1、堿性蛋白酶和亞硫酸鈉水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究 嚴(yán)梅榮摘 要 本文研究堿性蛋白酶Alcalase直接水解菜籽粕制取菜籽多肽，試驗反應(yīng)時添加亞硫酸鈉的影響及使用膜分離技術(shù)去除產(chǎn)物中的硫代葡萄糖甘。結(jié)果表明，Na2SO3通過對蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵的斷裂作用及對堿性蛋白酶抑制劑的影響，可提高堿性蛋白酶的活性， 使得到的菜籽多肽的分子質(zhì)量分布發(fā)生變化，小分子的多肽比例相應(yīng)增加。結(jié)果同時顯示， 膜分離可有效減少或除去硫代葡萄糖甘等抗?fàn)I養(yǎng)因子，使用截留分子質(zhì)量3000 u的膜對菜籽粕酶解產(chǎn)物進行超濾和透析過濾，當(dāng)超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數(shù)均為2時，產(chǎn)物的硫代葡萄糖昔含量從 1.36 mg/g降低到0

2、.39 mg/g。 關(guān)鍵詞菜籽亞硫酸鈉蛋白質(zhì)水解 水解度中圖分類號：TS201.2文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1003-0174 ()-隨著世界人口增長和食物來源減少促使人們研究開發(fā)新的植物蛋白資源，其中對于油籽食用蛋白的開發(fā)已引起人們越來越大的興趣。菜籽是重要油料作物， 世界年產(chǎn)量已超過 4000萬噸，中國、印度和加拿大是主要生產(chǎn)國。菜籽提油后的粕中含有40 50%的蛋白，且菜籽蛋白氨基酸組成平衡，符合FAO要求，因此菜籽粕可能成為食用蛋白的合適來源1,2。由于菜籽粕中還存在硫代葡萄糖甘，植酸和多酚類等有毒和抗?fàn)I養(yǎng)因子，因此目前主要還是當(dāng)作飼料或肥料使用，只有盡量降低或除去這些有毒和抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，

3、才有可能使菜籽粕作為食用蛋白來源。近年來，蛋白水解物被認(rèn)為是生物活性肽的來源，它們易于被大腸細(xì)胞吸收進入血液， 產(chǎn)生有益的生物活性。已報道的生物活性肽具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗血栓形成和降血壓等生理功能，它們在食品、藥物和化妝品工業(yè)上的應(yīng)用已引起人們廣泛的興趣。由于消費者對于動物蛋白的擔(dān)憂日益增加，因而更偏愛開發(fā)植物多肽。酶水解蛋白是目前制取植物多肽的最重要手段，通過水解可以得到 分子質(zhì)量 大小不同的肽。傳統(tǒng)的制取多肽方法是先通過堿提取酸沉淀法制取分離蛋白，再使用不同的蛋白酶將分離蛋白水解制取肽。由于菜籽蛋白成分復(fù)雜，難溶于水，通常需要使用pH11以上的強堿提取，加之菜籽蛋白等電點范圍廣，提取后加

4、酸調(diào)節(jié)等電點析出的分離蛋白得率較低。本文研究使用堿性蛋白酶 Alcalase直接水解菜籽粕制取肽，利用膜分離除去硫甘等有毒物質(zhì)，同時研究水解時加入低濃度亞硫酸鈉對于反應(yīng)速率的影響。 1材料與方法 1.1材料加拿大菜籽：張家港出入境檢驗檢疫局提供；堿性蛋白酶 Alcalase 2.4 L (活力2.4AU/g):諾維信公司；芥子酶(100units/g): Sigma公司。1.2 試劑及儀器 1.2.1 試齊 IJ石油醛(3060 C),氫氧化鈉，鹽酸，磷酸，檸檬酸，二氯甲烷，氨水，亞硫酸鈉等：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。 1.2.2 儀器JLGJ45檢驗碧谷機：浙江黃巖糧儀廠；L

5、XJ-n離心沉淀機：上海醫(yī)用儀器廠；PHS-3精密pH計：上海雷磁儀器廠；HH-20數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠；L-117實驗室噴霧干燥機：京來亨科貿(mào)有限責(zé)任公司；AKTAPpurifier蛋白純化儀：GEHealthcare Bio-ScienceAB公司；752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司。 1.3實驗方法 1.3.1菜籽脫殼菜籽在碧谷機中碾壓后風(fēng)揚去掉皮層，粉碎，待提取油脂。菜籽脫油使用自制索氏提油裝置提取菜籽油脂，該裝置結(jié)構(gòu)和原理與市售測定含油量用索氏抽提器相同，但進行了相應(yīng)放大，每次

6、提油的脫殼菜籽量為250 g。使用石油醒經(jīng)12 h抽提脫去油脂，室溫晾干除去溶劑得到菜籽粕，粉碎過菜籽粕的主要組分測定去油脂，室溫晾干除去溶劑得到菜籽粕，粉碎過菜籽粕的主要組分測定水分含量的測定GB5497-85(105含油量的測定GB5512-85蛋白質(zhì)含量的測定 GB5511-85灰分含量的測定GB5505-85硫代葡萄糖昔的測定方法按Watter等3的方法測定。準(zhǔn)確稱取樣品80目篩后備用。0c恒重法)0.1 g于10 ml磨口試管中，加入 3 mg芥子酶，1 mL pH7的磷酸檸檬酸緩沖溶液和2.5 mL二氯甲烷，蓋塞后室溫振蕩2 h進行酶解反應(yīng)。將反應(yīng)液以 3000 r/min離心20

7、 min。移取50 L二氯甲烷吸收液加入到 3 mL 20% 氨水乙醇溶液中，50 0c恒溫水浴反應(yīng)2 h,反應(yīng)結(jié)束后冷卻，以 50 L二氯甲烷加3 mL20%氨水乙醇溶液作空白，測定 異硫氟酸酯(ITC)在235 nm、245 nm和255 nm波長處的吸光 度。用3 mL 95%乙醇彳t替20%M水乙醇溶液按上法操作，并以 50科L二氯甲烷加3 mL 95% 乙醇作空白，測定 惡唾烷硫酮(OZT)的吸光度。按下列公式計算硫 昔含量：OD245 校=OD45-(OD235+OD55)/2OZT (mg/g) = OD245校 X22.1ITC (mg/g) = ODm5校X28.55硫昔(m

8、g/g) = OZT + ITC菜籽粕的酶水解將菜籽粕和 0.25%亞硫酸鈉水溶液加入到反應(yīng)容器中，置于水浴加熱至50 C,用4mol/L NaOH節(jié)pH至8.0 ,再加入堿性蛋白酶Alcalase 于攪拌下水解，水解參數(shù)為：基質(zhì)濃度5% (w/v),酶與基質(zhì)比3%, pH 8.0,反應(yīng)溫度50 C。反應(yīng)過程中加入4 mol/L的NaOHWI pH值恒定。反應(yīng)120 min后用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)物 pH至4.3 ,并于50 C維持30 min滅酶。將水解混合物以4000 xg離心20 min除去不溶物，得到上層清液。取樣用凱氏定氮法測定上層清液的蛋白含量，計算蛋白提取率。將上層清液分為兩部分，一部分

9、直接 噴霧干燥得到水解物 P1,另一部分留待膜分離。噴霧干燥時熱空氣的進口溫度為180 C,出口溫度為85 0a另用水代替0.25%亞硫酸鈉水溶液按上法進行酶水解，水解后進行噴霧干燥，得到的水解物作為不加亞硫酸鈉的菜籽蛋白酶水解對照物P2。菜籽蛋白水解液的膜分離上述酶水解時留存的部分水解液使用截留分子質(zhì)量為3000 u的膜進行超濾，以除去亞硫酸鈉、無機鹽和硫 昔等有毒和抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)。膜面積為 0.1 M2,超濾液的溫度為 40 C,超 濾濃縮因子為2,超濾后再進行透析過濾(diafiltration) ,透析過濾體積倍數(shù)為 2。最后將 膜上溶液進行噴霧干燥，得到經(jīng)超濾的蛋白水解物PF1。水解度的

10、測定方法蛋白質(zhì)的水解度(DH是指蛋白質(zhì)中的肽鍵被水解的百分?jǐn)?shù)，其計算公式為： DH% = (h/htot) X100式中h是每克蛋白中被水解的肽鍵的毫摩爾數(shù)，htot則是指每克原料蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)。本實驗采用pH-stat法測定水解過程中的水解度(DH ,即根據(jù)水解過程中為保持反 應(yīng)液pH值不變而加入的 NaOH勺量按下式計算水解度：B XNb11DH(%) =X X，X100MP二htot式中B為保持pH不變而加入的NaOH積(mL), Nb為NaOH的濃度，Mp為蛋白質(zhì)的量 (g), a為水解時a -NH2的平均離解度。凝膠層析測定菜籽肽的分子質(zhì)量分布菜籽肽的分子質(zhì)量分布采用凝膠層析法

11、測定，所用的凝膠柱為Superose 12 10/300GL(10 x 300mm,GEHealthcare Bio-Science Co.,Piscataway,NJ,USA),使用紫外檢測 器于215 nm檢測。洗脫液為 pH等于7的0.15 mol/L NaCl的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，樣 品液先經(jīng)0.45 M膜過濾，進樣量為 500 L,洗脫液流速為 0.8 ml/min 。取牛血清蛋白 (67000 u)、細(xì)胞色素(12700 u)、VB2(1355 u)和氧化型谷胱甘肽(612 u)為分子質(zhì)量 標(biāo) 準(zhǔn)。2結(jié)果與討論2.1膜分離清除菜籽水解物中的硫昔加拿大菜籽粕的主要組分見表

12、1,其蛋白質(zhì)含量較高，值得進一步開發(fā)利用。表1加拿大菜籽粕的主要組分的含量/ %含水率含油率蛋白質(zhì)含量灰分含量9.205.6445.046.78加拿大菜籽粕的硫代葡萄糖 昔含量見表2。硫昔是菜籽粕中影響最大的有害物質(zhì)，在芥子酶作用下水解可生成異硫鼠酸酯和惡陛烷硫酮等有毒物質(zhì) ，這些有毒物質(zhì)的存在使菜籽粕即使用作飼料也受到限制，只有盡量降低或除去硫昔才能有效利用菜籽粕及其蛋白。表 2顯示經(jīng)過Alcalase水解得到的水解物中的硫 昔含量大于菜籽粕，說明硫 昔易溶于水，在酶 水解時被提取到水解液中，使得菜籽蛋白水解物P1中的硫昔含量增加。硫 昔的增加將嚴(yán)重影響蛋白水解物的應(yīng)用。表2同時顯示了膜分離

13、對于硫 昔的去除作用。雖然本實驗?zāi)し蛛x的超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數(shù)都不大，但去除硫昔的效果還是明顯的， 膜分離后硫 昔的含量降到未經(jīng)膜分離處理的28.7%。如果提高超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數(shù)，應(yīng)能進一表2膜分離對菜籽蛋白水解物中的硫音含量的影響/ mg/gOZTITC硫昔菜籽粕0.450.581.03P10.680.681.36PF10.120.270.39步減少水解物的硫昔含量。2.2亞硫酸鈉對Alcalase 水解菜籽粕的速率的影響圖1顯示Alcalase水解菜籽粕時添加亞硫酸鈉對反應(yīng)速率的影響。從圖1可知，不管是否添加N&SO,堿性蛋白酶水解菜籽蛋白在前30 min1可知，不管平

14、穩(wěn)。而添加亞硫酸鈉的水解速度明顯大于不添加的反應(yīng)，且主要體現(xiàn)在前兩者的速度差別較大，之后的 90 min時間里兩者的水解速度差別較小，水解與不加亞硫酸鈉的水解度分別為12.1%口 7.7%,前者是后者的1.6倍。(1)(2)(3)Guerard(1)(2)(3)存在酶抑制酶，它們在水解過程中不斷溶解；30 min水解時30 min水解時120 min時加6亞硫酸鈉本身也容易通過亞硫酸鈉作為一種還原劑能斷裂蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的二硫鍵,亞硫酸鈉本身也容易通過超濾等方法除去，因此低濃度的亞硫酸鈉常用于斷裂食品蛋白中的二硫鍵78。Hamada 報道78。Hamada 報道Vioque等研究菜籽分離蛋

15、白中存在的堿性蛋白酶Alcalase的抑制劑阿，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)的分子質(zhì)量約為18000 u,與菜籽分離蛋白相比，其組成中的含硫氨基酸的含量較高，達(dá)到8.8%,其中半胱氨酸的含量是菜籽分離蛋白的3倍以上，蛋氨酸的含量是后者的 2倍以上，而菜籽分離蛋白的含硫氨基酸含量僅為3.3%。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的研究結(jié)果表明堿性蛋白酶抑制劑分子中存在二硫鍵將含硫單元連接起來，這些二硫鍵可防止抑制劑被蛋白酶水解 11。本實驗中添加亞硫酸鈉的水解速度明顯大于不添加的反應(yīng)，可能由于亞硫酸鈉斷裂二硫鍵的作用，破壞了菜籽蛋白中存在的堿性蛋白酶抑制劑分子，使之失去對于堿性蛋白酶活性的抑制作用；同時，亞硫酸鈉斷裂菜籽蛋

16、白二硫鍵，使得斷裂后的菜籽蛋白分子更容易與蛋白酶接觸，有利于兩者相互作用，從而提高酶水解速率。14圖1 亞硫酸鈉對Alcalase水解菜籽粕的速率的影響亞硫酸鈉對水解物顏色和提取率的影響表3列出了添加和不添加亞硫酸鈉得到的菜籽蛋白酶解物的顏色和提取率。表3亞硫酸鈉對菜籽粕水解物顏色和蛋白提取率的影響顏色蛋白提取率/%P1黃色61.8P2黃棕色54.8表3顯示水解時添加亞硫酸鈉的水解物的顏色較淺。菜籽粕中含有酚類化合物，可在水解和干燥時氧化，使水解物顏色有所加深。 亞硫酸鈉是一種還原劑， 可減少酚類化合物氧化。 從表3可知，水解時添加亞硫酸鈉可提高水解物的蛋白提取率，這可能也是由于添加亞硫酸鈉提

17、高了菜籽蛋白的水解度，使得水解物分子變小，水溶性增加的緣故。凝膠層析結(jié)果分析添加和不添加亞硫酸鈉的菜籽蛋白水解物的凝膠層析結(jié)果見圖2和圖3。比較兩圖可知，未添加亞硫酸鈉的水解物在凝膠柱中先流出的組分含量較高，按照凝膠層析分離原理，這部分組分的分子質(zhì)量 較大，意味著未添加亞硫酸鈉的水解物中蛋白質(zhì)和大分子肽的數(shù)量大于添 加亞硫酸鈉的水解物。圖2中10000 u以上的峰面積占33.5%,而圖3中10000 u以上的峰面積僅占7.8%。上述結(jié)果和圖1所示的水解結(jié)果是一致的，即亞硫酸鈉能夠提高 Alcalase 水解菜籽蛋白的速率和水解度。fl3000,8 O度光吸6;42 I o o o O50001

18、00001000/ j J500005.010.015.020.025.030.0洗脫體積/mL圖,8 O度光吸6;42 I o o o O5000100001000/ j J500005.010.015.020.025.030.0洗脫體積/mL圖2不添加亞硫酸鈉的菜籽蛋白水解物的凝膠層析圖注：圖中數(shù)據(jù)為分子質(zhì)量2.03000I I5 O度光吸500010000.5/ I _，一500001000000.05.010.15.20.25.30.洗脫體積/mL圖3添加亞硫酸鈉的菜籽蛋白水解物的凝膠層析圖 注：圖中數(shù)據(jù)為分子質(zhì)量3結(jié)論(1)用堿性蛋白酶alcalase水解菜籽粕制取多肽時，可使用膜分

19、離有效除去硫 甘等有害物質(zhì)。(2)菜籽粕水解時添加低濃度亞硫酸鈉可明顯增加酶水解速率，提高蛋白提取率，同時水 解物顏色較淺。(3)凝膠層析顯示alcalase 水解菜籽粕制取多肽時添加亞硫酸鈉可減少大分子多肽的比例。Study on Preparation of Peptides by Hydrolysis of Rapeseed Mealwith Alcalase in the Presence of Sodium SulfiteAbstract Peptides were prepared directly by hydrolysis of rapeseed meal with Alcal

20、ase. Effects of sodium sulfite on proteolysis and separation of glucosinolate by membrane processing were investigated. Results indicate that sodium sulfite can increase the activity of Alcalase and changethe molecular weight distribution of hydrolysates with more proportion of smaller peptides by d

21、isulfide bond cleavage in protein molecules and by possible impact on Alcalase inhibitors. Results also show that glucosinolate can be reduced or eliminated by membrane processing. When hydrolysate of rapeseed meal was ultrafiltrated and diafiltrated with a membrane of 3 kilodaltons molecular weight

22、 cut-off and with both the concentration factor of ultrafiltration and the diavolume of diafiltration of 2, the glucosinolate content of the retentate was decreased to 0.39 mg/g from 1.36 mg/g in the hydrolysate.Key words rapeseed, sodium sulfite, proteolysis, degree of hydrolysis參考文獻Pastuszewska B,

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