第五章環(huán)境化學(xué)物致突變性及其評價/10/101第1頁第1頁環(huán)境毒理學(xué)第一節(jié)環(huán)境化學(xué)物致突變性及其評價

一、基本概念生物個體和各代之間存在著種種差別，我們通常稱之為變異（variation）?；谌旧w和基因變異才干夠遺傳，而遺傳變異稱為突變（mutation）。突變發(fā)生及其過程就是致突變作用（mutagenesis）。突變可分為自發(fā)突變(natural或sporadicmutation)和誘發(fā)突變(inducedmutation）。各物種自發(fā)突變頻率較低,而誘發(fā)突變比較常見,誘發(fā)突變指由于物理、化學(xué)、生物等環(huán)境原因引起突變。至今,已發(fā)覺相稱數(shù)量外源化學(xué)物能損傷遺傳物質(zhì)，從而誘發(fā)突變，這些物質(zhì)稱為致突變物或誘變劑（mutagen），也稱為遺傳毒物(genotoxicagent）。

2第2頁第2頁環(huán)境毒理學(xué)環(huán)境化學(xué)誘變劑分類第一組人工合成,僅在一定條件下應(yīng)用誘變劑

1.藥物抗癌藥抗菌素,麻醉藥和避孕藥等

2.農(nóng)藥殺蟲劑,滅鼠劑,除莠劑和除霉劑等及他們殘留物

3.食品添加劑

4.化妝品

5.生物污染第二組工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用或產(chǎn)生環(huán)境誘變劑

1.工業(yè)烷化劑

2.有機溶劑及有機金屬化合物

3.水污染物

4.空氣污染物

5.重金屬及其化合物第三組自然界存在誘變劑與食品加工過程產(chǎn)生誘變劑

1.生物堿

2.微生物代謝產(chǎn)物

3.食品加工過程中產(chǎn)生誘變劑3第3頁第3頁環(huán)境毒理學(xué)二、突變類型

普通依據(jù)遺傳物質(zhì)損傷能否在顯微鏡下直接觀測到分為染色體畸變(chromosomeaberration)和基因突變(genemutation)兩類：染色體損傷不小于或等于0.2微米時，可在光學(xué)顯微鏡下觀測到，稱為染色體畸變；若小于這一下限，不能在鏡下直接觀測到，要依托對其后代生理、生化、結(jié)構(gòu)等表型改變判斷突變發(fā)生，稱為基因突變(genemutation），亦稱點突變(pointmutation）。4第4頁第4頁環(huán)境毒理學(xué)5第5頁第5頁環(huán)境毒理學(xué)6第6頁第6頁7第7頁第7頁8第8頁第8頁化學(xué)毒物致突變類型(一)、基因突變(genemutation)

1．堿基置換(base—pairsubstitution)指某一堿基配對性能改變或脫落所致突變。(DNA堿基被其它堿基所取代)堿基：腺嘌呤（A,Adenine)

鳥嘌呤（G,Guanine)

胞嘧啶（C,Cytosine)

胸腺嘧啶（T,Thymine)A-T;G-C,三個堿基對構(gòu)成一個密碼子轉(zhuǎn)換(transition)顛換(transvertion)9第9頁第9頁它包含轉(zhuǎn)換和顛換兩種情況：原來嘌呤被另一嘌呤置換或原來嘧啶被另一嘧啶置換，我們稱之為轉(zhuǎn)換(transition）；若原來嘌呤被嘧啶置換或原來嘧啶被嘌呤置換，我們則稱之為顛換(transversion）。不論是轉(zhuǎn)換還是顛換都只包括一對堿基，其結(jié)果可造成一個三聯(lián)體密碼子改變,可能出現(xiàn)同義密碼、錯義密碼和終止密碼。因為錯義密碼所編碼氨基酸不同，表示蛋白質(zhì)可能發(fā)生改變；假如錯義密碼為終止密碼，可使所編碼蛋白質(zhì)肽鏈縮短。10第10頁第10頁(一)、基因突變(genemutation)化學(xué)毒物致突變類型11第11頁第11頁化學(xué)毒物致突變類型(一)、基因突變(genemutation)12第12頁第12頁2．移碼突變(frameshiftmutation)指發(fā)生一對或幾對（三對除外）堿基減少或增長，以致從受損點開始堿基序列完全改變，形成錯誤密碼，并轉(zhuǎn)譯成為不正常氨基酸。

3、大段損傷大片段損傷是指DNA鏈大段缺失或插入。這種損傷有時可跨越兩個或數(shù)個基因，但所缺失片段仍遠小于光鏡下所能觀測到染色體改變，故又可稱為小缺失。13第13頁第13頁(二)、染色體畸變(chromosomeaberration)

指染色體結(jié)構(gòu)改變?nèi)旧珕误w型畸變(chromatid-typeaberration)染色體型畸變(chromosomeaberration)染色體畸變裂隙(gap)

斷裂(break)斷片(fragment)和缺失(deletion)

微小體(minutebody)

無著絲點環(huán)環(huán)狀染色體

雙著絲點染色體

倒位(inversion)

易位(translocation)

插入(insertion)和重復(fù)(duplication)輻射體

化學(xué)毒物致突變類型14第14頁第14頁（1）裂隙和斷裂（gapandbrake）：都是指染色體上狹窄非染色帶，其所分割兩個節(jié)段保持線狀連接為裂隙，不然為斷裂。（2）無著絲粒斷片和缺失(acentricfragmentanddeletion)：一個染色體發(fā)生一次或多次斷裂而不重接，且這些斷裂節(jié)段遠遠分開會出現(xiàn)一個或多個無著絲粒斷片和一個缺失了部分染色質(zhì)并帶有絲粒異常染色體。細胞再次分裂時會形成微核或微小體。（3）環(huán)狀染色體（ringchromosome）：染色體兩臂各發(fā)生一次斷裂，其帶有著絲粒節(jié)段兩斷端連接成一個環(huán)，稱之為環(huán)狀染色體。（4）倒位(inversion)：當(dāng)染色體發(fā)生兩次不同部位斷裂時，中間節(jié)段倒轉(zhuǎn)1800再重接，為倒位。（5）插入和重復(fù)(insertionandduplication)：當(dāng)一個染色體發(fā)生三處斷裂，帶有兩斷段斷片插入到另一臂斷裂處或另一染色體斷裂處重接稱為插入，若缺失染色體和插入染色體是同源染色體，且各有一處斷裂發(fā)生于同一位點，則出現(xiàn)兩段相同節(jié)段，稱為重復(fù)。（6）易位(translocation)：從某個染色體斷下節(jié)段連接到另一個染色體上稱為易位。兩染色體各發(fā)生一次斷裂，只一個節(jié)段連到另一染色體上為單方易位，相互重接為相互易位，若發(fā)生3處以上斷裂，其互換重接稱為復(fù)雜易位。15第15頁第15頁

染色體缺失及環(huán)狀染色體形成圖

染色體插入和重復(fù)示意圖

16第16頁第16頁

染色體臂間倒位

染色體互相易位示意圖

17第17頁第17頁(二)、染色體畸變(chromosomeaberration)化學(xué)毒物致突變類型18第18頁第18頁(三)、基因組突變

1．非整倍體非整倍體(aneuploid)指細胞丟失或增長一條或幾條染色體。缺失一條染色體時稱為單體(monosome)，增長一條染色體時稱為三體(trisome)。染色體數(shù)目的改變會造成基因平衡失調(diào)，也許影響細胞生存或造成形態(tài)及功效上異常。如21三體造成先天愚型(Down氏綜合征)。2．整倍體整倍體(euploid)指染色體數(shù)目的異常是以染色體組為單位增減，如形成三倍體(triploid)、四倍體(tetroploid)等。在人體，3n為69條染色體，4n為92條染色體。在腫瘤細胞及人類自然流產(chǎn)胎兒細胞中可有三倍體細胞存在。發(fā)生于生殖細胞整倍體改變，幾乎都是致死性?；瘜W(xué)毒物致突變類型19第19頁第19頁致突變作用機制三致突變作用機理一、DNA損傷與突變1.堿基錯配(共價結(jié)合)2.嵌入DNA鏈3.堿基類似物取代4.堿基化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞

20第20頁第20頁二、DNA損傷修復(fù)遺傳信息之因此能長期保持高度保真(fidelity)即重現(xiàn)精度，是由于細胞能夠:①通過對DNA損傷修復(fù)以保護親代DNA鏈，使之避免由于外來原因作用而發(fā)生改變；②執(zhí)行高度保真復(fù)制，即對復(fù)制中發(fā)生錯誤及時修復(fù)以達到高度保真性?，F(xiàn)已證實突變頻率與各種酶性DNA修復(fù)和防錯系統(tǒng)效率呈負性相關(guān)。但也有一些是易錯(error-prone)修復(fù)系統(tǒng)。21第21頁第21頁機體修復(fù)DNA損傷機制可分為兩大類：1.損傷耐受機制：指DNA遺傳可繞過那些制止DNA復(fù)制DNA損傷。

2.修復(fù)機制：DNA修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)O6甲基鳥嘌呤修復(fù)光修復(fù)錯配堿基修復(fù)堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)機體對致突變作用影響復(fù)制后修復(fù)呼救性修復(fù)22第22頁第22頁預(yù)計人類內(nèi)源性DNA損傷和修復(fù)過程

損傷類型損傷發(fā)生率最大修復(fù)速度脫嘌呤1000a

脫嘧啶55a

胞嘧啶脫氨15a

單鏈斷裂50002×105N7—甲基化鳥嘌呤3500aO6—甲基化鳥嘌呤130104

氧化性產(chǎn)物120105注：損傷發(fā)生率以每小時每細胞發(fā)生次數(shù)計，最大修復(fù)速度以每小時每細胞修復(fù)堿基對數(shù)計，a指雖已測出實際值，但預(yù)計最大修復(fù)速度為發(fā)生率2倍以上

23第23頁第23頁1、復(fù)制前修復(fù)光復(fù)活：

最常見紫外線對DNA損傷：相鄰2個胸腺嘧啶形成二聚體。修復(fù)：在長波紫外線或短波可見光誘導(dǎo)下，光裂合酶可催化嘧啶二聚體進行單體化。在人類未得到充足證實?！斑m應(yīng)性”反應(yīng)

低劑量烷化劑可誘導(dǎo)一個專一蛋白質(zhì)（酶）合成，這種酶稱為烷基轉(zhuǎn)移酶或烷基受體蛋白?？蓪⒔Y(jié)合到堿基上（鳥嘌呤）烷基轉(zhuǎn)移到酶本身半光氨酸-SH基上，恢復(fù)嘌呤本身結(jié)構(gòu)。各種細胞中存在。24第24頁第24頁切除修復(fù)多環(huán)節(jié)修復(fù)過程。在各種酶作用下，將受損傷堿基或異常核苷酸切除。包括損傷部位辨認外切酶、內(nèi)切酶、連接酶等。能修復(fù)UV、加合等各種形式DNA損傷。2、復(fù)制過程中修復(fù)損傷保留至復(fù)制時修復(fù)，容易發(fā)生錯誤。有些損傷保留至復(fù)制時才得以修復(fù)。

3‘-5’外切核酸酶，含有校正讀碼功效，修復(fù)復(fù)制過程中錯誤。3、復(fù)制后修復(fù)（SOS修復(fù))

僅限于原核生物。25第25頁第25頁總之，任何DNA損傷，只要修復(fù)無誤，突變就不會發(fā)生；假如修復(fù)錯誤或未經(jīng)修復(fù)，損傷就得以固定(fixed)下來,于是發(fā)生突變。因此誘發(fā)突變是一個受控制過程，失控才真正發(fā)生突變。普通來說從DNA損傷到損傷固定需要幾次細胞分裂周期才干形成。26第26頁第26頁突變不良后果突變不良后果

體細胞突變生殖細胞突變癌變致畸衰老配子死亡死胎自發(fā)流產(chǎn)先天畸形四、突變不良后果27第27頁第27頁體細胞突變后果中最受注意是致癌問題，將在下一節(jié)敘述。另一方面，胚胎體細胞突變也許造成畸胎，當(dāng)然，畸胎發(fā)生還與親代生殖細胞突變相關(guān)。據(jù)報道人類妊娠最初3個月流產(chǎn)中有60%有染色體畸變，在一定程度上這是致突變物透過胎盤作用于胚胎體細胞所致，而不完全是親代生殖細胞突變后果。體細胞突變也也許與動脈粥樣硬化癥相關(guān)。由于對于正常動脈壁細胞中葡糖-6-磷酸脫氫酶有兩種變異體，而從動脈粥樣硬化癥同一斑塊取下細胞在電泳中只表現(xiàn)為同一個變異體，故認為動脈粥樣硬化斑塊是單克隆起源。體外培養(yǎng)人類非惡性轉(zhuǎn)化細胞，其壽命都有限。這些細胞在傳代過程中，細胞遺傳學(xué)異常率逐步增高，而有絲分裂逐步下降，因此能夠推測，體細胞突變是衰老起因，最低程度在體外如此。另外，DNA修復(fù)能力缺點與成熟早衰老綜合征也有一定關(guān)系。28第28頁第28頁二、生殖細胞突變后果假如突變發(fā)生在生殖細胞，無論其發(fā)生在任何階段，都存在對后代影響也許性，其影響后果可分為致死性和非致死性兩種。致死性影響也許是顯性致死和隱性致死。顯性致死即突變配子與正常配子結(jié)合后，在著床前或著床后早期胚胎死亡。隱性致死要純合子或半合子才干出現(xiàn)死亡效應(yīng)。假如生殖細胞突變?yōu)榉侵滤佬裕瑒t也許出現(xiàn)顯性或隱性遺傳病，包括先天性畸形。在遺傳性疾病頻率與種類增多時，突變基因及染色體損傷，將使基因庫負荷增長?；驇?genepool)是指一個物種群體中生殖細胞內(nèi)含有、并能傳給后代基因總和。遺傳負荷(geneticload)系一個物種群體中每一個體攜帶可遺傳給后代有害基因水平。29第29頁第29頁五、致突變性評價辦法檢測外來化學(xué)物致突變性普通通過致突變試驗來進行。其目的主要有兩點：①檢測外源化學(xué)物致突變性，預(yù)測其對哺乳動物和人致癌性；②檢測外源化學(xué)物對哺乳動物生殖細胞遺傳毒性，預(yù)測其對人體遺傳危害性。30第30頁第30頁1、慣用致突變試驗

(一)細菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)

鼠傷寒沙門氏菌原養(yǎng)型(his+)組氨酸營養(yǎng)缺點型突變株。(his-)正向突變回復(fù)突變代謝活化系統(tǒng)受試物觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法原理：利用一個突變微生物菌株與被檢測化學(xué)物接觸，使突變型微生物回復(fù)突變，重新成為野生型微生物。突變型微生物不具備合成組氨酸能力，不能在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上生長。31第31頁第31頁辦法：將突變型沙氏菌在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng),以其生長情況作為指標(biāo)。在培養(yǎng)基中加入哺乳動物肝細胞微粒體：提升靈敏度。

特點：長處：簡便、靈敏、快速（48h）、費用低；檢測結(jié)果與對動物致癌性相符率達約90%。

缺點：利用微生物作為供試物，不能全面反應(yīng)哺乳動物遺傳信息，僅1/6；微生物DNA修復(fù)系統(tǒng)與動物有差別；微生物無免疫功效。32第32頁第32頁（二）、哺乳動物體細胞突變試驗（1）辦法原理與微生物突變類似。

慣用細胞株：中國地鼠肺細胞V79

中國地鼠肺卵巢細胞(CHO）小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株。33第33頁第33頁V79、CHO細胞株正常細胞：缺乏利用嘌呤堿酶HGPRT，不能在加入類嘌呤堿類物質(zhì)培養(yǎng)基上生長；突變細胞：可在加入類嘌呤堿類物質(zhì)培養(yǎng)基上生長。L5178Y突變細胞株正常細胞：缺乏胸苷激酶（TK），不可在含有細胞毒物5-溴脫氧尿苷培養(yǎng)基上生長。突變細胞：可在此種培養(yǎng)基上生長。34第34頁第34頁(三)微核試驗

微核(Micronucleus)產(chǎn)生與染色體損傷相關(guān)，是染色體或染色單體無著絲點斷片或紡錘絲受損傷而丟失整個染色體，在細胞分裂后期遺留在細胞質(zhì)中，末期之后，單獨形成一個或幾種規(guī)則次核，包括在子細胞胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱微核。在細胞質(zhì)中微核起源有二：斷片或無著絲粒染色體在細胞分裂后期不能定向移動，而遺留在細胞質(zhì)中；有絲分裂毒物作用使個別染色體或帶苔絲粒染色體環(huán)和斷片在細胞分裂后期被留在細胞質(zhì)中。

微核試驗(Micronucleustest，MNT)是觀測受試物能否產(chǎn)生微核試驗。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。

觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法35第35頁第35頁觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法(三)微核試驗36第36頁第36頁MNNCE觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法37第37頁第37頁(四)染色體畸變分析

(五)姐妹染色單體互換試驗（SCE）

觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法38第38頁第38頁染色體畸變試驗：直接在顯微鏡下觀測染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變情況。生殖細胞或體細胞、體外或體內(nèi)試驗。體外：CHO細胞:分裂快、數(shù)目適中、形態(tài)清楚；人類外周血淋巴細胞體內(nèi)：受試動物骨髓細胞或其它（胸腺、脾、精原細胞）染色體畸變率改變。39第39頁第39頁試驗辦法：

a.體外培養(yǎng)：

CHO細胞或人類外周血淋巴細胞與化學(xué)物，在細胞培養(yǎng)液（DMEM,RPM,1640或1999）中，370C下培養(yǎng)24h(CHO)或72h(人類細胞）。觀測前2h加入秋水仙堿（中期分裂阻斷劑），制片，鏡檢觀測。

b.體內(nèi)染色體畸變分析：大鼠、小鼠，染毒飼養(yǎng)，觀測骨髓細胞染色體畸變情況。40第40頁第40頁二、慣用致突變試驗(五)果蠅伴性隱性致死試驗(六)顯性致死試驗(七)程序外DNA臺成試驗

(八)轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗(九)哺乳動物細胞基因突變試驗觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法41第41頁第41頁三、致突變試驗中一些問題

(一)陰性和陽性對照設(shè)置

1．陰性對照它是空白對照，即不加任何處理?；蛘呤侨軇φ?。陰性對照除了無處理原因外，與試驗組完全相同。其目的是取得試驗基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。比如，Ames試驗陰性對照可理解所用細菌自發(fā)回復(fù)突變率；證實除處理原因外無任何使回復(fù)突變率增長或減少原因。2．陽性對照是用某種已知能產(chǎn)生陽性反應(yīng)物質(zhì)作為對照。其目的是通過對陽性物質(zhì)試驗證實試驗辦法可靠；驗證試驗者在本試驗條件下，完畢技術(shù)和鑒定致突變物能力；證實經(jīng)一段時間后，本試驗重復(fù)性。比如，Ames試驗中陽性對照未出現(xiàn)陽性結(jié)果，應(yīng)考慮突變菌株也許發(fā)生問題，另一個也許是代謝活化能力不足。因此，當(dāng)陽性對照結(jié)果未呈陽性，其試驗組試驗數(shù)據(jù)可靠性亦大大減少。觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法42第42頁第42頁三、致突變試驗中一些問題(二)體外試驗活化系統(tǒng)1．哺乳動物細胞介導(dǎo)使用完整細胞，尤其是大鼠肝原代細胞，與測試細菌或細胞一起培養(yǎng)。這也是一個活化系統(tǒng)。它有完整細胞結(jié)構(gòu)和各種酶及內(nèi)源性輔助因子，代謝能力優(yōu)于無細胞系統(tǒng)如S9，但不如體內(nèi)活化系統(tǒng)。2．S9S9指經(jīng)酶誘導(dǎo)劑處理后制備肝勻漿，再經(jīng)9000g離心分離所得上清液，加上適當(dāng)緩沖液和輔助因子。它主要含有混合功效氧化酶(MFO)，是國內(nèi)常規(guī)應(yīng)用于體外致突變試驗代謝活化系統(tǒng)，其缺點是S9隨試驗動物種屬或器官不同而有差異；S9含有大量親核物質(zhì)有可能影響試驗敏感性。3．純化酶和基因工程應(yīng)用純化細胞色素P-450、谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶及過氧化物水解酶，可嚴格控制代謝產(chǎn)物誘發(fā)突變條件，但技術(shù)難度大。利用基因工程，將人細胞色素P-450基因，插入組合細胞內(nèi)，用上述細胞進行致突變試驗，使細胞含有代謝活化系統(tǒng)。觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法43第43頁第43頁三、致突變試驗中一些問題(三)致突變試驗與致癌試驗關(guān)系

①已知大多數(shù)化學(xué)致癌物含有致突變作用，遺傳學(xué)改變在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物誘致關(guān)鍵靶基因遺傳改變直接作用等在哺乳動物試驗中證實。②發(fā)覺人類接觸致癌物與DNA加合物，同其腫瘤中癌基因和抑癌基因特異堿基對突變之間含有相關(guān)性。③老式長期致癌試驗，花費大，周期長，不能適應(yīng)化學(xué)物質(zhì)快速增長需要。另外，致癌試驗所用動物數(shù)量有限，難以檢出弱致癌物。需要發(fā)展各種體內(nèi)和體外短期試驗，用于對化學(xué)物質(zhì)致癌性進行篩檢。觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法44第44頁第44頁三、致突變試驗中一些問題(四)試驗結(jié)果在毒理學(xué)安全性評價中作用

陰性結(jié)果鑒定條件：①最高劑量應(yīng)包括受試物溶解度許可或灌胃量許可最大劑量。如該劑量毒性很大，則體內(nèi)試驗和細菌試驗應(yīng)為最大耐受量。使用哺乳動物細胞進行體外試驗，常選LD50或LD80為最大劑量。溶解度大、毒性低化學(xué)物，在細菌試驗中能夠5000μg／皿作為最高劑量。②各劑量組組間差距不應(yīng)過大，以防漏檢僅在非常狹窄范圍內(nèi)才有突變能力一些化學(xué)毒物。滿足上述條件，仍為陰性，才謹慎下結(jié)論。觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法45第45頁第45頁三、致突變試驗中一些問題(四)試驗結(jié)果在毒理學(xué)安全性評價中作用陽性結(jié)果應(yīng)含有劑量—反應(yīng)關(guān)系，即隨劑量增加，致突變作用增加；和在一組或多組觀測值與陰性對照比較有顯著性差異。陽性結(jié)論，即表明受試物含有致突變性，而不同致突變試驗遺傳學(xué)終點不同，其所表示含義不一。如基因突變是含有造成遺傳性疾病突變，DNA修復(fù)實際后果尚不明確。觀測化學(xué)毒物致突變作用基本辦法46第46頁第46頁致突變試驗舉例美國EPA毒物處(1936)提出了一個三階段試驗方案，把遺傳毒性檢測和生殖細胞致突變性驗證分階段進行。第一階段測試化學(xué)物遺傳毒性，包括Ames試驗、體外哺乳動物細胞基因突變試驗、體內(nèi)骨髓染色體損傷試驗(微核試驗或染色體畸變試驗)；第二階段測試對生殖細胞致突變作用；第三階段為哺乳動物生