% 療效：KRAS與療效密切相關(guān)；NRAS？

HRAS？第10頁/共56頁KRAS基因突變的影響KRAS基因狀態(tài)：野生型、突變型野生型的KRAS蛋白由上游EGFR活化而導(dǎo)致短暫激活，其后迅速失活。KRAS

激活/失活效應(yīng)是受控的。突變型KRAS蛋白導(dǎo)致蛋白功能異常，在無EGFR活化信號刺激下仍處于激活狀態(tài)，其功能狀態(tài)不可控，導(dǎo)致腫瘤的持續(xù)增殖等。第11頁/共56頁KRAS基因突變與EGFR用藥指針第12頁/共56頁KRAS基因突變與西妥昔單抗療效相關(guān)JClinOnoclogy26(3):1374-9,2008

A.無進(jìn)展生存期B.總體生存期西妥昔治療組間療效比較第13頁/共56頁西妥昔單抗僅可在野生型個體中改善總體生存率NEnglJMed359;17October23,2008KRAS基因突變與西妥昔單抗療效相關(guān)AMutationKRASBWild-typeKRASOverallSurvival(%)MonthsafterRandomizationMonthsafterRandomizationOverallSurvival(%)西妥昔治療與對照支持療法療效比較第14頁/共56頁NEnglJMed359;17October23,2008KRAS基因突變與西妥昔單抗療效相關(guān)AMutationKRASBWild-typeKRASProgression-freeSurvival(%)Progression-freeSurvival(%)MonthsafterRandomizationMonthsafterRandomization西妥昔單抗僅可在野生型個體中改善無進(jìn)展生存率第15頁/共56頁KRAS基因突變種類

基因點(diǎn)突變—最常見方式，多發(fā)生在

codons12，13，61密碼子上KRAS基因突變96%發(fā)生在12、13號密碼子上G12D(35G>A):12號密碼子編碼甘氨酸突變成天門冬氨酸為最主要形式

GGT

GGCGT12號密碼子13號密碼子

G/c/t/aG/c/t/aT

G/c/t/aG/c/t/aCGT12號密碼子13號密碼子第16頁/共56頁K-ras突變種類及頻率12：GAT12：GTT13：GAT第17頁/共56頁K-ras突變總頻率39%61%WTMutationInsufficientmaterial0%第18頁/共56頁石蠟包埋組織標(biāo)本切片刮取切片或直接溶解（放在EP管里的標(biāo)本）選取至少含50%腫瘤組織的切片試劑盒提取DNAKRAS基因突變檢測流程DNA濃度檢測（質(zhì)控）目的片段擴(kuò)增（生物素標(biāo)記的PCR引物擴(kuò)增）制備目的基因片段單鏈DNA模板上機(jī)檢測與結(jié)果分析、發(fā)報(bào)告第19頁/共56頁KRAS基因突變檢測送樣要求若不能按上述操作提供樣本，請?zhí)峁?0張標(biāo)準(zhǔn)不染色的石蠟組織切片石蠟包埋腫瘤組織塊:石蠟包埋組織1塊，常溫保存、運(yùn)輸。剩余蠟塊歸還。石蠟包埋腫瘤組織切片：1.切片厚度10μm，8-10片。2.不需鋪片和貼片，組織切片轉(zhuǎn)移至小塑料離心管（EP管）。3.每管放5張面積約250mm2（成人拇指蓋大小）的腫瘤組織切片。4.如果腫瘤組織切片的面積較小，請適當(dāng)增加切片的數(shù)量（不超過12張）。5.送樣時(shí)分裝兩管，用于檢測和備份。6.樣本常溫保存、運(yùn)輸。第20頁/共56頁KRAS基因突變Pyrosequencing檢測圖譜12、13密碼子分別為野生型：GGT和GGC12密碼子為突變型：GAT12密碼子為突變型：GTT12密碼子為突變型：TGT13密碼子為突變型：AGC13密碼子為突變型：GAT第21頁/共56頁KRAS基因突變檢測報(bào)告第22頁/共56頁二、非小細(xì)胞肺癌與EGFR基因突變檢測腫瘤靶向性藥物個體化治療第23頁/共56頁EGFR–非小細(xì)胞肺癌治療重要靶標(biāo)TKTKATPATP細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡血管生成基因轉(zhuǎn)錄翻譯細(xì)胞周期進(jìn)程+非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)組織與正常組織比較與更高的EGFR表達(dá).EGFR–對腫瘤的增殖、分化、遷移等作用起重要作用.對EGFR的抑制可阻斷下游的信號傳導(dǎo)活性.EGFR抑制藥沒有嚴(yán)重的毒性反應(yīng).放化療抵抗細(xì)胞遷移擴(kuò)散第24頁/共56頁NSCLC靶向治療藥物晚期NSCLC單藥治療

Gefitinib&Erlotinib:Cetuximab單藥或與伊立替康聯(lián)合用藥治療轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌、研究表明也可用于晚期NSCLC治療

Gefitinib250mgO.D.oralErlotinib150mgO.D.oralCetuximab400mg/m2i.v.→200mg/m2i.v.wkly劑量第25頁/共56頁---85%~96%的突變?yōu)榉謩e發(fā)生第19（缺失突變）和第21（L858R-亮氨酸>精氨酸）的突變，少部分發(fā)生在20號外顯子，極少部分發(fā)生在18號外顯子---與EGFR-TKI反應(yīng)活性相關(guān)EGFR突變主要發(fā)生洛氨酸激酶域EGFR基因主要突變LynchTJ,etal.NEnglJMed.2004;350(21):2129-2139第26頁/共56頁EGFR基因主要突變EXON18EXON19EXON20EXON21EXON22EXON23EXON24G719X4%DelE746-75023%DelE746-751insS12%DelE746-753insS14%L858R39%L861Q1%S768I1%Exon20ins5%C790T1%19外顯子突變占49%，21外顯子突變占40%，20號外顯子占7%，18號外顯子突變只占4%。因此，通常檢測EGFR突變只檢測19、20、21號外顯子或19、21號外顯子。注：C790T為耐藥突變，用藥3至6個月后，須接受耐藥突變，為是否繼續(xù)用藥提供參考。第27頁/共56頁A.無進(jìn)展生存時(shí)間B.總生存時(shí)間Hanetal.JClinOncology23(11),2006EGFR突變與吉非替尼、埃羅替尼療效第28頁/共56頁基因突變位點(diǎn)突變功能用藥建議EGFRDel（Glu746--Ala750）高反應(yīng)性建議用此類藥化療Leu858Arg高反應(yīng)性建議用此類藥化療酪氨酸激酶抑制劑(EDFRTKI):吉非替尼,埃羅替尼主要用于非小細(xì)胞肺癌。絕大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌病人對吉非替尼無反應(yīng)，但約10~15%

的病人對吉非替尼表現(xiàn)出快速，且非常顯著的臨床療效。EGFR基因18-21號外顯子編碼酪氨酸激酶區(qū)，此段基因序列發(fā)生突變后會使EGFR被配體激活后磷酸化程度升高或持續(xù)激活下游信號通路，從而使TKI抑制劑吉非替尼的療效更好。

EGFR突變與吉非替尼、埃羅替尼療效第29頁/共56頁EGFR突變與吉非替尼療效突變者1年和18個月存活率者為90%和80%，而野生型分別為60%和40%第30頁/共56頁0612182430380255075100ProportionaliveLog-rankp=0.01EGFRexon19deletion(n=23)EGFRL858R(n=11)Months

19號外顯子的缺失突變平均存活時(shí)間為34個月，大大長于21號外顯子突變者的8個月，后者的存活時(shí)間也比野生型長。EGFR突變與吉非替尼、埃羅替尼療效第31頁/共56頁石蠟包埋標(biāo)本切片刮取切片或直接溶解（放在EP管里的標(biāo)本）選取至少含50%腫瘤組織的切片試劑盒提取DNADNA了濃度檢測（質(zhì)控）目的基因特異引物PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物純化后上機(jī)Sanger法測序結(jié)果分析與發(fā)報(bào)告EGFR突變檢測流程第32頁/共56頁EGFR突變檢測標(biāo)本送樣要求石蠟包埋組織標(biāo)本要求同前外周靜脈非肝素抗凝血液---大量研究表明外周血DNA與腫瘤組織標(biāo)本DNA的EGFR基因型的吻合率為76%~91%（Jonetal.JClinOncology26(35),2008---適用于：NSCLC晚期患者不能手術(shù)治療者第33頁/共56頁用藥建議EGFR基因19-21號外顯子突變的純合子或雜合子病人，建議使用含吉非替尼、艾羅替尼的化療方案可以取得較好療效，顯著延長期生存期；無突變者不推薦使用酪氨酸激酶抑制劑。第34頁/共56頁EGFR突變檢測報(bào)告第35頁/共56頁腫瘤靶向性藥物個體化治療三、胃腸間質(zhì)瘤與c-Kit基因突變檢測第36頁/共56頁胃腸間質(zhì)瘤（gastrointestinalstromaltumors,GIST）胃腸道最常見的肉瘤：

--間葉源（結(jié)締組織）性腫瘤

--占胃腸道肉瘤的80%GIST年發(fā)病率為14.5/100萬，患病率為129/100萬。1993年發(fā)現(xiàn)CD34為免疫組化標(biāo)記物，1998年發(fā)現(xiàn)CD117為高特性標(biāo)記物，并發(fā)現(xiàn)c-Kit基因突變。第37頁/共56頁GIST的免疫表型GIST中KIT的陽性染色（膜和胞漿以及核旁點(diǎn)狀濃集）約95%的GIST

c-Kit

(CD117)陽性。GIST中其它陽性指標(biāo)：--CD34(間葉/造血祖細(xì)胞標(biāo)記物），陽性率60-70%。--平滑肌動蛋白，陽性率15-60%。--S-100，陽性率10%。GIST偶爾表達(dá)結(jié)蛋白。第38頁/共56頁c-Kit受體家族功能獲得性c-Kit突變導(dǎo)致GIST、黑色素細(xì)胞功能障礙和皮膚肥大細(xì)胞增多癥的發(fā)病率增高c-Kit受體：CD117、干細(xì)胞因子受體(SCFR)、肥大細(xì)胞生長因子受體(MGFR）受體結(jié)構(gòu)：位于細(xì)胞膜上，為Ⅲ型酪氨酸激酶受體。細(xì)胞外有與配體干細(xì)胞因子（SCF）結(jié)合區(qū)域。細(xì)胞胞內(nèi)區(qū)包括：2個酪氨酸激酶區(qū)和多個自身磷酸化位點(diǎn)。生理活性：KIT受體與干細(xì)胞因子結(jié)合后被激活（磷酸化），導(dǎo)致磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，能夠調(diào)節(jié)凋亡、細(xì)胞分化、增殖、趨化以及細(xì)胞黏附。第39頁/共56頁GIST治療現(xiàn)狀手術(shù)切除可能治愈，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高（55%-90%）放射治療不敏感，RR<5%。傳統(tǒng)全身化療：無效或<10%，未延長OS。支持療法不能控制病情進(jìn)展。目前內(nèi)科藥物治療主要采用靶向性藥物:--伊馬替尼（Imatinib,格列衛(wèi)），為復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移GIST的標(biāo)準(zhǔn)一線治療藥物

--舒尼替尼第40頁/共56頁伊馬替尼作用機(jī)制伊馬替尼作用于c-Kit蛋白，與c-Kit蛋白結(jié)合，占據(jù)了ATP在激酶區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。阻止底物的磷酸化及信號傳導(dǎo)。信號傳導(dǎo)阻滯，抑制了細(xì)胞的增殖與存活?？勺饔糜诙喟悬c(diǎn):

--除c-Kit外，還有c-Ab1、Bcr-Ab1和PDGFR。第41頁/共56頁KIT基因突變Heinrichetal.HumPathol2002;33:484.細(xì)胞膜細(xì)胞漿Exon9:18.1%Exon11:66.9%Exon13:1.6%Exon17:1.6%JuxtamembraneDomainTK1DomainTK2DomainKinaseInsertKIT第42頁/共56頁c-Kit基因突變對伊馬替尼敏感性的預(yù)測c-Kit第43頁/共56頁c-Kit基因突變與無事件生存時(shí)間（率）第44頁/共56頁c-Kit基因突變與總生存期（率）第45頁/共56頁耐藥GIST治療用藥建議1、大部分腫瘤被伊馬替尼控制，則繼續(xù)用藥。2、增加伊馬替尼劑量至800-1000mg/d。3、加用舒尼替尼治療。無突變患者：第46頁/共56頁腫瘤靶向性藥物個體化治療四、乳腺癌個體化藥物治療與HER-2第47頁/共56頁表皮生長因子受體家族及HER2生理學(xué)特性基因HER1(c-erB-1)HER2(c-erB-2)HER4(c-erB-4)HER3(c-erB-3)配體EGFTGF-αΒ-動物纖維素肝素結(jié)合生長因子雙調(diào)因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白?

HER2表達(dá)：胚胎期表達(dá)，成年正常組織中僅可檢測到少量HER2蛋白，且基因?yàn)閱?/p>