酶標(biāo)抗體技術(shù)酶標(biāo)抗體技術(shù)酶標(biāo)抗體技術(shù)酶標(biāo)抗體技術(shù)編制僅供參考審核批準(zhǔn)生效日期地址：電話：傳真:郵編:酶標(biāo)抗體制備技術(shù)基本要求是將酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合既不改變抗體的免疫反應(yīng)活性，也不影響酶的生物化學(xué)活性。用于標(biāo)記抗體的酶較多，常用的有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。（一）辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體制備技術(shù)辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）廣泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由無(wú)色酶蛋白和深棕色鐵卟啉（輔基）構(gòu)成一種糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。HRP分子量較?。?0kDa），標(biāo)記物容易穿透入細(xì)胞內(nèi)部；作用底物為H2O2，以二氨基聯(lián)苯胺（DAB）為供氫體的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光鏡觀察；在～12范圍內(nèi)穩(wěn)定，對(duì)熱及有機(jī)溶劑的作用亦較穩(wěn)定，能耐受63℃加熱15min；用甲苯與石臘包埋切片處理或用純乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影響其活性；溶解性好，100mL緩沖鹽溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%飽和度以下的硫酸銨溶液中，故常用硫酸銨分級(jí)沉淀法分離純化；氰化物、硫化物、氟化物、及疊氮化物等對(duì)HRP的活性有抑制作用，應(yīng)避免使用NaN3作為酶標(biāo)試劑的防腐劑，以防止失活。凡能在HRP和H2O2存在時(shí)被酶催化H2O2反應(yīng)而和成有色產(chǎn)物的化合物（供氫體）都可以用顯色劑。供氫體的產(chǎn)物分不溶性和可溶性兩類。前者最常用的為3，3‘二氨基聯(lián)苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，適用于免疫組化法；反應(yīng)后的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；這種多聚物還能還原和螯合四氧化餓，形成具有電子密度的產(chǎn)物，適用電鏡檢查；此外還有飽和聯(lián)苯胺溶液，氧化后產(chǎn)物呈黃褐色，多用于酶免疫擴(kuò)散的深沉線顯色。后者最常用的為鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)，產(chǎn)物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值為490nm，可用肉眼判別；易被濃酸終止反應(yīng)，顏色可數(shù)小時(shí)不變，是ELISA中最常用的一種；但對(duì)光敏感，使用時(shí)要避光，并發(fā)現(xiàn)有致癌作用。用HRP標(biāo)記抗體需借助交聯(lián)劑的作用，將酶連接在抗體分子上。常用的交聯(lián)劑為過(guò)碘酸鈉和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。1、改良過(guò)碘酸鈉法HRP分子中與酶活性無(wú)關(guān)的糖基被過(guò)碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，在標(biāo)記前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封閉酶蛋白中殘存的α-和ε-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后，再加入硼氫化鈉(NaHB4）還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。[標(biāo)記步驟]（1）取5mgHRP溶于蒸餾水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）無(wú)水乙醇溶液，室溫（20℃±）下輕微攪拌作用1h。（2）加入1mLLNaIO4，室溫下避光輕攪30min，溶液呈黃綠色。（3）加入L乙二醇，室溫（20℃±）下輕攪作用1h，終止氧化反應(yīng)。（4）加入5mg抗體（Ig），裝入透析袋，置L，碳酸鹽緩沖液（無(wú)水碳酸鈉，碳酸氫鈉,蒸餾水加至1000mL）1000mL中，4℃透析過(guò)夜，更換3次。（5）取出透析袋中液體（約3mL），加入5mg/mLNaHB4mL4℃2h或過(guò)夜。（6）加50%飽和硫酸銨（NH4）2SO4溶液（硫酸銨850g，蒸餾水加至1000mL，以30%氨水調(diào)）6mL沉淀結(jié)合物，置4℃30min后，3000r/min離心30min，取深沉（SPA不需要進(jìn)行此步）。（7）將沉淀物溶于PBS（）中，裝入透析袋，并以此緩沖液透析平衡6-12h，換液3次。（8）在結(jié)合物內(nèi)加入BSA至蛋白濃度為10mg/mL，或加等量60%甘油，測(cè)定工作效價(jià)后，小量分裝（或凍干，不需加甘油），低溫保存?zhèn)溆谩?、戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯(lián)劑，通過(guò)它的兩個(gè)醛基分別與HRP和抗體蛋白的氨基結(jié)合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白結(jié)合物。反應(yīng)可在4-40℃溫度范圍，～的緩沖溶液中進(jìn)行，分為一步法和二步法，戊二醛一步法是將酶和待標(biāo)記抗體混合，同時(shí)加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。戊二醛二步法是將酶先與戊二醛作用，形成酶-戊二醛結(jié)合物，結(jié)過(guò)透析或?qū)游龀ノ唇Y(jié)合的戊二醛，然后再與抗體結(jié)合。[標(biāo)記步驟]（1）取10mgHRP溶于%戊二醛(用L、將25%戊二醛稀釋為%)，室溫（20℃左右）反應(yīng)結(jié)合18h。（2）用LNaCl平衡過(guò)的SephadexG-50凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛，或用L，，4℃透析過(guò)夜。（3）將5mg抗體IgG溶于LNaCl，再與醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。（4）加入1mol/L碳酸鹽緩沖液（調(diào)節(jié)pH至～），4℃，電磁攪拌下結(jié)合24h。（5）加入賴氨酸（溶于10mL蒸餾水），4℃放置2h，以封閉殘留的醛基，終止反應(yīng)。（6）裝入透析袋，以L、PBS，4℃透析過(guò)夜，或通過(guò)SephadexG-200凝膠柱層析，用PBS洗脫，收集第1峰洗脫液，加入等量60%甘油，測(cè)工作效價(jià)后，小量分裝，4℃或-20℃保存。（二）過(guò)氧化物酶簡(jiǎn)介抗過(guò)氧化物復(fù)合物制備技術(shù)Stemberger(1970)等，首先報(bào)道了過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也稱為非標(biāo)記抗體酶法（unlabelledantibodyenzymemethod）。PAP法不需用任何化學(xué)交聯(lián)劑處理酶和抗體，二者活性不受化學(xué)反應(yīng)的影響，可大大提高免疫酶法的靈敏度。標(biāo)記步驟（1）取5mL抗HRP血清，16000r/min4℃離心20min，取上清液。（2）加入1mLHRP(2mg/mL)溶液混勻，室溫（20℃±）靜置1h，16000r/min，4℃離心20min，取沉淀物。（3）加冷生理鹽水反復(fù)洗滌-離心（16000r/min，4℃離心20min）3次，棄上清，取沉淀物。（4）加入過(guò)量HRP溶液4mL（2mg/mL）混勻后，移至小燒杯內(nèi)。（5）在pH計(jì)監(jiān)控下，邊攪拌邊加入及LHCl調(diào)至左右，使沉淀完全溶解。（6）立即加入LnaOH,調(diào)，16000r/min，4℃離心20min，取上清液。（7）加入1/10體積的L醋酸鈉和L醋酸銨的等量混合液后混勻。（8）電磁攪拌下逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液，并繼續(xù)攪拌10min，4℃放置20min，16000r/min，4℃離心20min，去上清，取深沉物。（9）以50%飽和硫酸銨洗滌，4℃、16000r/min×20min，離心2次，取深沉物。（10）加5mL蒸餾水將深沉物溶解后裝入透析袋，用醋酸鹽緩沖液（生理鹽水、蒸餾水、75mLL醋酸鈉及75mL粉酶3moL/L醋酸銨）4℃透析3d，每天換液2次。（11）17000r/min，4℃離心20min，取上清液進(jìn)行工作效價(jià)鑒定。（12）加等量60%甘油，小量分裝，-20℃保存。（三）McAb-PAP制備技術(shù)用抗HRPMcAb制備PAP復(fù)合物的工藝條件較為簡(jiǎn)便，而且不需嚴(yán)格的條件限制。用小鼠抗HRPMcAb制備的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反應(yīng)2h，即成鼠PAP復(fù)合物。以按HRP/IgG克分子比為4︰1制備為宜。（四）堿性磷酸酶標(biāo)抗體制備技術(shù)簡(jiǎn)介堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP），系小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉出來(lái)的一種磷酸酯的水解酶，由多個(gè)同功酶組成。從小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kDa，酶作用的最適pH為；從大腸桿菌中提取酶分子量為80kDa，最適pH為。它的作用底物較多，常用的酶底物有對(duì)硝基本磷酸鹽（PNP）、β-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯等。AP主要用作雙標(biāo)記染色，研究遞質(zhì)共存及酶名疫測(cè)定。AP標(biāo)記抗體，一般采用戊二醛作交聯(lián)劑一步法，使酶和抗體蛋白的氨基分別與戊二醛的兩個(gè)醛基結(jié)合。標(biāo)記步驟（1）取抗體（2～5mg/mL）1mL，加入AP5mg溶解。（2）裝入透析袋，用L、℃透析18h，換液3次。（3）加入%戊二醛20uL，室溫（20℃±）放置2h。4℃L、透析過(guò)夜，換液3次。（4）移入L、緩沖液中，4℃透析過(guò)夜，換液3次。（5）取出標(biāo)記抗體，用含%BSA和%NaN3的Tris-HCl緩沖液稀釋至4mL，即為酶標(biāo)記物原液。（6）加入1/3量純甘油，測(cè)定工作效價(jià)后，小量（）分裝，4℃保存（使用前以吐溫溶液將結(jié)合物適當(dāng)稀釋）。（五）堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物制備技術(shù)Mason等（1978），用堿性磷酸酶代替過(guò)氧化物酶，建立了堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物（APAAP）橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)。但以AP作為抗原用常規(guī)免疫方法制備的抗血清，很難達(dá)到APAPP橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)的質(zhì)量要求，在一定程度上限制了此項(xiàng)技術(shù)的推廣使用。楊志剛等（1989）利用抗AP的McAb建立了一種制備APAAP復(fù)合物的簡(jiǎn)便