1、碳納米管作為載體在生物醫(yī)學中的應用【摘要】碳納米管是一種新型的納米材料，隨著對碳納米管功能化研究的深化，碳納米管在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用也在拓展。本文就其作為載體攜帶多肽、蛋白質(zhì)、核酸、疫苗和藥物進入細胞發(fā)揮生物醫(yī)學作用作一綜述?！娟P(guān)鍵詞】碳納米管載體生物醫(yī)學碳納米管arbnnantube，NT是由日本NE公司的Iijia于1991年發(fā)現(xiàn)的新型納米材料，由碳原子形成的石墨片繞中心軸按一定的螺旋角卷曲而成的無縫、中空的管體。管子一般由單層single-alledNT，SNT或多層ulti-alledNT，NT組成。由于NT具有良好的力學、電磁學和化學性能，目前在物理、化學和材料科學中已成為研究前沿，

2、并在很多領(lǐng)域有了探究性的應用，如場致發(fā)射、能量儲藏、分子電極4、原子力顯微鏡等，但其不溶于任何溶劑的特性限制了其在生物醫(yī)學中的應用。進步NT的分散性和溶解性的方法主要分為兩大類：第一類是非共價結(jié)合外表活性劑、核酸、多肽、多聚物或寡聚體；另一類方法是NT的共價功能化，通過濃酸氧化截短或環(huán)加成作用在其外表或頂端連接有機分子，通過側(cè)鏈分子間的互相排擠作用使其分散與溶解。對NT進展改性的過程稱為NT的功能化，功能化NT可以進入細胞，并且其共價連接的側(cè)鏈可以進一步與生物分子，如多肽、蛋白質(zhì)、核酸以及藥物等相結(jié)合；而且NT本身就可以非共價結(jié)合多肽、蛋白質(zhì)或核酸作為功能化的修飾基團，以上2個條件可使NT成為

3、載體并在生物醫(yī)學領(lǐng)域廣泛應用。1功能化NT進入細胞的機制熒光標記的胺基化NT0.05g/L與人早幼粒白血病細胞huanleukeianline，HL60在37共培養(yǎng)1h后，應用熒光顯微鏡可以看到細胞外表有較多的熒光聚集，更為重要的是細胞內(nèi)也可看到熒光，這說明功能化的NT能進入細胞內(nèi)。異硫氰酸熒光素fluresEinisthiynate,FIT標記的胺基化NT主要分布于細胞質(zhì)，進入細胞核較慢；而肽結(jié)合的NT可以快速的進入細胞核。目前有關(guān)功能化NT進入細胞的機制尚有爭論，普遍認為有被動吞噬和主動穿透兩種可能途徑。Ka等將FIT綠色熒光標記的胺基化SNT與HL60細胞共培育后，再用內(nèi)含體特異的紅色熒

4、光標記物將內(nèi)含體染色，熒光顯微鏡可以觀察到細胞內(nèi)紅、綠兩種顏色疊加的黃色熒光標記物，提示功能化NT是通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞的。降低共培養(yǎng)溫度至4細胞內(nèi)就沒有熒光，提示低溫能抑制細胞內(nèi)吞作用。進一步的研究說明NT攜帶生物分子進入細胞是通過網(wǎng)格蛋白依賴性細胞內(nèi)吞途徑，而與細胞膜內(nèi)陷途徑無關(guān)。Bttini等研究也認為NT是通過細胞內(nèi)吞作用進入Jurkat細胞的，而且可以被D3受體介導的細胞內(nèi)吞作用放大，但不進入細胞核。而Pantartt等將胺基化SNT2.5g/L與HeLa細胞共培育1h后以環(huán)氧樹脂包埋制成超薄切片，通過對連續(xù)切片的細致觀察可以看到NT穿過細胞膜的過程，所以認為有一定剛性和長度的N

5、T并非通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞，而是象一根針一樣主動地刺穿細胞膜進入細胞而不引起細胞的損傷。Bian等也認為可以排除細胞內(nèi)吞作用，因為應用疊氮化鈉或2,4二硝基酚抑制細胞內(nèi)吞作用或降低培養(yǎng)溫度至4，并不能抑制細胞攝入不同的NT。最近的分子動力模型數(shù)據(jù)顯示疏水的NT連接親水基團后可以主動地插入脂質(zhì)雙分子層。功能化NT進入細胞的不同機制和在細胞內(nèi)的不同分布也許取決于NT的不同功能化基團。2功能化NT作為不同生物分子或藥物進入細胞的載體2.1多肽、蛋白質(zhì)螺旋形的多肽具有兩性分子的特點，因此可以通過疏水作用與NT結(jié)合形成可溶性的超分子聚合物13，功能化的NT帶正電荷的側(cè)鏈也可以通過正負電荷引力結(jié)合多肽

6、或蛋白質(zhì)。原子力顯微鏡可以直接觀察到蛋白質(zhì)在功能化NT外表的聚集，蛋白質(zhì)單體在NT外表的間距約為20100n，Ka等14形象地將其描繪為“麥穗樣構(gòu)造。通過比擬細胞色素、牛血清白蛋白蛋白質(zhì)A與羧基化NT的結(jié)合圖像，發(fā)現(xiàn)細胞色素的聚集最多，而其等電點約為9.2，另外兩個蛋白質(zhì)的等電點均7，所以認為蛋白質(zhì)與NT之間的非共價結(jié)合除了疏水作用外，靜電引力是另外一個重要的作用。通過生物素將具有熒光的抗生物素蛋白鏈菌素連接于胺基化NT并與HL60細胞共培育，在腫瘤細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有較強的抗生物素蛋白鏈菌素熒光，提示NT能將大分子蛋白載入細胞內(nèi)。通過流式細胞分析發(fā)現(xiàn)隨著NT濃度和培養(yǎng)時間的延長，進入細胞內(nèi)的NT及抗

7、生物素蛋白鏈菌素的量不斷增加7，對照研究說明蛋白質(zhì)本身不能進入細胞，在這里功能化的NT起蛋白質(zhì)載體作用。功能化SNT通過生物素連接抗生物素蛋白鏈菌素并與HL60細胞共培育，12h后即可在光學顯微鏡下看到大量的細胞碎片，提示細胞死亡。將連接的抗生物素蛋白鏈菌素的量從2.5l減少到0.0625l，結(jié)合物的細胞毒性也相應降低，說明功能化SNT不但能將蛋白質(zhì)載入細胞內(nèi)，而且連接的蛋白質(zhì)還能發(fā)揮原有的劑量依賴性的生物學功能。細胞色素也能連接于羧基化SNT進入細胞，并能保存其生物學活性而導致細胞的凋亡，但其是否從NT上脫落下來而發(fā)揮生物學作用尚需進一步研究14。2.2DNA單鏈DNA可以非共價結(jié)合于SNT

8、，并使NT分散于水和培養(yǎng)基中，以y3熒光標記DNA后顯示SNT可以攜帶DNA進入細胞，但大局部分布在細胞質(zhì)中，只有少量能進入細胞核。目前利用DNA作為NT穩(wěn)定劑的研究都是在液相中進展的，并都需要超聲振蕩處理。而Nepal等的研究是在固相中將NT和DNA一起碾磨即應用機械化學反響將NT截短與DNA結(jié)合形成長短相對均一、水溶性良好高達5.6g/L且長期穩(wěn)定可以長達6個月的SNT-DNA或NT-DNA超分子化合物。的互相作用使DNA和NT骨架結(jié)實結(jié)合，而位于外表的DNA磷酸根使聚合物溶解于水。同時碾磨作用并沒有改變DNA或NT的固有特性。當720g/L的胺基化SNT和5g/L的質(zhì)粒相混電荷比為6:1

9、，透射電子顯微鏡下可以直觀地看到NT外表有球形、環(huán)形或螺旋形質(zhì)粒的聚集。凝膠電泳顯示帶正電荷的胺基化的NT可以結(jié)合帶負電荷的質(zhì)粒，而帶負電荷或不帶電荷的羧基、羥基或烷基修飾的NT那么不能結(jié)合質(zhì)粒。Kaiser試驗也顯示胺基化的NT的修飾側(cè)鏈數(shù)量到達0.934l/g，說明胺基化NT外表有高密度的正電荷，并通過正負電荷作用與質(zhì)粒結(jié)合17。外表胞質(zhì)基團磁共振surfaeplasnresnane,SPR顯示胺基化的NT和質(zhì)粒間有較強的親和力，由于較強的電荷之間的互相吸引而形成比擬穩(wěn)定的超分子構(gòu)造，并且說明NT可以比SNT濃聚更多的質(zhì)粒，掃描電子顯微鏡從形態(tài)學上也證實這一點。電荷比為1:1時胺基化的NT

10、可以濃聚96的質(zhì)粒，而胺基化的SNT僅能濃聚43的質(zhì)粒，當電荷比到達6：1時，NT可以濃聚99的質(zhì)粒而SNT是58。原因是兩者在電荷密度相似的條件下NT有更大的外表積，并且掃描電子顯微鏡顯示質(zhì)粒與其結(jié)合更為嚴密和結(jié)實18。胺基化NT可以攜帶有綠色熒光蛋白greenfluresentprtEIn,GFP報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人黑色素瘤細胞株A375，比照不同電荷比的轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)胺基化NT與質(zhì)粒的電荷比為10:2時，轉(zhuǎn)染效率最高17。Pantartt等11的研究結(jié)果也顯示功能化SNT和DNA的電荷比介于2:16:1時，基因轉(zhuǎn)染效率最高，為單獨DNA對照的510倍，并且轉(zhuǎn)染時間以3h

11、為最正確。但目前功能化NT轉(zhuǎn)染基因的效率仍低于lipfetaine的轉(zhuǎn)染效率。ai等設計了包埋有鎳的帶磁性的功能化NT，旋轉(zhuǎn)磁場可以使磁性NT黏附于細胞外表，然后在固定磁場的作用下，NT可以穿入細胞。這種磁性功能化NT在旋轉(zhuǎn)和固定磁場的序貫作用下可以攜帶有GFP報告基因的質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)元細胞和B淋巴細胞，轉(zhuǎn)染效率通過流式細胞定量分析和熒光顯微鏡定量分析可以到達80100。原代的B淋巴細胞和神經(jīng)元細胞以難轉(zhuǎn)染而著稱，這兩種細胞應用lipfetaine攜帶一樣質(zhì)粒轉(zhuǎn)染均未成功。功能化NT的另一顯著優(yōu)勢是沒有細胞毒性，噻唑藍試驗顯示高達60g/L的胺基化NT并不影響細胞的生長，而lipfeta

12、ine20g/L就顯示出細胞毒性。2.3RNA小分子RNA干擾RNAinterferene，RNAi是一種新的基因治療技術(shù)，是雙鏈RNA分子siRNA在RNA程度關(guān)閉相關(guān)序列基因或使其沉默的過程，較以往的核酶和反義核酸技術(shù)更能高效、特異地阻抑基因的表達。功能化NT帶正電荷的側(cè)鏈不但可以介導NT與蛋白質(zhì)、DNA的連接，還可以介導siRNA與NT的結(jié)合。特定的siRNA可以通過二硫鍵連接于功能化NT的側(cè)鏈并以功能化NT為載體進入細胞，在二硫蘇糖醇的作用下二硫鍵斷裂，使siRNA從NT載體上游離下來，并從內(nèi)含體或溶酶體中釋放出來而分布于細胞質(zhì)或進入細胞核發(fā)揮RNA干擾作用，抑制層連蛋白lainA/的

13、表達。流式細胞定量分析顯示以該載體轉(zhuǎn)染細胞的RNA干擾效率明顯高于lipfetaine載體的效率?？赡芘cNT的高比外表積、高效的轉(zhuǎn)運才能及可裂解的二硫鍵防止了生物學活性分子在溶酶體內(nèi)的降解破壞有關(guān)。端粒酶是維持細胞染色體穩(wěn)定的關(guān)鍵酶，端粒酶的激活與腫瘤形成有關(guān)，在大多數(shù)腫瘤中都能檢測到端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶telerasereversetransriptase,TERT的存在，宮頸癌細胞、卵巢癌細胞、肺癌細胞都高表達TERT信使RNA和蛋白。胺基功能化帶正電荷的SNT可以介導TERTRNAi進入腫瘤細胞，抑制TERT基因的轉(zhuǎn)錄和表達，產(chǎn)生特異性的RNA干擾作用。共培養(yǎng)48h后就可以明顯看到腫瘤細胞凋亡

14、的形態(tài)學改變：細胞生長停滯、形態(tài)增大、細胞質(zhì)空泡化。共培養(yǎng)6d后，還可以明顯地抑制腫瘤細胞的生長。在小鼠移植瘤內(nèi)注射TERTsiRNA+SNT可以明顯抑制移植瘤的生長，且多點注射較單點注射效果明顯。樹突細胞是最有效的抗原呈遞細胞，并在有效免疫反響的啟動中發(fā)揮中心作用。抗腫瘤免疫的失效被認為是樹突細胞內(nèi)存在信號系統(tǒng)控制的免疫抑制機制。因為細胞吞噬作用可能是NT進入細胞的主要機制，所以Yang等假設靜脈內(nèi)應用NT能被抗原呈遞細胞攝齲通過鼠尾靜脈注射DNA功能化的NT后，在脾臟的樹突細胞內(nèi)可以觀察到NT的存在。通過鼠尾靜脈注射D80siRNA+SNTs+復合物可以顯著減少D11+的樹突狀細胞和D11

15、b+的巨噬細胞外表D80分子的表達，說明D80siRNA+:SNTs+復合物不但能被腫瘤相關(guān)性Gr-1+D11b+的樹突狀細胞攝取，而且可以產(chǎn)生特異性的RNA干擾作用；同時siRNA+SNTs+復合物并不影響樹突狀細胞的表型和形態(tài)，說明siRNA+SNTs+復合物不影響樹突狀細胞的分化和功能，這就為RNA技術(shù)在腫瘤免疫治療中的應用提供了理論基矗靜脈應用SS1細胞因子信號1抑制因子suppressrfytkinesignaling1，SS1siRNA+SNTs可以特異性地干擾SS1的表達，從而增強樹突細胞的抗原呈遞功能繼而延緩腫瘤的生長。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4疫苗因為NT具有較高的長徑比，

16、能提供較大的外表積，具有較大的生物分子結(jié)合才能，所以被認為是多肽抗原的理想載體。人工合成的口蹄疫病毒抗原通過一段肽鏈連接于NT后，仍可以保存其抗原性和免疫原性，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗，可以明確結(jié)合于NT的肽保存了其原有的構(gòu)造特點并能為特定的抗體識別；Bian等8將上述口蹄疫病毒抗原肽鏈-NT復合物接種小鼠，并與病毒單獨接種比擬，發(fā)現(xiàn)復合物可以增強相應抗體的產(chǎn)生，并且抗體是病毒抗原特異性的，并不與連接肽和NT反響。同時發(fā)現(xiàn)要將病毒抗原共價連接于NT才能產(chǎn)生高滴度的抗體，將抗原與NT簡單相混并不能刺激產(chǎn)生高滴度的抗體。更為重要的是NT本身并不刺激產(chǎn)生抗體，即NT沒有抗原性，與蛋白質(zhì)載體比擬防止了反復

17、應用可能導致的抗原表位抑制。2.5藥物設計藥物載體的目的是克制或改善藥物單獨應用的某些缺點，如溶解度低、組織分布差、缺少選擇性、藥物動力學差或損害安康組織等，用以進步藥物的動力學和治療效果。Feazell等將順鉑的前體鉑復合物通過肽鏈連接到胺基化SNT，以胺基化NT為載體并通過細胞的內(nèi)吞作用，鉑復合物能進入睪丸癌細胞，并且連接于功能化NT外表的鉑復合物的細胞毒性是游離復合物的100多倍，為進步腫瘤化學治療藥物的敏感性提供了一條新途徑。另外，NT的較高的長徑比使在同一根NT可以同時連接不同作用的分子成為可能靶向分子、報告分子、藥物、增敏分子等。u等將熒光標記物FIT和抗真菌藥物兩性霉素B同時連接

18、于功能化NT，前者可以作為細胞攝取NT的追蹤劑，后者搭載NT很容易進入細胞，并保存了較強的抗真菌活力。Zhu等發(fā)現(xiàn)碳硼烷修飾的水溶性SNT靜脈注射后可以選擇性地在腫瘤組織中濃聚、滯留，靜脈應用48h后腫瘤組織中的濃度為血液中濃度的3.12倍，所以NT可以成為硼中子俘獲療法治療腫瘤的載體。2.6其他生物系統(tǒng)對7001100n的紅外線幾乎是完全通透的，但SNT可以強烈吸收該波段的光線，這一源于NT的電學特性在載體系統(tǒng)中是獨一無二的。在紅外線的照射下，通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)的y3-DNA-SNT可以吸收光能產(chǎn)熱，導致內(nèi)含體的破裂，并使y3-DNA-SNT從SNT游離下來，移位進入細胞核。限制照射時間

19、10s并不會對細胞活力和細胞增殖才能產(chǎn)生不良影響；延長照射時間至2in可以導致細胞損傷，并有細胞形態(tài)學改變?nèi)琊じ搅Φ南陆怠⒓毎槠木奂?；而沒有NT的對照組細胞完全不受紅外線照射的影響。在SNT外表連接葉酸就可以選擇性地介導NT進入葉酸受體陽性的腫瘤細胞，然后在紅外線的照射下特異地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞沒有不良影響。結(jié)合應用NT運載才能及光學特性，可以開拓藥物遞送和腫瘤治療的新領(lǐng)域。3NT的生物平安性Bian等認為NT的生物毒性主要是由殘留的催化劑和不溶性引起的。不溶性的原始的NT對細胞的毒性在共培養(yǎng)24h就開場顯現(xiàn)，5d后更為明顯。細胞毒性的形態(tài)學表現(xiàn)為培養(yǎng)1d后局部細胞在培養(yǎng)皿中由嚴密

20、貼壁變?yōu)槭杷烧尺B或脫離，剩余的細胞表現(xiàn)為細胞質(zhì)收縮，細胞核皺縮和嗜酸性改變，這些形態(tài)學的改變標志著細胞不可逆的損傷和細胞死亡的開場。ui等從基因和蛋白程度闡述了NT的細胞毒性，NT抑制人肺癌細胞株HEK293細胞的增殖是通過p16-ylinD-Rb途徑實現(xiàn)的。HEK293細胞在NT的刺激下，p16蛋白的積聚可以結(jié)合并抑制細胞周期蛋白DK2、DK4、DK6的活性，從而阻止細胞進入S期，而停滯在G1期，并且與黏附有關(guān)的蛋白如：層粘連蛋白、FAK、鈣黏蛋白、細胞周期蛋白D3表達量也逐漸下降，表現(xiàn)為細胞黏附力的下降。雖然NT進入細胞機制需要進一步的研究和統(tǒng)一，但目前的報道都一致認為功能化良好、水溶性強

21、的NT沒有明顯的細胞毒性-。Sayes等的研究說明隨著NT側(cè)壁功能化程度的增加，細胞毒性會減少。Durtier等認為功能化NT除了沒有細胞毒性外，對免疫細胞的功能也沒有明顯的影響。4結(jié)語NT的制備如今已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，隨著對其功能化研究的深化，有望進一步改善其生物相容性。說明NT進入細胞的機制并明確其運載效率的影響因素將進一步拓展其作為載體在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的應用。【參考文獻】1IijiaS.HelialirtubulesfgraphitiarbnJ.Nature,1991，3546348：56-58.2ilneI，TeKBK，AaratungaGAJ，etal.arbnnantubesasfield

22、eissinsuresJ.Jaterhe，2022，146：933-943.3Hirsher，Beher.HydrgenstrageinarbnnantubeJ.JNansiNantehnl，2022，31-2：3-17.4ServieRF.leulareletrnisNandevieakefreshstridestardrealityJ.Siene，2022，3025649：1310.5HafnerJH，heungL，lleyAT，etal.StruturalandfuntinaliagingitharbnnantueAFprbesJ.PrgBiphyslBil，2001，771：73-11

23、0.6Klupp，KstarelsK，Prat，etal.FuntinalizedarbnnantubeaseergingnanvetrsfrdeliveryftherapeutisJ.BihiBiphysAta，2022，17583：404-412.7KaN，JesspT，enderPA，etal.Nantubeleulartransprtersinternalizatinfarbnnantube-prtEinnjugatesintaalianellsJ.JAheS，2022，12622：6850-6851.8BianA，KstarelsK，PartidsD，etal.Biedialappl

24、iatinffuntinalisedarbnnantubesJ.heun，2022，75：571-577.9KaN，LiuZ，DaiH.arbnnantubesasintraellulartransprtersfrprtEInandDNA：aninvestigatinftheuptakeehanisandpathayJ.AngeheIntEdEngl，2022，454：577-581.10Bttini，erignliF，DasnI，etal.Full-lengthsingle-alledarbnnantubesderatedithstreptavidin-njugatedquantudtsas

25、ultivalentintraellularfluresentnanprbesJ.Biarleules，：2022，：612：3693-3698.11PantarttD,SinghR,arthyD,etal.FuntinalizedarbnnantubesfrplasidDNAgenedeliveryJ.AngeheIntEdEngl,2022，43(39)：5242-5246.12LpezF,NielsenS,rePB,etal.UnderstandingnaturesdesignfrnansyringeJ.PrNatlAadSiUSA,2022,10113：4431-4434.13Diek

26、annGR,DaltnAB,JhnsnPA,etal.ntrlledasseblyfarbnnantubebydesignaphiphilipeptideheliesJ.JAheS,2022,1257：1770-1777.14KaN,DaiH.arbnnantubesasintraellularprteintransprters：generalityandbilgialfuntinalityJ.JAheS,2022,12716：6021-6026.15KaN,nnell,isdJA,etal.arbnnantubesasultifuntinalbilgialtransprtersandnear

27、-infraredagentsfrseletiveanerelldestrutinJ.PrNatlAadSiUSA,2022,10233：11600-11605.16NepalD,ShnJI,AiherK,etal.SupraleularnjugatinfarbnnantubeandDNAbyaslid-statereatinJ.Biarleules,2022,66：2919-2922.17GaL,NieL,angT,etal.arbnnantubedeliveryftheGFPgeneintaalianellsJ.hebihe,2022,72：239-242.18SinghR,Pantart

28、tD,arthyD,etal.BindingandndensatinfplasidDNAntfuntinalizedarbnnantubes：tardthenstrutinfnantube-basedgenedeliveryvetrsJ.JAheS,2022,12712：4388-4396.19aiD,atarazaJ,QinZH,etal.HigheffiientleulardeliveryintaalianellsusingarbnnantubespearingJ.Natethds,2022,26：449-454.20HannnGJ.RNAinterfereneJ.Nature,2002,

29、4186894：244-251.21KaN,LiuZ,DaiH.FuntinalizatinfarbnnantubevialeavabledisulfidebndsfreffiientintraellulardeliveryfsiRNAandptentgenesileningJ.JAheS,2022,12736：12492-12493.22ZhangZ,YangX,ZhangY,etal.DeliveryftelerasereversetransriptasesallinterferingRNAinplexithpsitivelyhargedsingle-alledarbnnantubessuppressesturgrthJ.linanerRes,2022,1216：4933-4939.23YangR,YangX,ZhangZ,etal.Single-alledarbnnantubes-ediatedinvivandinvitrdeliveryfsiRNAintantigen-presentingellsJ.GeneTher,2022,1324：171