余甘子葉提取成分沒食子酸的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究

作者：鐘振國，梁紅，鐘益寧，張雯艷，

潘志海，盧紅梅，韋小清，黃金蘭，李鵬【摘要】

目的探討從余甘子葉提取分離得到的活性成分沒食子酸的抗腫瘤作用。方法采用MTT法和細(xì)胞集落形成法觀察沒食子酸對人肝癌細(xì)胞株Bele7404、人胃癌細(xì)胞株SGC7901、小鼠肝癌細(xì)胞株H22和小鼠肉瘤細(xì)胞株S1804種腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用。結(jié)果MTT法和細(xì)胞集落形成法測定的結(jié)果均顯示，當(dāng)沒食子酸濃度在2.5μg/ml以上時(shí)，4種腫瘤細(xì)胞株的生長均受到明顯抑制。結(jié)論余甘子葉提取成分沒食子酸在體外對不同組織來源的腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】

余甘子葉提取物沒食子酸MTT法細(xì)胞集落形成法體外抗腫瘤作用Abstract：ObjectiveToisolatetheanti-tumoractivitycomponentsforgallicacidfromtheethanolextractoftheethylacetatefractionsoftheleavesofPhyllanthusemblicaL.MethodsThegrowthinhibitionwasanalyzedbyMTTandcellcolonymeasurementtechniqueinthehepatocellularcarcinomaBele7404,stomachcarcinomaSGC7901,hepatomaH22andfibrosarcomaS180cellslineinvitro.ResultsMTTassayandcellcolonymeasurementtechniquewereindicated,thegrowthoffourtumorcellswereobviouslyinhibitedwhengallicacidconcentrationwasat2.5μg/mlandabove.ConclusionTheresultssuggestthatgallicacidiscytotoxictothevarietyofthecancercells.Keywords：ExtractfromleavesofPhyllanthusemblicaL.；

Gallicacid;

MTT;

Cellcolonymeasurementtechnique;

Anti-cancereffectinvitro

余甘子葉PhyllanthusemblicaL.系大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬Phyllanthus落葉小喬木或灌木的葉。余甘子樹在我國主要分布在福建、廣東、云南、貴州、四川、海南、廣西等省區(qū)，資源豐富。《本草綱目》中記載:余甘子性涼,味甘酸澀,具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效,民間常用來治療消化不良、腹瀉、咳嗽、乙型肝炎、腹水、便秘、腫瘤、發(fā)熱、皮膚病、高血壓、膽囊炎及癌癥等疾?。?］。余甘子葉在民間應(yīng)用也較廣泛，但有關(guān)余甘子葉的藥理研究報(bào)道非常少。沒食子酸是從余甘子葉提取分離出的兩個(gè)化合物之一。為了了解沒食子酸是否具有抗腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)將沒食子酸在體外進(jìn)行了抗癌活性研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。1

材料與儀器1.1

藥物野生余甘子葉采自廣西中部地區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院劉壽養(yǎng)教授鑒定。從余甘子葉提取分離得到化合物沒食子酸。1.2

腫瘤細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株SGC7901、人肝癌細(xì)胞株Bele7404均購自上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫；小鼠肝癌細(xì)胞株H22和小鼠肉瘤細(xì)胞株S180均購自廣西中醫(yī)藥研究所。1.3

試劑MTT（四甲基噻唑藍(lán)）為德國Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)：020609；FBS（胎牛血清）為美國Hyclone公司產(chǎn)品，批號(hào)：0407；RPMI1640培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品，批號(hào)：1120708；Trypisn(胰蛋白酶)購自天津市景洋生物制品有限責(zé)任公司，批號(hào)：200503；DMSO（二甲基亞砜）購自天津匯英化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20030526；Wright,sstain（瑞氏染色素）購自上海三愛思試劑有限公司，批號(hào)：20011026；Giemsa,sstain（吉氏染色素）購自上海試劑三廠，批號(hào)：20000324；卡那霉素，德國Sigma公司分裝；L-谷氨酰胺，Amresco分裝。1.4

儀器CO2培養(yǎng)箱（ThermoForma），美國產(chǎn)，型號(hào)：381；倒置顯微鏡（Olympus），日本產(chǎn)，型號(hào)：CK40；酶標(biāo)儀（Biocell），澳地利產(chǎn)，型號(hào)：Sunrise；96孔板，丹麥產(chǎn)，型號(hào)：3072；低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭儀器廠，型號(hào)：TDL-5；層析柱:各種不同規(guī)格口徑的普通玻璃柱。2

方法2.1

RPM1640完全培養(yǎng)液的配置RPMI1640完全培養(yǎng)液含3%谷氨酰胺、卡那霉素750μg/ml、10%或15%FBS。2.2

MTT法測定［2］在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200μl（含有5000個(gè)/ml腫瘤細(xì)胞）10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，置37℃，10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后（H22、S180離心處理），棄去舊培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組分別加入新的培養(yǎng)液190μl/孔，然后加入不同濃度沒食子酸10μl/孔，使終濃度分別為1.25，2.5，5，10，20，40，80μg/ml,對照孔則加入200μl/孔新的培養(yǎng)液。每組4平行孔,置37℃,10%CO2培養(yǎng)液培養(yǎng)4d后，棄去上清液，加入200μl/孔新鮮配置的含0.2mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后棄上清液，加入200μl/孔DMSO，振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀（波長為570nm，參比波長為450nm）測定OD值，按下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對照組平均OD值）×100%［3］。2.3

集落形成法［4］取對數(shù)生長期的SGC7901和Bele7404腫瘤細(xì)胞株，用胰蛋白酶消化成分散細(xì)胞懸液，用10%FBSRPMI1640培養(yǎng)液配成含500個(gè)/ml細(xì)胞懸液，取35mm培養(yǎng)皿，4個(gè)為一組，陰性對照組每皿加2ml細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)組加入沒食子酸100μl，加入稀釋后的細(xì)胞懸液2ml，使沒食子酸終濃度為20μg/ml，搖勻后置37℃10%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，棄去培養(yǎng)液，先用瑞氏染液染色5min，然后用Giemsa's溶液與Sorensen磷酸緩沖液以1∶9配成沖洗液，染色10min。流水沖洗、晾干，在20×的顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的集落，重復(fù)4次。其中H22，S180用半固體軟瓊脂集落培養(yǎng)法，取對數(shù)生長期的H22和S180腫瘤細(xì)胞株,用15%FBSRPMI1640培養(yǎng)液配成含1000個(gè)/ml細(xì)胞懸液，置37℃預(yù)溫。取35mm培養(yǎng)皿，4個(gè)為一組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為20μg/ml的沒食子酸100μl，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，取在沸水中融化的5%瓊脂液1份，加入到9份37℃含15%FBSRPMI1640培養(yǎng)液中，搖勻后迅速加入到培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿1ml，混勻后，置室溫使瓊脂凝固。取預(yù)溫的細(xì)胞懸液按每9.4ml加5%的瓊脂液0.6ml的比例混勻，加到已鋪底層瓊脂的培養(yǎng)皿中，每皿1ml,置室溫使瓊脂凝固。蓋上培養(yǎng)皿蓋，置37℃10%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，在16×的顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75μm（50個(gè)細(xì)胞以上）的集落。按下式計(jì)算集落抑制率：

集落抑制率（%）=（1-克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)）×100%［5］。2.4

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。3

結(jié)果3.1

MTT法測定沒食子酸對4種腫瘤細(xì)胞株生長的抑制結(jié)果見表1～4。表1

沒食子酸對Bele7404腫瘤細(xì)胞的抑制作用（略）與對照組比較，*p<0.01；n=4表2

沒食子酸對SGC7901腫瘤細(xì)胞的抑制作用（略）與對照組比較，*P<0.01；n=4表3

沒食子酸對S180腫瘤細(xì)胞的抑制作用（略）與對照組比較，*P<0.01；n=4表4

沒食子酸對H22腫瘤細(xì)胞的抑制作用（略）與對照組比較，*P<0.01;n=4

結(jié)果顯示，沒食子酸對SGC7901、Bele7404、H22、S180這4種腫瘤細(xì)胞株有一定的抑制作用，并與濃度呈正相關(guān)作用。3.2

集落形成法觀察沒食子酸對4種腫瘤細(xì)胞株抑制作用結(jié)果見表5～8。表5

沒食子酸在濃度為（略）與陰性對照組比較，*P<0.01；n=4表6

沒食子酸在濃度為（略）與陰性對照組比較，*P<0.01；n=4表7

沒食子酸和沒食子酸乙酯在濃度為（略）與陰性對照組比較，*P<0.01；n=4表8

沒食子酸和沒食子酸乙酯在濃度為（略）與陰性對照組比較，*P<0.01；n=4

集落形成法的結(jié)果顯示,沒食子酸對SGC7901、Bele7404、H22、S180這4種腫瘤細(xì)胞株的集落形成也有抑制作用。4

討論

本實(shí)驗(yàn)通過采用兩種不同的實(shí)驗(yàn)方法，研究余甘子葉提取物沒食子酸在體外抗腫瘤作用。MTT法和集落形成法的結(jié)果相吻合，顯示提取物對4類腫瘤細(xì)胞株生長均有抑制作用，其抑制率隨著藥物濃度增加而相應(yīng)增高。提示余甘子葉提取物沒食子酸在體外對腫瘤細(xì)胞生長具有抑制作用。

MTT法、集落形成法是觀察體外抗腫瘤活性的常用方法，尤其MTT法快速簡便，常作為抗腫瘤藥的體外初篩試驗(yàn)，本研究采用兩種實(shí)驗(yàn)方法的聯(lián)合應(yīng)用增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

對惡性腫瘤目前尚無十分理想的治療藥物。近年來，從天然植物中尋找新的抗腫瘤藥物已成為新藥研究的主要發(fā)展方向之一，中醫(yī)藥在腫瘤治療中的地位和綜合優(yōu)勢愈顯重要［6］。本研究從余甘子葉提取物中分離的沒食子酸在體外實(shí)驗(yàn)均具有抗腫瘤作用，但其體內(nèi)是否具有抑瘤作用尚需進(jìn)一步深入研究。【參考文獻(xiàn)】

［1］國家藥典委員會(huì).中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：142.［2］鐘振國，張雯艷.中越獼猴桃根提取物的體外抗腫瘤活性研究［J］.中藥材，2