牛病毒性腹瀉-黏膜病的發(fā)病情況及現有診斷手段總結,畜牧獸醫(yī)論文牛病毒性腹瀉－黏膜病(BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒所致的一種廣為傳播的世界性傳染病，以消化道黏膜發(fā)炎、腐敗、壞死和腹瀉為主要特征。自1946年P．Olafson首先在紐約州腹瀉牛中發(fā)現并報道了牛病毒性腹瀉病以來，至今該病已呈世界性分布，大多數養(yǎng)牛國家都有流行。近年來，隨著我們國家畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，牛病毒性腹瀉－黏膜病在我們國家的流行情況日益擴大，已經嚴重阻礙了我們國家畜牧業(yè)的健康發(fā)展，經濟損失宏大。同時，該病在我們國家鹿養(yǎng)殖場流行廣泛，已成為鹿三大主要傳染病之一，牛病毒性腹瀉病毒是鹿頑固性腹瀉的主要病原。本文對牛病毒性腹瀉－黏膜病的流行現在狀況及現有診斷技術予以總結，以便為該病的防制研究提供理論基礎。1病原學牛病毒性腹瀉－黏膜病病毒(BVDV)，又稱黏膜病病毒(MDV)，屬于黃病毒科，與豬瘟病毒(CSFV)和羊邊界病病毒(BDV)同屬，它們除有共同的可溶性抗原、發(fā)生穿插反響外，還在基因構造和抗原性上有60%以上的同源性。該病毒為單股正鏈ＲNA，有感染性，且具有囊膜構造。BVDV根據其病變特性，可分為致細胞病變型(CP)和非致細胞病變型(NCP)兩種生物型。從1960年到如今，經過不斷探索，BVDV已經適應于牛腎傳代細胞系MDBK，多用于病毒的病變觀察、培養(yǎng)增殖、疫苗制備及診斷研究。2流行現在狀況1946年，P．Olafson首先在紐約州腹瀉牛中發(fā)現并報道了牛病毒性腹瀉病，隨后分離到該病毒。1953年，Ｒansey等發(fā)現了牛黏膜病。Gillespie等于1961年證實兩種病均為同一種病毒引起。1971年，由美國獸醫(yī)協(xié)會將該病統(tǒng)一命名為牛病毒性腹瀉－黏膜病。該病呈世界性分布，廣泛存在于七大洲養(yǎng)牛業(yè)較為發(fā)達的國家。國外學者Violeta等從19972001年間對立陶宛境內27個地區(qū)共147個畜群BVDV流行情況進行調查，結果顯示，呈陽性比率為11.9%～100%。Talafha等于2018年報道，約旦境內野生動物和人工飼養(yǎng)畜群血清陽性率分別為32%和81%，而加拿大境內不免疫動物和人工免疫畜群血清陽性率分別為28%和9%。由此可見，建立良好的防控機制對控制該病的發(fā)生和蔓延有一定作用。2008年，Ｒobert等從美國南部地區(qū)30個牛場采集4530份幼牛樣本，應用免疫組化試驗和ELISA法檢測，結果陽性率為0.55%(25頭)，且陽性動物只來源于華而不實5個牛場。1980年，我們國家從丹麥、加拿大、新西蘭、美國等十幾個國家引進血清、精液、種牛和奶牛，將本病帶入我們國家。由于控制不當，對牛、鹿、羊、豬、馬等均造成不同程度的感染，進而蔓延全國。1983年，李佑民等初次從流產胎牛的脾臟中分離到BVDV。2000年，杜銳等應用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELIAS)對吉林地區(qū)幼鹿BVDV感染進行了流行病學調查，結果顯示，該地區(qū)幼鹿感染率為60.0%～86.7%。2003年，虞蘊如等［17］通過對南京市初生犢牛進行血清學調查，結果顯示，該地區(qū)BVD－MD陽性率為25.96%。2004年，張光芒等采用微量細胞中和試驗和雙抗體夾心ELISA試劑盒分別對河南省規(guī)模化肉牛場和散養(yǎng)戶進行流行動態(tài)調查研究，結果顯示，BVD－MD檢測肉牛的抗體陽性率為21.0%，牛群的陽性帶毒率高者可達23.53%。2006年，趙月蘭等采用改良的雙抗體夾心ELISA試驗法對河北省奶牛場隨機采集直腸糞便進行血清學調查，結果顯示該地區(qū)不同年齡的奶牛均可感染BVD－MDV，最高陽性檢出率為81.4%，平均檢出率為40.9%。2007年，金愛華等對上海市奉賢區(qū)奶牛場隨機采血樣進行血清學調查，結果顯示，該區(qū)牛場中奶牛BVD抗體陽性率為34.06%。2018年，范仲鑫等對湖南規(guī)模奶牛場進行血清學調查，結果顯示，該地區(qū)BVD－MD陽性率達92.17%。2020年，王金濤等對黑龍江省規(guī)?；膛瞿膛ｋS機采集尾靜脈血樣進行血清學調查，結果顯示，在感染BVD－MDV的1434份血清中，陽性血清為23份，陽性率為1.6%。2020年，葉成玉等對青海天峻縣半野血牦牛隨機采集頸靜脈血進行流行病學調查，結果顯示，該地區(qū)BVD－MD血清陽性率為38.04%。2020年，康曉冬等采用雙抗原夾心酶聯免疫吸附試驗方式方法對寧夏奶牛養(yǎng)殖場進行血清學調查，結果顯示，該地區(qū)BVD－MD被檢牛場血清陽性率為30.77%，被檢奶牛血清陽性率平均為2.56%。高雙娣等采用微量中和試驗對陜西、甘肅、寧夏、青海和四川5個省(區(qū))部分地區(qū)的黃牛群、牦牛群進行血清學調查，結果顯示，黃牛群陽性檢出率為46.15%。由此可見，近年來，國內BVDV的感染情況日益擴大，對國內、國際社會均造成較大的經濟損失。3牛病毒性腹瀉－黏膜病病毒診斷3．1病毒分離和鑒定一般通過采取病畜的血液、口鼻分泌物以及脾和腸系膜淋逢迎，處理后接種于胎牛腎細胞、犢牛腎細胞、犢牛睪丸細胞等進行病毒的分離和鑒定，研究表示清楚，以犢牛睪丸細胞最敏感。王新平等、杜銳等分別從牛、幼鹿等易感動物中分離到病毒。但病毒分離、鑒定耗時太長，且只能檢測出致細胞病變型BVDV，故無法普及。3．2血清學診斷3．2．1中和試驗該法是進行牛病毒性腹瀉－黏膜病流行病學調查的有效手段，也是實驗室常用方式方法之一。通過每3～4周前后采血2次，將血清稀釋后進行試驗。假如第2次高于第1次4個滴度以上可判為陽性，2個滴度以上，視為疑似患病。但該方式方法檢測出的陰性?？赡苁敲庖吣褪芘＃蚨鴥H靠血清中和試驗檢測很難到達清群、完全監(jiān)控的目的。3．2．2免疫瓊脂擴散、該法簡便易行，在我們國家基層獸醫(yī)部門應用較普遍。通常選取潰爛或發(fā)炎組織周圍黏膜直接與BVDV陽性血清進行反響檢測抗原。同時可以取患病動物血清與標準陽性抗原進行抗體檢測，但敏感性低于中和試驗。陳茂盛等用該法檢測BVDV抗體，并與微量中和試驗進行比照分析，結果陽性率差異顯著。國外學者亦有一樣結論。免疫瓊脂擴散只具有群特異性，不具備株特異性，準確性不高，因而不能替代微量血清中和試驗。3．2．3蛋白A膠體金免疫電鏡技術電鏡觀察法快速簡便，可直接對病料或細胞培養(yǎng)物進行復染，觀察病毒粒子形態(tài)。但易遭到形態(tài)類似的病毒粒子干擾，導致特異性和敏感性較低，且病毒粒子本身難于觀察，需病毒數量在107個/mL以上。因而，僅用電鏡觀察鑒定較困難。而PAG－IEM技術電子密度高，可通過快速掃描網格，以較低倍數檢出病原。常國權等以蛋白A膠體金免疫電鏡技術(PAG－IEM)法、免疫電鏡吸附法(IEM)和直接負染色電鏡法(DEM)同時檢測疑似患病動物的糞便樣品。結果表示清楚，PAG－IEM方便快速，3～4h即可診斷結果，而且敏感性較IEM高300～500倍、DEM1000倍以上。本法對檢測經過挑選或疑似樣品內所含的病毒粒子快速、敏感且特異性好，但當前仍不適于大量樣品挑選。3．2．4免疫過氧化物酶技術(IPT)該方式方法診斷牛病毒性腹瀉－黏膜病準確可靠，當前被廣泛用于抗原的分布和抗體檢測。該法通過對單層細胞培養(yǎng)物進行檢測，使感染BVDV的細胞濃染，而未受BVDV感染細胞無色，其結果用肉眼或顯微鏡便可直接觀察。研究表示清楚，將單克隆抗體和生物素化抗鼠抗體－鏈酶親和素過氧化物酶檢測系統(tǒng)相結合，可提高其特異性。3．2．5免疫熒光技術(IFT)免疫熒光技術集免疫學的敏感性、特異性和顯微鏡的精到準確性于一身，可快速檢測感染細胞培養(yǎng)物和病變組織切片中的病毒粒子。Ｒebby等用NADL株感染MDBK單層細胞，對54份患病牛血清進行檢測，其結果與所建立間接ELISA檢測法一致。魏志強等用BVDV感染牛白細胞與血清進行熒光抗體檢測，結果顯示，白細胞和血清中的病毒消長情況差異不大。我們國家進出口檢疫條款規(guī)定，以熒光抗體同時對白細胞和血清進行監(jiān)測，兩者出現一種特異性熒光即為陽性。固然免疫熒光技術是一種可靠的實驗室診斷方式方法，但需要佐以熒光顯微鏡，并不適用于基層使用。3．2．6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)ELISA檢測法作為經典的血清學檢測方式方法，在國內外廣泛應用。該法即可檢測存在于各種病料中的BVDV，可以以檢測患病動物體內BVDV抗體水平，是診斷牛病毒性腹瀉－黏膜病的一種重要的常規(guī)手段。王新平等于1995年研制了用于檢測血清中和抗體的雙抗體夾心阻斷ELISA診斷試劑盒，其敏感性高出中和試驗5個滴度。Shammon等利用BVDV單克隆抗體建立了抗原捕獲ELISA檢測法，用于檢測BVDV抗原。此方式方法由Homer改進后與PCＲ方式方法比擬，結果表示清楚，ELISA法的敏感性低于PCＲ法。張光芒同樣以單克隆抗體建立了雙抗夾心ELISA法，其檢測結果與中和試驗和病毒分離試驗符合率分別為93.3%和86.7%。固然此法簡單快速，且特異性良好，但鑒于制備特異性抗原困難，并且假陽性、陰性等問題的存在，使本方式方法在實際應用上遭到限制。3．3BVDV的分子生物學檢測技術3．3．1核酸擴增技術隨著分子生物學檢測技術被應用于牛病毒性腹瀉－黏膜病的診斷，核酸擴增技術當前已成為應用較廣泛的實驗室診斷方式方法。應用于牛病毒性腹瀉診斷中的主要有環(huán)介導體外等溫擴增(LAMP)技術，實時熒光定量(Taq-Man)ＲT－PCＲ、套式ＲT－PCＲ、一步法ＲT－PCＲ、二重ＲT－PCＲ等。該技術能從分子水平上簡單快速，敏感特異地檢測出樣品中BVDV的ＲNA，并且能夠區(qū)分不同基因型的BVDV毒株以及與BVDV在基因組成、傳播途徑、檢測方式方法等方面類似的其他病原體，如豬瘟病毒(CSFV)、羊邊界病毒(BDV)、水泡性口炎病毒(VSV)等。范晴等根據BVDV5UTＲ的保守區(qū)設計LAMP特異性引物，建立了恒溫(63.5℃)、快速(65min)的檢測方式方法，該方式方法可檢測到的陽性質粒臨界值為1個拷貝，可根據渾濁度或染料的輔助直接斷定結果。郭銳等根據BVDV的保守序列，設計特異性PCＲ引物和1條TaqMan熒光探針，建立了實時熒光定量PCＲ檢測方式方法，該方式方法檢測靈敏度為103拷貝/L，重復性好，定量線性范圍為1.0(103～108)拷貝/L。王克偉等根據針對BVDV5UTＲ和豬繁衍與呼吸綜合征病毒(PＲＲSV)N蛋白的基因序列所設計的特異性引物，建立了BVDV和PＲＲSV雙重ＲT－PCＲ的檢測方式方法。該方式方法特異性強，敏感性高，對于PＲＲSV和BVDV的cDNA最低檢測量分別為3.810－4ng和710－4ng。用該方式方法對臨床樣本進行檢測，結果與PＲＲSV和BVDV單一ＲT－PCＲ的檢測結果符合率分別為89.3%和92%。PCＲ技術診斷BVDV具有簡便、快速、敏感性高和特異性強等優(yōu)點，只是基因擴增所需的儀器和試劑價格昂貴，當前還不能廣泛應用于生產實踐。3．3．2核酸探針雜交技術核酸探針雜交技術是20世紀80年代興起的一類分子生物學技術，與傳統(tǒng)的檢測方式方法相比，核酸探針雜交技術應用廣泛，敏感性高，特異性強。早期的放射性同位素(如32P、35P)標記探針，其具有放射性危害、不穩(wěn)定等缺點。后來發(fā)明的生物素標記的DNA探針固然不具有放射性危害，但其特異性和敏感性有時均不如放射性同位素標記探針。當前，應用較多的是地高辛標記核酸探針，它不僅不具有放射性，而且與放射性同位素標記探針一樣，高度敏感特異。Jimmy等用NADL株的4種不同基因片段(P80、P54、gP62、gP53)作為雜交探針，通過斑點免疫印跡方式方法檢測出BVDV的24個細胞病變株和37個非細胞病變株，華而不實在檢測致細胞病變株時P80和P54的雜交率可達90%以上。4小結牛病