1、DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)-PPT課件DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)-PPT課件 內(nèi)容課題分析1實(shí)驗(yàn)操作原理5材料器具3實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)4教學(xué)建議2實(shí)驗(yàn)步驟6 內(nèi)容課題分析1實(shí)驗(yàn)操作原理5材料器具3實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)4一、課題分析1.教學(xué)目標(biāo)（1）分析DNA的性質(zhì)及提取的基本思路。（2）探究不同手段提取DNA的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。（3）掌握DNA提取的過(guò)程并靈活運(yùn)用。一、課題分析1.教學(xué)目標(biāo)2.背景描述生物體的性狀之所以能夠遺傳給后代，是由于其體內(nèi)具有DNA或RNA這些遺傳物質(zhì)，DNA是遺傳物質(zhì)已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。那么DNA究竟什么樣？本課題通過(guò)嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取，了解DNA的理化性質(zhì)，理解DNA提取以及

2、鑒定的原理，在一定層面感性認(rèn)知DNA。一、課題分析2.背景描述一、課題分析DNA脫氧核苷酸腺嘌呤一、課題分析dAMPdTMPdCMPdGMP胸腺嘧啶腺嘌呤鳥(niǎo)嘌呤DNA脫氧核苷酸腺嘌呤一、課題分析dAMPdTMPdCMPd核苷酸結(jié)構(gòu)核苷酸結(jié)構(gòu)一、課題分析脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長(zhǎng)鏈骨架，排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個(gè)糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著DNA長(zhǎng)鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。一、課題分析一、課題分析讀取密碼的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄。是以DNA雙鏈中的一條單鏈為模板轉(zhuǎn)錄出一段稱(chēng)為mRNA（信使RNA）的核酸分子。多數(shù)RNA帶有合

3、成蛋白質(zhì)的訊息，另有一些本身就擁有特殊功能，例如rRNA、snRNA與siRNA。一、課題分析一、課題分析在細(xì)胞內(nèi)，DNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，整組染色體則統(tǒng)稱(chēng)為染色體組。人正常的人體細(xì)胞中含有46條染色體。染色體在細(xì)胞分裂之前會(huì)先在分裂間期完成復(fù)制，細(xì)胞分裂間期又可劃分為：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。一、課題分析染色體在細(xì)胞分裂之前會(huì)先在分裂間期完成復(fù)制，細(xì)胞一、課題分析DNA是高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基綠染成綠色。DNA對(duì)紫外線（260nm）有吸收作用，利用這一特性，可以對(duì)DNA進(jìn)行含量測(cè)定。當(dāng)核酸變性時(shí)，吸光度

4、升高，稱(chēng)為增色效應(yīng)；當(dāng)變性核酸重新復(fù)性時(shí)，吸光度又會(huì)恢復(fù)到原來(lái)的水平。較高溫度、有機(jī)溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子變性，即DNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)也稱(chēng)為DNA的解螺旋。一、課題分析洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞DNA被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅色洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞DNA被甲基綠染成綠色，RNA被派洛寧染成紅二、教學(xué)建議科學(xué)的探究一般過(guò)程為“發(fā)現(xiàn)問(wèn)題提出假設(shè)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果得出結(jié)論”。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)的具體的實(shí)施，是學(xué)員能夠接受科學(xué)的訓(xùn)練，在訓(xùn)練過(guò)程中舉一反三，從理論到實(shí)踐認(rèn)知DNA的提取過(guò)程和操作原理。從DNA的物質(zhì)組成，到DNA的復(fù)制時(shí)期，聯(lián)系生物學(xué)現(xiàn)象。在理解DN

5、A的理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用其理化性質(zhì)對(duì)DNA進(jìn)行分離。二、教學(xué)建議科學(xué)的探究一般過(guò)程為“發(fā)現(xiàn)問(wèn)題提出假設(shè)設(shè)計(jì)實(shí)三、材料器具材料：新鮮菠菜4kg。試劑：氯化鈉1000g、SDS 500g、無(wú)水乙醇4000ml、二苯胺200ml。器材：200ml燒杯60個(gè)、試管100支、研缽30個(gè)、玻璃棒30個(gè)、紗布2包、不銹鋼藥勺30個(gè)、濾紙5包。儀器：天平2臺(tái)、水浴鍋2個(gè)、漏斗30個(gè)。三、材料器具材料：新鮮菠菜4kg。DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度。DNA對(duì)紫外線有吸收作用，當(dāng)核酸變性時(shí)，吸光值升高；當(dāng)變性核酸可復(fù)性時(shí)，吸光值又會(huì)恢復(fù)到原來(lái)水平。溫度、有機(jī)溶劑、酸堿度、尿素

6、、酰胺等試劑都可以引起DNA分子變性，即使得DNA雙鍵間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)。四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高1、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響；大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080的高溫，而DNA在80以上才會(huì)變性；洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對(duì)DNA沒(méi)有影響。四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)1、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)2、DNA的溶解度DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反。四、實(shí)驗(yàn)

7、理論基礎(chǔ)3、DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。2、DNA的溶解度四、實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)3、DNA在酒精溶液中的溶1、實(shí)驗(yàn)材料的選取凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，更具有操作性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x取適當(dāng)?shù)牟牧虾头椒?。魚(yú)卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。五、實(shí)驗(yàn)操作原理1、實(shí)驗(yàn)材料的選取五、實(shí)驗(yàn)操作原理2、細(xì)胞破碎動(dòng)物細(xì)胞：沒(méi)有細(xì)胞壁破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾

8、后收集濾液即可。原理：蒸餾水對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。植物細(xì)胞：需要先用一定的洗滌劑和氯化鈉溶解細(xì)胞膜，洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放，氯化鈉有利于DNA的溶解。研磨：使DNA充分釋放，洗滌劑等更容易充分接觸細(xì)胞膜。用液氮研磨可有效的防止DNA降解。五、實(shí)驗(yàn)操作原理2、細(xì)胞破碎五、實(shí)驗(yàn)操作原理2、細(xì)胞破碎DNA降解的原因： 溫度：高溫,易加速磷酸二酯鍵的水解。濕度：參與磷酸二酯鍵的水解 、影響DNA螺旋的形成結(jié)構(gòu)。pH值：氫離子參與與催化磷酸二酯

9、鍵的水解 、過(guò)高或過(guò)低的pH值都易破壞氫鍵 。氧化反應(yīng)：氧化堿基中的含氮雜環(huán),使其變性,從而進(jìn)一步改變一級(jí)與二級(jí)的DNA構(gòu)象。DNA降解酶：水解DNA。五、實(shí)驗(yàn)操作原理2、細(xì)胞破碎五、實(shí)驗(yàn)操作原理3、DNA的純化細(xì)胞破碎后主要含有蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)?？筛鶕?jù)DNA的性質(zhì)進(jìn)行純化。首先可通過(guò)過(guò)濾、離心等方法去除不溶解的雜質(zhì)，然后再進(jìn)一步純化。氯化鈉中的溶解度，氯化鈉濃度為2mol/l時(shí)DNA溶解度最大，可在此濃度下先溶解DNA，然后過(guò)濾去除不溶解的雜質(zhì)，然后在DNA溶解度最低的氯化鈉溶液中（0.14mol/l）使DNA析出，再過(guò)濾去除溶解在氯化鈉溶液中的雜質(zhì)。五、實(shí)驗(yàn)操作原理3、DNA的純化

10、五、實(shí)驗(yàn)操作原理3、DNA的純化利用蛋白酶降解蛋白質(zhì)，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶K等，降解蛋白質(zhì)。適當(dāng)溫度降解蛋白質(zhì)，65-70，DNA不會(huì)被變性，蛋白會(huì)變性。不溶于水的有機(jī)溶劑，酚、氯仿等，DNA不溶于這類(lèi)試劑，蛋白質(zhì)可溶解在其中，通過(guò)靜止或離心使有機(jī)試劑和水分離，去除雜質(zhì)。DNA結(jié)合柱，硝酸纖維素膜等，在酸性條件下可結(jié)合DNA，中性和堿性條件下結(jié)合能力差。通過(guò)DNA的等電點(diǎn)調(diào)節(jié)其所帶電荷為正電或負(fù)電，通過(guò)孔徑去除大分子和小分子。五、實(shí)驗(yàn)操作原理3、DNA的純化五、實(shí)驗(yàn)操作原理4、DNA的析出溶于水的有機(jī)溶劑可使DNA析出，水更容易和有機(jī)試劑結(jié)合，使DNA析出，如一定濃度乙醇、異丙醇（

11、乙醇濃度一般在48-67.5%，異丙醇濃度在36%以上，濃度越高效果越好），低溫效果更好（雜質(zhì)較多），同時(shí)，可在一定程度上出去溶于該有機(jī)試劑的雜質(zhì)。5、DNA的溶解一般采用TE（Tris-EDTA，pH8.0）緩沖液或去離子水。五、實(shí)驗(yàn)操作原理4、DNA的析出五、實(shí)驗(yàn)操作原理6、 DNA的鑒定DNA與二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色；可被甲基綠染成綠色；DNA對(duì)紫外線（260nm）有吸收作用；DNA可與溴化乙錠（EB）花青素類(lèi)染料結(jié)合，可在紫外光下激發(fā)熒光。五、實(shí)驗(yàn)操作原理6、 DNA的鑒定五、實(shí)驗(yàn)操作原理1.植物材料的研磨：稱(chēng)取新鮮植物材料（菠菜）100g，表面清洗后，在研缽中充分研磨，可加入石英砂，將植物組織充分研磨（可加入適量的提取緩沖液）。2.將研磨好的樣品取出置于200ml燒杯中，加入100ml 10%的SDS輕輕混勻，65水浴10-15min后取出。3.用多層紗布過(guò)濾，含DNA的粘稠物留在紗布上。4.用20mL 2mol/L的NaCl溶液，溶解粘稠物，在20mL燒杯中輕緩攪拌3min，使盡可能多的DNA溶解在NaCl溶液。六、實(shí)驗(yàn)步驟1.植物材料的研磨：稱(chēng)取新鮮植物材料（菠菜）100g，表面清5. 用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾，濾液中含有DNA。6. 向?yàn)V液中加入等體積的無(wú)水乙醇（或95%的乙醇），用玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現(xiàn)乳白色絲