鎘對大鼠前列腺損傷及鋅保護的超微結構與

硫胺素焦磷酸酶細胞化學的研究

【摘要】目的研究鎘對大鼠前列腺腹側葉的超微結構影響及鋅保護作用。方法小劑量氯化鎘(2mg/kg體重)及鋅腹腔內注射后用透射電鏡觀察及硫胺素焦磷酸酶(TPPase)電鏡細胞化學定量分析。結果鎘注射后4h，前列腺上皮主細胞出現輕微的超微結構改變，3～7d呈明顯退變，15d退變減輕，出現粗面內質網(RER)形成的同心圓性小體，30～60d基本恢復正常。鎘注射后4h，TPPase反應產物較正常組減少，3d和15d進一步減少。鋅保護組較相應的單純鎘組的超微結構損傷輕，且TPPase反應產物也較多。結論鎘對大鼠前列腺腹側葉上皮主細胞早期直接損傷較輕，所致TPPase反應產物減少明顯。鋅對鎘所致主細胞超微結構損傷及TPPase活性降低均有保護作用。

【關鍵詞】前列腺；超微結構；硫胺素焦磷酸酶(TPPase)；鎘；鋅；大鼠

【中分類號】R994.6【文獻標識碼】A【文章編號】0529-1356(2000)04-368THEINJURIOUSEFFECTSOFCADMIUMANDPROTECTION

OFZINCONULTRASTRUCTUREANDCYTOCHEMISTRYOF

TPPaseOFPROSTATEINRATLUOZi-guoLIWei-xin

（LaboratoryofElectronMicroscopy,ChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400016,China）【Abstract】ObjectiveTostudytheultrastructuraleffectsofcadmium(Cd)andprotectionofzinc(Zn)onventralprostateinrat.MethodsTheratswereintraperitoneallyinjectedwithCdCl2(2mg/kgbodyweight)andCd+Zn.ThespecimenswereinvestigatedbytransmissionelectronmicroscopeandquantitativeanalysisofthechangesofthecytochemicalreactiveproductofTPPase.ResultsMildultrastructuralalterationsofprincipalcellsofprostateweredetectedafter4hoursofCdtreatment.Thechangesbecamemostprominentwithin3-7days,buttendedtoalleviateafter15days.After30-60days,thecellshadrecoveredalmosttonormal.TPPasereactiveproductofprincipalcellsdecreased4hoursafterCdtreatmentandbecamefurtherreducedafter3and15days.TheprotectiveeffectsofZnonCd-inducedinjuriesandTPPasereactivityofprincipalcellswerepronounced.ConclusionTheearlydirectedinjuriouseffectsofCdontheultrastructureandTPPaseactivityinprincipalcellsofventralprostateinratweremilder.Znhadobviousprotectiveeffectsontheinjuriesbycadmium.

【Keywords】Ventralprostate;Ultrastructure;TPPase;Cadmium;Zinc;Rat前列腺是雄性生殖系統(tǒng)的重要附屬性腺，其分泌物占精液成分的30%，同時可分泌多種活性物質。它的正常結構和功能依賴雄激素的作用，閹割大鼠后前列腺體積明顯變小，上皮萎縮［1］。鎘可致多器官損害，半衰期很長，對人的生殖功能具有潛在的危害性［2］。鎘在電池、電鍍及半導體工業(yè)中應用廣泛，對其毒害作用的研究受到了多學科的重視。我們曾報道小劑量氯化鎘(2mg/kg體重)可致大鼠睪丸、附睪、精囊腺和輸精管出現超微結構的明顯損傷，雄激素水平下降，鋅對鎘所致?lián)p傷有保護作用［3～6］。有關鎘對前列腺的影響，文獻報道多集中在通過飲水給藥或注射后長期所致的慢性損傷。對正常人及前列腺增生和前列腺癌患者的前列腺組織與血漿中鎘、鋅濃度的關系也有報道［7～9］。但有關鎘對前列腺早期損傷及鋅保護作用尚未見報道。本研究通過超微結構觀察及高爾基復合體標志酶TPPase電鏡細胞化學定量分析，探討小劑量氯化鎘對大鼠前列腺腹側葉上皮主細胞的影響和鋅的保護作用及其機理。材料和方法1.動物分組、取材及電鏡樣品制備

健康成年雄性Wistar大鼠51只，體重195～240g，分單純鎘組、鎘加鋅組和對照組，其中單純鎘組32只，鎘加鋅組8只，對照組11只。單純鎘組按2mg/kg體重劑量，一次腹腔內注射0.1%氯化鎘(生理鹽水配制)，分別于4h、1、3、7、15、30及60d取材。鎘加鋅組分3次注射，先注射1%醋酸鋅15mg/kg體重，2h后注射氯化鎘2mg/kg體重和醋酸鋅50mg/kg體重，再間隔2h注射醋酸鋅15mg/kg體重，醋酸鋅總劑量為80mg/kg體重，分別于3d和15d后取材，對照組腹腔內注射等體積的生理鹽水。氯化鎘、醋酸鋅的注射劑量及方法參照Saksena［10］等的報道。

切取大鼠前列腺腹側葉左葉小塊組織，用磷酸鹽緩沖液配制的4%戊二醛及1%四氧化鋨作預固定和后固定(pH7.2～7.4)，酒精及丙酮逐級脫水，作半薄切片經1%次甲基藍-天青Ⅱ染色后，光鏡下定位腺泡，再制備超薄切片。用醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色，H-600型透射電鏡觀察。

2.TPPase電鏡細胞化學樣品制備

取單純鎘注射后4h、3d、15d及鎘加鋅3d、15d和對照組共6組動物前列腺腹側葉右葉小塊組織，經提純的2.5%戊二醛固定1h，再制備厚約100μm的薄片，置入孵育液(主要含硫胺素焦磷酸、氯化錳、硝酸鉛等)37℃孵育90min。對照孵育液去底物硫胺素焦磷酸。孵育后用Tris-Maleate緩沖液漂洗30min(pH7.2)，轉入磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)，經1%四氧化鋨后固定1h，再轉入常規(guī)電鏡樣品制備，但超薄切片不經枸櫞酸鉛染色。

3.主細胞TPPase電鏡細胞化學定量分析

透射電鏡下恒定放大25000倍，每組隨機拍攝上皮不同主細胞核上區(qū)胞質高爾基復合體區(qū)10張，共60張照片。運用CM-2000生物醫(yī)學像分析系統(tǒng)對照片TPPase反應產物總面積與背景面積之比(TA/BA)進行測量。所有測量數據均以平均值±標準差(<"0102(45字節(jié))"src="/med/cano/201003/20100308191825529"59>±s)表示，采用方差分析，并作多組比較。SPSS8.0軟件運算，微機自動處理結果。結果1.大鼠前列腺腹側葉正常超微結構

正常大鼠前列腺腹側葉上皮屬假復層柱狀上皮，由主細胞和基細胞組成。主細胞胞質在電鏡下可分為頂區(qū)、高爾基區(qū)、核周區(qū)和基底區(qū)。頂部微絨毛(MV)長短不等，部分主細胞頂區(qū)可見含有中等或低電子密度的分泌顆粒及有衣小泡。高爾基區(qū)具有多個高爾基復合體，高爾基復合體含有典型的扁平囊泡、運輸小泡及不同電子密度的分泌泡。高爾基區(qū)胞質內，還具有少量多泡小體及一些溶酶體。核周區(qū)含有大量平行排列的粗面內質網(RER)，其腔內含有低電子密度的絮狀物質。基底部有散在的RER和線粒體。核位于細胞的基底部，呈圓形或橢圓形，異染色質較少，核仁明顯(1)。

2.鎘對前列腺腹側葉主細胞損傷的超微結構改變

鎘注射后4h即見大部分主細胞的部分線粒體有內室腫脹，其中一些線粒體還有髓樣結構改變。此外，在部分主細胞側壁質膜也見有髓樣結構，但RER基本正常(2)。鎘注射24h后，主細胞的上述改變加重，表現為有較多線粒體內室腫脹，髓樣結構數量增多，且見部分主細胞的高爾基復合體扁平囊泡明顯擴大，排列紊亂。3～7d階段，上皮主細胞線粒體廣泛腫脹伴空泡化，高爾基復合體扁平囊泡的擴張更加嚴重，甚至有少數主細胞高爾基復合體的扁平囊泡膜破裂，融合成多個不規(guī)則的大空泡。部分主細胞核異染色質邊集，但RER基本正常(3)。15d組，大多數主細胞的高爾基復合體扁平囊泡僅有輕度擴張，但其腔內充滿低電子密度的絮狀物質，而分泌顆粒極少見，提示其排泌功能受阻。溶酶體數量普遍增多，微絨毛稀少且短(4)。30d組，高爾基復合體數量較少，但形態(tài)基本正常，溶酶體數量更加增多，且部分主細胞內RER形成同心圓小體及出現池內封隔(5)。鎘注射后60d，上皮大部分主細胞超微結構基本恢復正常，少數主細胞線粒體仍有輕度腫脹及有較多髓樣結構，RER及分泌顆粒也較正常明顯減少。

3.鋅對鎘所致大鼠前列腺腹側葉上皮主細胞損傷的保護

鎘鋅聯(lián)合注射后3d，上皮主細胞退變較單純鎘組輕，僅見部分線粒體內室腫脹及少量的髓樣結構，高爾基復合體扁平囊泡輕度擴張，RER無明顯改變(6)。鎘鋅聯(lián)合注射后15d，與相應單純鎘組比較，其保護作用最為明顯。表現為線粒體和高爾基復合體形態(tài)普遍基本正常，仍有部分RER腔擴張，腔內有大量低電子密度的物質蓄積，溶酶體也較單純鎘組少。細胞表面微絨毛減少，可見一些分泌顆粒(7)。

4.前列腺腹側葉主細胞TPPase酶學像分析結果

正常大鼠前列腺腹側葉上皮主細胞高爾基復合體發(fā)達，TPPase反應產物呈高電子密度顆粒狀，分布于高爾基復合體成熟面的扁平囊泡，其數量較多(8)。在其他細胞器及胞質中呈陰性。

鎘注射后4h，高爾基復合體扁平囊泡內TPPase反應產物分布較松散且顆粒較大，數量減少。3d和15d組TPPase反應產物顆粒小而分散，數量進一步減少(9，10)。鋅保護3d組TPPase反應產物數量與相應單純鎘組無明顯差別(11)，而鋅保護15d組TPPase反應產物則較相應單純鎘組有明顯增多(12)。

像分析結果經統(tǒng)計學處理表明，鎘注射后4h及3、15d酶反應產物與背景面積之比(TA/BA)與對照組比較有顯著差異(P<0.05)，3組之間均有顯著性差異(P<0.05)，且呈遞減趨勢。鋅保護3d組與對照組(TA/BA)之間有顯著性差異(P<0.05)，與單純鎘3d組之間無顯著性差異(TA/BA)，而鋅保護15d組與對照組(TA/BA)之間無顯著性差異(P>0.05)，與單純鎘15d組(TA/BA)比則有顯著性差異(P<0.05)。結果見附表。附表硫胺素焦磷酸酶(TPPase)超微酶學定量分析TA/BA(<"0102(45字節(jié))"src="/med/cano/201003/20100308191825529"59>±s)

TableImageanalysisofultrastructurallocalizationofTPPasereactiveproductTA/BA(<"0102(45字節(jié))"src="/med/cano/201003/20100308191825529"59>±s)給藥后時間(timeoftreatment)組別(group)4小時(4h)3日(3d)15日(15d)鎘(Cd)0.01082±0.0008207a,b0.0070±0.0008470a,c,d0.005059±0.0006067a,b,c鎘+鋅(Cd+Zn)0.007646±0.001030a,c,d0.01782±0.002480b,c,d對照(control)0.01846±0.002280

注：a.與對照組比較P<0.05；b.與單純鎘3d組及Cd+Zn3d組比較P<0.05；c.與單純鎘4h比較P<0.05；d.與單純鎘15d組比較P<0.5；Notes:a,comparedwithcontrol,P<0.05;b,comparedwith3dafterCdand3dafterCd+Zn,P<0.05;c,comparedwith4hafterCd;P<0.05;d,comparedwith15dafterCd討論大鼠前列腺腹側葉上皮主細胞呈高柱狀，具有旺盛的合成及分泌蛋白質的超微結構基礎，表現為主細胞內有豐富的RER和發(fā)達的高爾基復合體。本研究重點觀察了鎘對大鼠前列腺這些結構的超微結構損傷和定位于高爾基復合體的TPPase活性影響，以及鋅的保護作用。Fowler［2］等報道，小劑量CdCl2(2mg/kg體重)腹腔內注射只能選擇性損傷大鼠睪丸而不引起其他器官改變。李維信［3～6］等的研究則認為該劑量的CdCl2不僅損傷睪丸，而且可致附睪、精囊腺及輸精管超微結構損傷及AlPase、TPPase和G-6-Pase活性降低。Hoffmann［9］等報道用較大劑量的CdCl2(4.5mg/kg～10.05mg/kg體重)腹腔內多次注射后170～240d，可致大鼠前列腺上皮主細胞出現不典型增生。Battersby［7］等研究結果表明含5ppmCdCl2飲水喂養(yǎng)20周后，大鼠前列腺腹側葉上皮無明顯超微結構改變，而含50ppmCdCl2飲水52周后，見主細胞出現不典型增生，但未見癌細胞。本研究結果表明：鎘注射后4h，大鼠前列腺腹側葉主細胞已出現線粒體腫脹和髓樣結構，24h后改變加重，3～7d損傷最明顯，主要表現為線粒體腫脹，高爾基復合體扁平囊泡擴張，排列紊亂。15d以后退變有所減輕。60d后主細胞基本恢復正常，但部分主細胞的線粒體仍有輕度腫脹。

本研究所見鎘所致前列腺上皮主細胞的早期損傷系腫脹溶解性的病理改變，與我們在睪丸、附睪、精囊腺及輸精管所見的改變相似，說明鎘對前列腺主細胞也有直接損傷作用。鎘損傷機理與脂質過氧化作用有關，它可能通過抑制超氧化物岐化酶(SOD)活性，使活性中間氧水平升高，間接誘發(fā)細胞膜脂質過氧化，而致膜通透性增高。也有人認為游離的鎘離子能抑制定位于膜上的磷脂合成酶系，最終使膜的類脂構成發(fā)生改變而致細胞損傷［5］。本研究結果見大鼠前列腺主細胞早期的損傷以線粒體及高爾基復合體為主，而RER的改變很輕，這與我們在附睪及精囊腺所見有不同，其原因尚待進一步研究。15d以后主細胞出現RER排成的同心圓小體及池內封隔現象，以及溶酶體數量增多，可能與鎘能損傷睪丸間質細胞而致雄激素水平下降有關［4］。文獻報道大鼠閹割后4h，可見前列腺腹側葉主細胞的RER呈同心圓狀排列和自噬體形成，溶酶體數量增多［1，11］。對RER的同心圓小體出現原因有不同的觀點，有人認為這是一種細胞退行性改變，也有人認為是增生性變化。一般認為池內封隔是含RER豐富的細胞處理過剩RER或細胞萎縮的表現，而上述兩者皆與自噬體形成有關［12］。

TPPase是高爾基復合體的標志酶，與高爾基復合體內糖基化過程中的糖基轉移酶活性有密切關系，它定位于成熟面扁平囊泡，系細胞合成分泌功能狀態(tài)的重要標記。鎘注射后4h，TPPase反應產物明顯減少，3d和15d進一步減少。4h和3d組TPPase反應產物減少與鎘對主細胞的直接損傷所致腫脹溶解性改變有關［3～6］。此外該酶反應產物的減少還先于超微結構的改變，這也提示鎘具有直接損傷作用。豚鼠閹割后6周前列腺背側葉及精囊腺主細胞高爾基復合體的TPPase反應產物才有減少，說明雄激素水平下降所致的損傷出現較晚［4］。陶均等［13］用Tamoxifen(100mg/kg體重)喂養(yǎng)大鼠5d后見前列腺腹側葉主細胞TPPase反應產物減少。本研究所見鎘注射后15d出現的TPPase反應產物明顯減少，提示與鎘致睪丸間質細胞損傷所引起的血清睪酮濃度下降的進一步加重損傷有關。

鋅是維持哺乳動物生殖器官功能不可缺少的微量元素。我們曾報道鋅對鎘所致大鼠睪丸、附睪及輸精管損傷皆有良好的保護作用［3，5，6］。正常人血漿鋅鎘濃度的比值僅為前列腺組織的1/3，在前列腺疾病(前列腺增生及前列腺癌)狀態(tài)下，這一比值明顯變大［8］，說明鋅對維持前列腺的正常功能具有重要的作用。本研究結果表明，鋅對鎘所致前列腺主細胞的超微結構損傷及TPPase活性均有明顯的保護作用。其機理可能與通過誘導金屬硫蛋白(MT)的產生，以更多的Cd-MT結合形式貯存在胞質內，以及鋅能直接與鎘競爭主要大分子上的高親和位點，從而減少鎘的直接損傷作用有關。本研究15d鋅保護組TPPase反應產物的明顯增多，可能與鋅對鎘所致睪丸間質細胞損傷所具有的保護作用，促使前列腺主細胞退變減輕有關。本文1～12見插第17，18頁

1正常大鼠前列腺腹側葉主細胞，可見細胞核(N)、粗面內質網(RER)、高爾基區(qū)(↑↑)、線粒體(▲)、分泌顆粒(↑)、腺腔(Lu)×5000

Fig.1Principalcellsofventralprostatefromnormalrat.N,nuclei;RER,roughendoplasmicreticulum;Goljiregion(↑↑);Mitochdria(▲);secretorygranule(↑);Lu,lumen.×5000

2鎘注射后4h，細胞核(N)正常，線粒體內可見髓樣結構(My)×10000

Fig.24hafterCdtreatment,N,nuclei;My,mylinfigureinMitochondriaandplasmamembrane.×10000

3鎘注射后3d，高爾基復合體(Go)擴張，線粒體(Mi)腫脹，并有髓樣結構。粗面內質網基本正?！?0000

Fig.3DilationofGoljicomplex(Go)andswellingofmitochondria(Mi)ofprincipalcellfrom3daysafterCdtreatment.×10000

4鎘注射后15d，高爾基復合體輕度擴張，溶酶體(Ly)、粗面內質網基本正?！?000

Fig.4MilderdilationofGoljicomplex(Go);Iysosome(Ly)ofprincipalcellfrom15daysafterCdtreatment.×10000

5鎘注射后30d，主細胞粗面內質網形成的內同心圓性小體，其內有溶酶體和腫脹的線粒體(Mi)，并可見池內封隔(▲)×20000

Fig.5ConcentriclamellarbodyofRERfrom30daysafterCdtreatment.Mi,mitochondria;Ly,lysosome;▲,IntracisternalsequestrationofRER×20000

6鎘鋅聯(lián)合注射后3d，主細胞線粒體腫脹，細胞核、高爾基復合體輕度擴張，Lu.腺腔×10000

Fig.6Swellingofmitochondria(Mi),N,nuclei;andmilderdilationofGoljicomplex(Go);lumen(Lu)of3daysCd+Zntreatment.×10000

7鎘鋅聯(lián)合注射后15d,主細胞基本正常?！?000

Fig.7Principalcellsalmostnormalof15daysVd+Zntreatment.×8000

8正常大鼠前列腺主細胞高爾基復合體TPPase反應產物多?！?5000

Fig.8TPPasereactiveproductofGoinprincipalcellfromprostateofnormalrat.×25000

9鎘注射后3d,主細胞高爾基復合體TPPase反應產物?！?5000

Fig.9TPPasereactiveproductofGoinprincipalcellfromprostate3daysafterCdtreatment.×25000

10鎘注射后15d，主細胞高爾基復合體TPPase反應產物。×25000

Fig.10TPPasereactiveproductofGoinprincipalcellfromprostate15daysafterCdtreatment.×25000

11鎘鋅聯(lián)合體注射后3d，主細胞高爾基復合體TPPase反應產物。×25000

Fig.11TPPaseteactiveproductofGoprincipalcellfromprostate3daysafterCdaddZntreatnent.×25000

12鎘鋅聯(lián)合注射后15d，主細胞高爾基復合體TPPase反應產物。×25000

Fig.11TPPaseteactiveproductofGoprincipalcellfromprostate15daysafterCdaddZntreatnent.×25000【作者簡介】羅子國(1963—)，男(漢族)，四川劍閣縣人，醫(yī)學碩士，講師

羅子國（重慶醫(yī)科大學電鏡室，生殖醫(yī)學超微結構實驗室，重慶，400016）

李維信（重慶醫(yī)科大學電鏡室，生殖醫(yī)學超微結構實驗室，重慶，400016）參考文獻［1］GunnSA,GouldTC.Vasculatureofthetestisandadnexa.In:GreepRO,etal(eds).HandbookofPhysiology.Section7:Endocrinology.Vol5:MaleReproductiveSystem(M).Washington:AmPhysiolSoc,1975:362-368.

［2］FowlerAJ,SinghDN,DwivediC.Effectofcadmiumonmeiosis［J］.BullEnvironmContamToxicol,1982,29(4):412-415.

［3］李維信，廖曉崗，唐宜，等.鎘對大鼠睪丸的損傷及鋅保護作用的超微結構研究［J］.解剖學報，1988，19(1)：74～78.

［4］徐晨，李維信.鎘對大鼠精囊腺超微結構及TPPase細胞化學和血清睪酮含量的影響［J］.解剖學報，1997，28(3)：209～214.

［5］羅子國，李維信.鎘對大鼠輸精管損傷及鋅保護的超微結構與葡萄糖-6-磷酸酶細胞化學的研究［J］.解剖學報，1999，30(1)：86～89.

［6］廖曉崗，李維信.鎘對大鼠睪丸間質細胞損傷及鋅對其保護的形態(tài)學研究［J］.生殖與避孕，1999，19(5)：290～295.

［7］BettersbyS,ChandlerJA,MortonMS.Theeffectofora