1、蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法編制說(shuō)明(征求意見(jiàn)稿)一、任務(wù)來(lái)源本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)二。一五年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)“ 20154061-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出 并歸口， 定于2016年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、浙江工商大學(xué)等單位共同組成。二、目的及意義絲氨酸蛋白酶是一類(lèi)裂解肽鍵的蛋白酶，其活性中心的親和氨基酸為絲氨酸，它們?cè)谏镉袡C(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用。絲氨酸蛋白酶超家族被分為胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶兩個(gè)大家族，蛋白酶K( EC 3.4.21.14)屬于枯草桿菌蛋白酶家族，是由林伯氏白色念球菌( Trit

2、irachium album Limber) 產(chǎn)生的一類(lèi)主要蛋白酶。因其能消化角蛋白(keratin),故將其稱(chēng)作蛋白酶K。蛋白酶 K 擁有典型的絲氨酸活性位點(diǎn)：Asp39-His69-Ser224 。蛋白酶K 具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、極高的酶活力和廣泛的底物特異性，但偏好于帶有脂肪族及芳香烴的肽鏈，能優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端連接的肽鍵，因而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和科學(xué)研究領(lǐng)域，也因此吸引了來(lái)自學(xué)術(shù) 界、工業(yè)和農(nóng)業(yè)團(tuán)體的研究興趣。基因工程技術(shù)的發(fā)展依賴(lài)于生物技術(shù)用的一些酶類(lèi)，這些酶對(duì)與基因工程技術(shù)的作用，就如同CPU 對(duì)與電腦的重要性一樣，它們是現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中用于研究

3、和開(kāi)發(fā)基因工程產(chǎn)品和分子生物學(xué)研究的最基礎(chǔ)物質(zhì)。如果我國(guó)沒(méi)有獨(dú)立的生物技術(shù)用酶的生產(chǎn)體系，就不會(huì)有獨(dú)立的現(xiàn)代化生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。作為一個(gè)大國(guó)，我國(guó)應(yīng)該建立自主的蛋白酶K 生產(chǎn)體系，以適應(yīng)生物產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。在政府監(jiān)管中，標(biāo)準(zhǔn)的重要價(jià)值在于它架起了法律與科學(xué)之間的橋梁，提高了行政決定過(guò)程的公開(kāi)性與結(jié)果的準(zhǔn)確性，為規(guī)范和控制行政裁量權(quán)提供了工具。目前我國(guó)在誠(chéng)信制度沒(méi)有健全、存在巨大經(jīng)濟(jì)利益誘惑的情況下，對(duì)于生物產(chǎn)業(yè)的監(jiān)督，政府主管部門(mén)才是最有公信力和最能承擔(dān)責(zé)任的。因此，開(kāi)展蛋白酶K 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究是政府實(shí)施科學(xué)監(jiān)管、有效監(jiān)管的必要技術(shù)支撐。通過(guò)研究制定基因工程常用蛋白酶K 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，有利于加快分子生物

4、學(xué)實(shí)驗(yàn)的速度、提高分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，從而提升整體分子生物學(xué)研發(fā)水平，產(chǎn)生廣泛的社會(huì)效益。建立我國(guó)獨(dú)立自主的蛋白酶K 工業(yè)系統(tǒng)，即可創(chuàng)造出可觀的經(jīng)濟(jì)效益又能解決我國(guó)目前主要依賴(lài)國(guó)外進(jìn)口蛋白酶K的問(wèn)題，突破國(guó)內(nèi)生物技術(shù)酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展受制于人的瓶頸。要對(duì)所檢測(cè)的產(chǎn)品或相關(guān)過(guò)程的特性進(jìn)行符合性判定，就需要制定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。要對(duì)產(chǎn)品或相關(guān)過(guò)程的特性進(jìn)行定量檢測(cè)，就需要依據(jù)經(jīng)過(guò)科學(xué)評(píng)估的、可重復(fù)的、公認(rèn)的檢測(cè)方法。目前，基因工程進(jìn)步如此之快，對(duì)相關(guān)的定性定量分析方法進(jìn)行全面的分析方法的驗(yàn)證非常有必要，只有可靠穩(wěn)定的系列檢測(cè)方法才能得出可靠的結(jié)果，才能保障這一新興的產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。在我國(guó)涉及蛋白酶

5、酶活力測(cè)定方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，提供的方法具有普適性，然而其各種參數(shù)設(shè)定范圍寬，針對(duì)性差。這就導(dǎo)致不同廠商的蛋白酶K 酶活力單位定義不統(tǒng)一，從而無(wú)法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量做出準(zhǔn)確的判定，繼而影響到其合理的使用。因此，亟待系統(tǒng)研究并確定蛋白酶K 酶活力測(cè)定體系中的各項(xiàng)參數(shù)，以建立蛋白酶K 酶活力測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。目前，可用于蛋白酶K 活力檢測(cè)的方法很多，但到目前為止，國(guó)家尚未發(fā)布相關(guān)蛋白酶K 活力檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)，這給人們使用蛋白酶K 帶來(lái)很大的不變，而且不同的生產(chǎn)廠家因其檢測(cè)方法不同，故對(duì)蛋白酶K 的酶活力定義也不同，使得使用者無(wú)法對(duì)不同廠家的蛋白酶K 活力進(jìn)行正確的評(píng)價(jià)與比較，為購(gòu)買(mǎi)與使用帶來(lái)困難。因此，

6、對(duì)其活性檢測(cè)方法的需求也越來(lái)越迫切，蛋白酶K 活性檢測(cè)方法的建立，將為更多的行業(yè)使用蛋白酶 K 帶來(lái)很大的便利。三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則及主要內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)的制定過(guò)程中采用文獻(xiàn)調(diào)查法、專(zhuān)家座談法、科學(xué)試驗(yàn)法等多種研究方 法，方法科學(xué)先進(jìn)、過(guò)程周密?chē)?yán)謹(jǐn)、數(shù)據(jù)真實(shí)可信、結(jié)果明確。本標(biāo)準(zhǔn)是為相關(guān)組織的蛋白酶K檢測(cè)提供技術(shù)支撐，考慮到生產(chǎn)、監(jiān)管等不同需求， 在方法選擇上，主要基于產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、現(xiàn)有成熟的技術(shù)以及試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證基礎(chǔ)確定的，因此實(shí)用性較強(qiáng)。（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)1、標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)遵循GB1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則的有關(guān)要求。2、標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)內(nèi)容參考了與蛋白酶 K檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)參照

7、了 GB/T6379.1- 2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第1 部分 總則與定義和 GB/T 6379.2-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度第2部分 確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。3、本標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法參考了GB/T 28715-2012飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測(cè)定-分光光度法和SB/T 10317-1999蛋白酶活力測(cè)定法中的酶活力和酶活力單位的定義和檢測(cè)流程，還借鑒了Sigma公司和Merk公司有關(guān)蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的文件。同時(shí)，通過(guò)系統(tǒng)地試驗(yàn)，驗(yàn)證了適于蛋白酶K 酶活力測(cè)定的底物種類(lèi)、反應(yīng)體系pH 值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和酶濃度。（三）本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容

8、本標(biāo)準(zhǔn)主要包括以下7 個(gè)部分：（1） 范圍；（2） 術(shù)語(yǔ)和定義；（3） 原理；（4） 儀器設(shè)備及器具；（5） 主要試劑；（6） 分析步驟；（7） 結(jié)果分析等。四、主要工作過(guò)程（一）組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂有關(guān)程序和要求，2015 年 10 月下旬，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院主持召開(kāi)了蛋白酶K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定研討會(huì)。會(huì)上，組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要求，安排了工作進(jìn)度，成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，會(huì)議研究討論了蛋白酶K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法初稿，對(duì)起草小組在標(biāo)準(zhǔn)起草過(guò)程中的一些思考及難點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行了深刻討論，各單位代表就標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容及方法選擇進(jìn)行了討論。（二）開(kāi)展相關(guān)調(diào)研情況蛋白酶

9、 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)屬于生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，是支撐生產(chǎn)方、 第三方組織開(kāi)展產(chǎn)品評(píng)價(jià)的技術(shù)依據(jù)。起草工作小組首先針對(duì)生產(chǎn)和檢測(cè)開(kāi)展了大量的調(diào)研工作。從滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)需要出發(fā)，開(kāi)展了國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料的收集和確認(rèn)工作，資料的檢索和信息的收集過(guò)程中，分析比較了大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)方法。（三）標(biāo)準(zhǔn)起草完善過(guò)程在廣泛調(diào)查研究的基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)蛋白酶K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研，課題組成員廣泛收集了國(guó)內(nèi)外蛋白酶K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)，了解了國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)動(dòng)態(tài)，并且明確了工作思路和進(jìn)程安排，分析了通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)摸索、反復(fù)論證，確定了本標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)定的重要參數(shù)，

10、開(kāi)展了實(shí)際樣品的檢測(cè)。然后依據(jù)GB/T 1.1 2000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則、GB/T 1.2 2002標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 2 部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定方法等標(biāo)準(zhǔn)編制要求，對(duì)蛋白酶K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展了起草工作。于2016 年 3 月中旬， 起草工作小組完成了蛋白酶K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) （草案） 。2016 年 6 月，在北京組織有關(guān)單位和專(zhuān)家分別召開(kāi)了標(biāo)準(zhǔn)草案討論會(huì)，重點(diǎn)對(duì)蛋白酶 K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法選擇提出了完善建議。同時(shí)對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，針對(duì)驗(yàn)證所出現(xiàn)的問(wèn)題，在2016 年 11 月 11 組織專(zhuān)家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)逐字逐句進(jìn)行了討

11、論完善，形成了蛋白酶K 酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿。五、國(guó)內(nèi)外研究概況通過(guò)測(cè)試蛋白酶K 水解經(jīng)尿素變性的血紅蛋白的酶活性，顯示出蛋白酶K在pH7.5-12.0范圍內(nèi)都具有較高的酶活性。目前蛋白酶 K通常使用的pH范圍是 7.5-9.0，蛋白酶K 的最適 pH 是 8.0。在37時(shí)，蛋白酶K 顯示出最高的活性，在 20-60之間蛋白酶K 的酶活性可保持在80%以上。Shu-Qun Liu 等人探討了蛋白酶 K 在催化過(guò)程中動(dòng)力學(xué)機(jī)制，提出了在蛋白酶K 的催化三分子中，Asp39和His69以及His69和eSer224之間靜電和氫鍵的相互作用，使得一些在催化 過(guò)程中起到不同功能的催化

12、殘基，具有不同的熱動(dòng)力學(xué)和取向。之后，陶燕分別對(duì)沒(méi)有底物結(jié)合的蛋白酶K 和結(jié)合了肽底物AAPA 的蛋白酶K 進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬，以研究底物結(jié)合對(duì)蛋白酶K 的動(dòng)力學(xué)行為和分子運(yùn)動(dòng)特征的影響。結(jié)果顯示，在動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中，與底物結(jié)合的蛋白酶K 比沒(méi)有底物結(jié)合的蛋白酶K 具有更加致密穩(wěn)定的構(gòu)象。提出了大尺度的協(xié)同運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致的底物結(jié)合口袋動(dòng)力學(xué)行為與底物的識(shí)別、結(jié)合、定位以及產(chǎn)物的釋放相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn) 底物結(jié)合口袋區(qū)域運(yùn)動(dòng)模式可以調(diào)整酶與底物之間的動(dòng)態(tài)相互作用。補(bǔ)充了前 人的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)果，從分子運(yùn)動(dòng)和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)角度闡釋了 蛋白酶 K 的催化機(jī)制。蛋白酶K含有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，距

13、離酶的活性中心有一定的距離，它們 與催化機(jī)理并無(wú)直接關(guān)系，但當(dāng)用 EDTA去除Ca2+之后，催化活性將在6 h之內(nèi) 降低至原來(lái)的20%,這是由于Ca2+的去除引發(fā)了底物識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)象的改變。同 時(shí)Ca2+的去除會(huì)影響氯甲烷類(lèi)較長(zhǎng)肽抑制劑的結(jié)合，提高了 48 h之后的自溶 率，降低了蛋白酶K的熱穩(wěn)定性等。蛋白酶K在抑制劑如尿素和SDS存在時(shí)仍 能保持較高的穩(wěn)定性。在除去Ca2+后其剩余活性通常不足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)，所以蛋白酶 K消化過(guò)程中通常加入 EDTA。但是，如果 要消化對(duì)蛋白酶K 具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類(lèi)，則可能需要使用含有1mmol/LCa2+而不含EDTA的緩

14、沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA(pH8.0)至終濃度為2mmol/L,以鰲合Ca2+。蛋白酶 K 是一種絲氨酸蛋白酶，因此可以用苯甲基磺酰氟抑制其作用，苯 甲基磺酰氟是一種絲氨酸蛋白酶的抑制劑，在純化蛋白質(zhì)時(shí)用于防止蛋白質(zhì)的降 解 。 此 外 ， Anilkumar R. Kore 等 人 合 成 了 一 種 五 肽 化 合 物 ， 即 MeOSuc-AAAPF-CH 2Cl,可以抑制蛋白酶K的水解活性，濃度僅需要 0.1mM。 J trgen Bajorath等人用單肽或二肽氯甲基酮對(duì)蛋白酶 K進(jìn)行了處理，發(fā)現(xiàn)該化合 物對(duì)蛋白酶K 的水解起到了一定的抑制作用?？捎糜诘鞍酌窴 活

15、力檢測(cè)的方法有以下幾種，每種實(shí)驗(yàn)方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇適合的檢測(cè)方法。（ 1）紫外可見(jiàn)分光度法。該法是以酪蛋白為底物，在一定pH 和溫度下反應(yīng)后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定275nm 處的吸光值，從而檢測(cè)酶活力。紫外分光光度計(jì)為目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室普遍擁有的儀器設(shè)備，采用紫外分光光度法檢測(cè)蛋白酶 K 活性簡(jiǎn)單易行便于實(shí)施。（ 2）福林酚試劑法。該法實(shí)質(zhì)上是在一定溫度，一定pH 下，一定時(shí)間內(nèi)，蛋白酶K 以酪蛋白或變性血紅蛋白為底物，將其水解成氨基酸，以測(cè)定氨基態(tài)氮的量來(lái)衡量蛋白酶活力的數(shù)值，即用分光光度計(jì)測(cè)定680nm 處的吸光值，從而測(cè)定蛋白酶K 的酶活力。該法操

16、作簡(jiǎn)單，靈敏度較高，但測(cè)定中蛋白質(zhì)特異性有影響，即不同的蛋白質(zhì)因所含酪氨酸和色氨酸不同，顯色時(shí)其強(qiáng)度稍有差別。 另外， 本法受多種因素干擾，凡對(duì)雙縮脲反應(yīng)起干擾作用的基團(tuán)以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液均可干擾福林-酚反應(yīng)。所測(cè)氨基酸樣品若含酚類(lèi)和檸檬酸也干擾福林-酚反應(yīng)，在測(cè)試時(shí)應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗(yàn)。（ 3）紫外光譜定量測(cè)定法。張寒俊等人建立了用紫外光譜法定量測(cè)定蛋白酶 K 活力的新方法：采用不同pH 值的磷酸氫二鈉和檸檬酸溶液作為緩沖溶液，使用紫外光譜法測(cè)定蛋白酶 K的活力。該方法與福林-酚法比較，相對(duì)偏差0 1%, 在允許誤差范圍內(nèi)，操作便捷、快速，試劑易得，可廣泛適用于蛋白酶K

17、的活力測(cè)定。（4）以 Suc- （Ala） 3-NH-Np 或 Suc-（Ala）2-Pro-Phe-pNA 等試劑為底物，在一定溫度和pH 下反應(yīng)后用冰醋酸終止反應(yīng)，410nm 測(cè)吸光值確定酶解反應(yīng)釋放的硝基苯胺的量，從而檢測(cè)酶活性。5）以酪蛋白或牛血清白蛋白為底物，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白酶活力， 以水解后剩余的蛋白質(zhì)含量來(lái)表達(dá)酶的活力?？捡R斯亮藍(lán)法不能直接反應(yīng)出酶活 力。（6） DNA/澳乙錠熒光分析法。當(dāng)澳乙錠插入雙鏈 DNA的堿基對(duì)之間時(shí)， 可使DNA的熒光性增加，具熒光增加量與DNA的量成正比。組蛋白與DNA的 親和力很強(qiáng)，組蛋白結(jié)合到 DNA的所有結(jié)合位點(diǎn)上，使澳乙錠不能與 DNA

18、結(jié) 合，從而熒光性降低。加入蛋白酶后水解組蛋白，使熒光性增加，通過(guò)測(cè)定熒光 增加量來(lái)計(jì)算酶活力。此方法雖提高了底物特異性，但其操作復(fù)雜，儀器設(shè)備和 試劑均較為昂貴，不適宜普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行酶活測(cè)定。（7）流動(dòng)注射分析法（FIA）。用熒光素異硫氟酸鹽標(biāo)記底物牛血清白蛋 白（BSA）,然后將標(biāo)記的BSA偶聯(lián)到2-F-1甲基叱噬（FMP）活化的分離膠上， 制成分析柱，當(dāng)酶液流過(guò)分析柱時(shí)，將 BSA上的熒光基團(tuán)解離下來(lái)，通過(guò)熒光 光度計(jì)檢測(cè)酶解流出液的熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定蛋白酶活力。 該方法測(cè)定酶活力時(shí)所具 有的優(yōu)缺點(diǎn)同（6）所示。六、關(guān)鍵試驗(yàn)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)說(shuō)明6.1 主要儀器與設(shè)備721G型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上

19、海儀電分析儀器有限公司），單孔四列型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司），PHS-3DW型pH計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司），GL-20GR型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）等。6.2 主要材料與試劑（1）底物：酪蛋白（Solarbio公司），角蛋白（梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有 限公司），血紅蛋白（源葉生物公司），組蛋白，牛血清白蛋白（ BSA）,明膠0（2）蛋白酶：蛋白酶K,堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，胰蛋白酶，偽胰凝乳蛋白酶。（3）其它試劑：L-酪氨酸，三氯乙酸（TCA）,無(wú)水碳酸鈉，三羥甲基氨基甲烷（Tris）,磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，濃鹽酸，福林試劑（2N）,化學(xué)試劑

20、均為分析純6.3主要試驗(yàn)方法6.3.1 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線參考GB/T 28715-2012分光光度法測(cè)定。精確稱(chēng)取預(yù)先于 105 c干燥至恒 重的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1000 g± 0.0002g,用1 mol/L鹽酸?§液20 ml溶解后，用 蒸儲(chǔ)水定容至100 ml,即為1 mg/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（04c保存）。準(zhǔn) 確吸取1 mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液10.0 mL,用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL,即得到100卜g/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。按表1配置L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液。表1 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配置酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度（g/m）酪

21、氨酸儲(chǔ)備液體積（ml）蒸儲(chǔ)水體積（ml00010.0110.01.09.0220.02.08.0330.03.07.0440.04.06.0550.05.05.0660.06.04.0770.07.03.0880.08.02.0990.09.01.010100.010.00分別吸取L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1.0 ml于具塞試管中（每個(gè)濃度作2個(gè) 平行試驗(yàn)），各加碳酸鈉溶液5.0 ml和稀福林試劑1.0 ml,震蕩均勻。同時(shí)置于 在40 C水浴鍋中顯色20 min。取出，迅速冷卻至室溫，于分光光度計(jì)波長(zhǎng)680 nm下測(cè)其吸光值，以0號(hào)管作為空白調(diào)儀器零點(diǎn)。以橫坐標(biāo)為L(zhǎng)-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度C (

22、pg/mL),縱坐標(biāo)則為吸光值 A680繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如下圖1所示。r=xs 三 ; 5q<L酪氨酸法度（咫/mL）ilie coucciLLriiLiun of L-Lyiosme圖1 LM氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線6.3.2 蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物的確定6.3.2.1 底物溶液的配制由于不同的蛋白質(zhì)底物的溶解性不同，故不同的底物溶液配制方法有差異。除測(cè)定堿性蛋白酶的底物用0.1 mol/L的硼酸緩沖液(pH 10.0)配制以外，測(cè)定 其他蛋白酶的底物均用磷酸緩沖液(PBS配制。(1) 1%酪蛋白溶液，1%明膠溶液準(zhǔn)確稱(chēng)取酪蛋白/明膠1.000 g,精確到0.001 g,加入0.1 mol/L氫氧

23、化鈉5.0 mL濕潤(rùn)后，再加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH為受試酶的最適pH) 80 mL,于 磁力攪拌器上邊加熱邊攪拌30 min,直至完全溶解。冷卻后，用 0.1 mol/L鹽酸 或0.5 mol/L氫氧化鈉，單向調(diào)整pH至磷酸緩沖液pH值，并轉(zhuǎn)移到100 mL容 量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度。4 c冷藏備用。(2) 1%角蛋白溶液用0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH為受試酶的最適pH）將5%濃度的角蛋白試 劑稀釋至1%, 4 c冷藏備用。(3) 1%血紅蛋白溶液，1%BSA容液，1%組蛋白溶液分別準(zhǔn)確稱(chēng)取血紅蛋白，BSA 組蛋白1.000 g,用0.1 mol/L的PBS （

24、pH為 受試酶的最適pH）溶解并定容至100 mL, 4 c冷藏備用。6.3.2.2 蛋白酶溶液的配制分別準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)蛋白酶 0.0010 g,以0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH為受試 酶的最適pH,見(jiàn)表2）配制成1.0 mg/mL的樣品酶液，再稀釋至適宜的濃度作為 待測(cè)酶液。6種蛋白酶的最適反應(yīng)溫度及 pH見(jiàn)表2。表2受試蛋白酶的最適反應(yīng)溫度與pH酶種類(lèi)蛋白酶K木瓜蛋白酶菠蘿蛋白酶紀(jì)胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶堿性蛋白酶反應(yīng)溫度/c374055373745pH7.56.07.27.28.010.0注：中性蛋白酶以磷酸緩沖液配制并稀釋至適宜濃度，堿性蛋白酶以硼酸緩沖液配制并稀釋。6.3.2.3 蛋

25、白酶活力檢測(cè)方法參考GB/T 28715-2012分光光度法測(cè)定6種蛋白酶酶活力。6.3.2.4 底物種類(lèi)對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響選擇適宜濃度的蛋白酶K溶液，分別以酪蛋白，角蛋白，血紅蛋白，BSA組蛋白為底物，于37 c下反應(yīng)10 min,測(cè)定酶活力；以相應(yīng)底物對(duì)其他蛋白酶 酶活力測(cè)定的影響為對(duì)照，研究底物種類(lèi)對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響。各種蛋 白酶反應(yīng)的最適溫度和pH參照表2。（ 1）配制 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液（pH 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0），并以各pH值緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K溶液（0.01mg/mL）,按照 6.3.2.3方法在

26、 37 水浴中反應(yīng)10 min 后， 離心后取上清液，顯色， 檢測(cè)酶活力。（ 2）配制 0.01 mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液（pH 7.1、 7.5、 8.0、 8.5、 8.9），并以各 pH 值緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K 溶液（0.01mg/mL），按照 6.3.2.3方法在 37 水浴中反應(yīng)10 min 后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)酶活力。6.3.4 蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的最適溫度的確定（ 1）在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以pH 8.0 的 0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL）,按6.

27、3.2.3方法，分別在 27、37、47、57，67水浴10 min 之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶活力。（ 2）在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以pH 8.0 的 0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL）,按6.3.2.3方法，分別在 52、57，62水浴10 min 之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶活力。6.3.5 蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間的確定在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以 pH 8.0的 0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶K酶液（0.01 mg/mL）,按6.3.2

28、.3方法，在57c分別水浴反應(yīng)2， 5 ， 8 ， 10 ， 12 min 之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶活力。6.3.6 蛋白酶 K 酶活力測(cè)定的適宜酶濃度的確定以 pH 8.0的 0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（1%）與蛋白酶 K 酶液（ 0.25, 0.05, 0.01, 0.002 mg/mL）,按 6.3.2.3方法，在 57c分 別水浴反應(yīng)10 min 之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶活力。6.3.7 商品蛋白酶K 制劑酶活力測(cè)定驗(yàn)證以 pH 8.0的 Tris-HCl 緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液（ 1%） 與蛋白酶K 酶液 （

29、 0.01 mg/mL） ， 蛋白酶 K 分別來(lái)自Solarbio， 國(guó)產(chǎn)蛋白酶K， Merck， Calbiochem公司。 按 6.3.2.3方法，在 57分別水浴反應(yīng)10 min 之后， 離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶K 酶活力。6.3.8 蛋白酶酶活力計(jì)算酶活力單位定義：在蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和 pH條件下，1 min水解蛋白 質(zhì)底物釋放1 pmcfi色呈福林試劑陽(yáng)性的氨基酸的酶量， 即為1個(gè)酶活力單位, 以U表小o酶活力計(jì)算公式：從L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的最終稀釋液酶活力。樣 品的酶活力按下式計(jì)算:A 4 V n 1M m 10X:樣品酶活力（U/g） ; A:由L8各氨酸標(biāo)準(zhǔn)

30、曲線讀出的最終稀釋液酶活力 （U/mL） ; V:溶解樣品所使用容量瓶的體積（mL） ; 4:反應(yīng)體系試劑的總體 積（mL） ; n：樣品的稀釋倍數(shù)；M: LU各氨酸的摩爾質(zhì)量（181.20 g/moL） ; m： 樣品的質(zhì)量（g） ; 10:反應(yīng)時(shí)間（min）。6.3.9 重復(fù)性與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)試驗(yàn)取兩份平行樣，每批試驗(yàn)以相同步驟進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。使用 MicrosoftExceL97-2003工作表處理數(shù)據(jù)。6.4主要試驗(yàn)結(jié)果6.4.1 蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物的確定& o O o o O Q o Q 夕 4 2 三二一口£二白|。 -m£我野里白舞種類(lèi)比iz

31、yJ證0圖2酪蛋白對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖2,與其他底物測(cè)得的酶活力相比，在以酪蛋白為底物時(shí)，蛋白酶 K和其他5種蛋白酶測(cè)得的酶活力均最高o o oo o o.<)一li山山，第 與醒種犬改izyni史汕dies圖3角蛋白對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖3,表明角蛋白能較好地反映出微生物蛋白酶（堿性蛋白酶和蛋白酶K）酶活力，而不能反映出植物源蛋白酶（菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶）酶活力。0 0 0ao o o O0 f olirHsslUL 身事 算a-RBffi蛋白電科類(lèi)圖4血紅蛋白對(duì)蛋白酶 K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖4,以血紅蛋白為底物基本能反映蛋白酶 K的酶活力，而不能完全反 映其

32、它蛋白酶酶活力，可用于蛋白酶 K酶活力測(cè)定的底物，且其具有特異性。蚩 3隨種受 enz? in<! speciesWB元好史-1QOO L圖5組蛋白對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖5,以組蛋白為底物時(shí)，各種蛋白酶測(cè)得酶活力極低，蛋白酶K,堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶酶活力甚至呈現(xiàn)負(fù)值。因此，組蛋白不適宜作為蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物。叁 A,-gKUIOAZ1C4000 1蚩白燧腫類(lèi)timmem事由圖6明膠對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖6,以明膠為底物時(shí)，各種蛋白酶測(cè)得酶活力極低，除了胰凝乳蛋白 酶顯示了極低活性，蛋白酶K酶等其它五種蛋白酶活力均呈現(xiàn)負(fù)值。因此，明膠 也不適合作為蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物。200 r100 二二=2=5 BU已R旭益OO圖7 BSA對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖7,以組BSA為底物時(shí)，蛋白酶 K酶活力較低(137 U/g),其相對(duì)酶活力 僅為2.09%,不足以展現(xiàn)蛋白酶 K的酶活力。因此，BSA也不適宜作為蛋白酶 K酶活 力測(cè)定的底物。綜合圖2至圖7的試驗(yàn)結(jié)果，在測(cè)定蛋白酶K酶活力時(shí)，可選擇角蛋白或血紅蛋白 作為底物。結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外蛋白酶