1、免疫組化一，免疫組織化學(xué)簡介免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)炕原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。二，免疫組化技術(shù)的基本原理免疫組化技術(shù)是一種綜合定性、定位和定量；形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測(cè)技術(shù)。在原位檢測(cè)出病原的同時(shí)，還能觀察到組織病變與該病原的關(guān)系，確認(rèn)受染細(xì)胞類型，從而有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和

2、病理過程。免疫酶組化技術(shù)是通過共價(jià)鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標(biāo)記的抗體可以是用免疫動(dòng)物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強(qiáng)的高效價(jià)的單克隆抗體。直接法是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。三，免疫組化步驟1，切片，烤片60，1h；2，脫蠟及復(fù)水二甲苯10min，100乙醇5

3、min，95乙醇5min，90乙醇5min，85乙醇5min，80乙醇5min， 75乙醇5min，60乙醇5min，50乙醇5min，30乙醇5min，自來水1min，雙氧水1min；3，1份30H2O2加10份蒸餾水，室溫10min，蒸餾水洗3次，每次3min；4，微波修復(fù)將切片浸入0.01M枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力（98-100）加熱至沸騰，冷卻（約5-10min），反復(fù)兩次；5，將切片自然冷卻至室溫，PBS洗滌3次，每次5min；6，封閉，5BSA，室溫20min，甩去多余液體；7，滴加一抗，37，1h，或者4過夜；8，PBS洗滌3次，每次3min；9，滴加二抗，37，15-30m

4、in；10，PBS洗滌3次，每次3min；11，滴加SABC，37， 30min；12，PBS洗滌3次，每次5min；13，1ml蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻；14，DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間（約5min）；15，自來水沖洗干凈，過蒸餾水；16，蘇木素復(fù)染2min，自來水沖洗；17，脫水30乙醇3min，50乙醇3min，70乙醇3min，80乙醇3min，90乙醇3min，95乙醇3min，100乙醇3min，二甲苯20min；18，樹膠封片，鏡檢。四，免疫組化常見問題分析1，石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象 1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時(shí)間和提高

5、烤片溫度； 2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做； 3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織； 4）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。2，邊緣效應(yīng)1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫

6、圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。3，產(chǎn)生組織切片非特異性染色 1）抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條；2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；5）DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高；6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸

7、洗尤為重要；7）標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。4，免疫組化染色呈陰性結(jié)果 1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤； 2）抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)；3）組織切片本身這種抗原含量低；4）血清封閉時(shí)間過長；5）DAB孵育時(shí)間過短；6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)；7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問題。5，背景1，考慮一抗?jié)舛雀撸?，然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；3，也要考慮血

8、清封閉時(shí)間是否過短；4，適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時(shí)間等。 免疫組化的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)（1）常見問題免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。1、免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。2、石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些

9、方法？石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。3、 免疫組化常用的染色方法有哪些？根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位

10、，其中生物素抗生物素染色法最常用。4、 抗體的保存： 抗體儲(chǔ)存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲(chǔ)存的抗體中蛋白濃度很低（10-100mg/L），就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對(duì)抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4-8條件下，以免凍融對(duì)抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)?？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對(duì)避免用高溫快速解凍。被細(xì)菌污染的抗體常會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉

11、?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20以下可保存3-5年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會(huì)丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，可在4下保存數(shù)月。多聚賴氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution）多聚賴氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的黏合力。適用組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰凍切片，細(xì)胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實(shí)驗(yàn)操作過程中組織掉片。也可用于細(xì)胞培養(yǎng)，增加細(xì)胞貼壁能力。 操作步驟（可直接在玻片上涂布）1 滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。

12、2 用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-263 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時(shí)間不會(huì)提高包被效果。4在60烘箱1小時(shí)干燥，或室溫18-26過夜干燥待用。注意1 每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張， 超過90張片子將影響其黏合力。2 用之前的玻片必須保持清潔。必要時(shí)用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。4 釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8，至少在3個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。5 用過的稀釋液要過濾，若出現(xiàn)渾濁或長菌要丟棄。免疫組化的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)（2）操作規(guī)程（一）、儀器設(shè)備 1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐； 2）水浴鍋（二）、試劑 1

13、）PBS緩沖液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。 5）

14、酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱劑： a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.09.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.09.5，適用于熒光顯微鏡標(biāo)本；pH7.07.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。 （三）、操作流程 1、脫蠟和水化 脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60恒溫箱中烘烤20分鐘。 1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘； 2）無水乙

15、醇中浸泡5分鐘；3）95%乙醇中浸泡5分鐘；4）70%乙醇中浸泡5分鐘； 2、抗原修復(fù) 用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。 1）抗原熱修復(fù) （1）高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。 （2）煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95左右，放入組織芯片加熱1015分鐘。 （3）

16、微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔510分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase等。是以高溫，高壓對(duì)常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)或復(fù)原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測(cè)的一種方法和技術(shù)手段。甲醛和蛋白水解交聯(lián)過程中氨基酸側(cè)鏈上的某些基團(tuán)(抗原決定簇)如咪唑、吲哚等基團(tuán)受到影響，通過120高溫或強(qiáng)堿處理后，可使交

17、聯(lián)打開。 2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37，切片也預(yù)熱至37，消化時(shí)間約為530分鐘；胃蛋白酶消化37時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 3、免疫組織化學(xué)染色 SP法 1）脫蠟、水化； 2）PBS洗23次各5分鐘； 3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘； 4）PBS洗23次各5分鐘； 5）抗原修復(fù)； 6）PBS洗23次各5分鐘； 7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。 8）滴加抗50

18、l，室溫靜置1小時(shí)或者4過夜或者371小時(shí)。 9）4過夜后需在37復(fù)溫45分鐘。 10）PBS洗3次各5分鐘； 11）滴加抗4050l，室溫靜置，或371小時(shí)； 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 13）PBS洗3次各5分鐘； 14）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度； 15）PBS或自來水沖洗10分鐘； 16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化； 17）自來水沖洗1015分鐘； 18）脫水、透明、封片、鏡檢。 SABC法 1)脫蠟、水化。 2)PBS洗兩次各5分鐘。 3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉510分鐘，蒸餾水洗3次。 4)抗原修復(fù)。 5)PB

19、S洗5分鐘。 6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。 7)滴加抗,室溫1小時(shí)或者4過夜或者371小時(shí)（4過夜后在37復(fù)溫45分鐘）。 8)PBS洗三次每次2分鐘。 9)滴加生物素化二抗,203720分鐘。 10)PBC洗3次每次2分鐘。 11)滴加試劑SABC，203720分鐘。 12)PBS洗4次每次5分鐘。 13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。 14)蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。 15)脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)（3）操作要點(diǎn)和技巧1 固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮

20、好；但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購置前注意說明書。Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長期保存。PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。2 組織脫水，透明：時(shí)間不能太長，否則在切片時(shí)容易碎片，切不完整。3切片時(shí)展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?烤片：60 30分鐘或37 過夜，

21、溫度太高或時(shí)間太長，抗原容易丟失。5蠟塊及切片的保存：最好在4保存6脫片問題： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。7滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。8暴露抗原：對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用高溫加熱抗原修

22、復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的最佳修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說明書)。對(duì)于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。9封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉10抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。11背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1 Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。12返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返

23、藍(lán)。13顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。DAB法顯示過氧化物酶原理 過氧化物酶分解H2O2的過程中，下面反應(yīng)不直接發(fā)生：AH2（供氫體）+H2O2A（供氫體的氧化物）+2H2O2實(shí)驗(yàn)可知，有稱為復(fù)合物 、的酶底物（受氫體）復(fù)合體生成，在復(fù)合體最后分解為酶和水時(shí)，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團(tuán)的發(fā)色物質(zhì)，如奈酚和聯(lián)苯胺。 免疫組化染色步驟（以ABC法為例）溶液的配置：1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份2. 檸檬酸鹽緩沖液：貯存液：0.1M檸檬酸溶液（A）：21.01g 檸檬酸 + 1L 蒸餾水 0.1M檸檬酸三鈉溶液（B）：29.41g 檸檬酸三鈉 + 1L 蒸餾水工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸餾水0.01M檸檬酸鹽緩沖液3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 純甲醇充分混勻4. 20% 甘油：80ml 純甘油 + 320ml 蒸餾水5. 稀釋抗體：1300 ，1400 ，1600 （臨用前配）6. 酒精的配置染色步驟：一步法1. 載玻片 烤箱中 60 40。2. 二甲苯，60 20(水浴箱中)，二甲苯，室溫