專題突破10綜合PCR的基因工程問題

闡明PCR的原理、反應條件、反應過程；用PCR擴增DNA片段并完成電泳

課標要求

鑒定。

引物的選擇和設(shè)計、PCR

2024?湖南?T152024?山東-T32024?黑吉遼?T7

考情分析擴增結(jié)果的電泳鑒定與分

2023?江蘇?T222022?遼寧?T122022?江蘇?T24

析、PCR的應用

類型一PCR引物堿基序列的設(shè)計

1.土壤鹽漬化影響水稻生長發(fā)育。將水稻耐鹽堿基因。MYB56導入不耐鹽堿水稻品種吉粳

88中，培育耐鹽堿水稻新品種，過程①PCR擴增。SMY856需要添加引物，應選用的引物組

合為（）

?........................OH

HQAGACAACTTATAGTAGGTTC?

放大

含O$MYB56的OsMYB56OsMYBSb

DNA片段

A.5,一CTTGGATGAT-3'和5'—TCTGTTGAAT-3'

B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'—TAAGTTGTCT—3'

C.5'—ATTCAACAGA—3'和5'—ATCATCCAAG-3'

D.5'-ATTCAACAGA-3'和5'—GAACCTACTAT'

答案A

解析圖中所示堿基序列磷酸端為5'端，羥基端為3'瑞,在進行PCR操作時，引物應分

別與基因兩條鏈的3'端結(jié)合，根據(jù)圖中兩端的堿基序列，通常選擇5'-CTTGGATGAT-

3,（上面鏈的引物）和5'-TCTGTTGAAT—3,（下而鏈的引物）作為弓I物對，A符合題意。

2.（2021?湖北，16）某實驗利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實驗結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物

與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應非特異條

帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（）

A.增加模板DNA的量

B.延長熱變性的時間

C.延長延伸的時間

D.提高復性的溫度

答案D

解析增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少反應非特異條帶的產(chǎn)生，A

不符合題意；延長熱變性的時間不影響引物和模板配對，故不能有效減少反應非特異條帶的

產(chǎn)生，B不符合題意：一般根據(jù)待擴增片段的長度適當延長延伸的時間，但延伸時間過長可

能會出現(xiàn)非特異性擴增，C不符合題意；復性溫度過低會造成引物與模板的結(jié)合位點增加，

故可通過提高復性的溫度來減少反應非特異條帶的產(chǎn)生，D符合題意。

3.以下兩組引物設(shè)計的均不合理的原因是_________________________________________

第一組引物］........................

CAGGCT

引物引物II?-------rnr-r-i—1—1----------

AGCCTG

-

第二組./I物I*11111IlliI

n,AACTGCAGTT

引物【引物I【..................................

CGACTGATTA

答案引物I和引物【I局部發(fā)生堿基互補配對而失效，引物「自身折疊后會出現(xiàn)局祟堿基

互補配對而失效

3歸納總結(jié)

引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。引物設(shè)計的優(yōu)劣對PCR

反應的效率和特異性影響很大，引物設(shè)計的原則主要包括：

⑴引物長度一般為20?30bp,可定位目的基因并為子鏈的延伸提供3'端。

（2）引物中CG含量要適宜，CG含量越高，復性（退火）溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。

（3）引物自身、引物之間不能有連續(xù)4個堿基互補，否則引物會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，影

響引物與模板的復性結(jié)合°

（4）引物的5'端可以修飾（添加酶切位點、引入突變序列），但3'端不可修飾（與模板DNA配

對）。

類型二利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物

4.（2024.黑吉遼，7）關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實驗，下列敘述正確的是（）

A.瓊脂糖凝膠濃度的選攔需考慮待分離DNA片段的大小

B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置

C.在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快

D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來

答案A

解析在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，需根

據(jù)待分離DNA片段的大小配制瓊脂糖溶液，故瓊脂糖凝膠濃度的選擇需要考慮待分離DNA

片段的大小，A正確；凝膠載樣緩沖液指示劑通常是一種顏色較深的染料，可以作為電泳進

度的指示分子，B錯誤；DNA片段的遷移速率與其大小成反比，且DNA在包場中從負極向

正極移動，C錯誤：瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在波長為300nm的紫外燈（不是紫光燈）下

破槍測，并且需染色，D錯誤.

S歸納總結(jié)

I.DNA電泳鑒定中的“兩液兩劑”

兩液：電泳緩沖液與凝膠或樣緩沖液。電泳緩沖液能維持整個電泳體系的pH穩(wěn)定，提供導

電介質(zhì)；凝膠載樣緩沖液可影響物質(zhì)的電泳遷移速率，=要用于樣品的稀釋和保護，同時通

過指示劑指示樣品在凝膠中的位置。

兩劑：核酸染料與指示劑。核酸染料是用來染色DNA或RNA分子的一種化學物質(zhì)，以便在

紫外燈-卜觀察和檢測核酸條帶，最常用的核酸染料是溟化乙錠。最常用的指示劑是澳酚藍，

它在電泳凝膠中的遷移速度與DNA或RNA分子的遷移速度相近。在電泳過程中，澳酚藍通

常位于樣品的前沿，形成一個明顯的藍色條帶，這有助G實驗者判斷電泳是否完成，以及何

時停止電泳。

2.DNA遷移速率的影響因素

(1)凝膠濃度：凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，DNA遷移

受到的阻力越大，速率越慢。

(2)DNA分子的大?。篋NA的分子量越大，遷移速率越慢。

(3)DNA分子的構(gòu)象：三種構(gòu)象的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳的前后順序為環(huán)形超螺旋(DNA兩條

鏈都是完整的質(zhì)粒)〉線形)開環(huán)(DNA雙鏈斷了一條成為於弛的環(huán))。

類型三利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式——正向連接和反向連接

5.(2019?江蘇，33節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬

設(shè)計引物進行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應位置，PCR

鑒定時應選擇的一對引物是。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴

增出了400bp片段，原因是o

答案乙、因目的基因反向連接

解析分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲

和丙這對引物，則無論目的基因是否正確插入，擴增的片段都是50+300+100=450(bp),不

符合要求；如果選擇乙和丙這對引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應選擇乙

和丙這對引物進行PCR鑒定。如果目的基因和質(zhì)粒反向連接，則引物乙會出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的

外側(cè)，此時若加入引物甲和乙，則可以擴增出300+100=400(bp)的片段。

由AAU變成AAA或由AAC變成AAG,可使大冬酰胺替換為賴氨酸。（3）若兩個反應系統(tǒng)

均進行一次復制，則會產(chǎn)生3種不同的DNA分子，因為引物1和4產(chǎn)生的DNA分子是一樣

的。（4）重疊互補引物的設(shè)計是重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵。拼接基因M和N時，需要找

到兩種基因的重疊部分，即Mi、M2中的一種引物與Ni、N2中的一種引物必須具有互補配對

的片段。

3歸納總結(jié)----------------------------------

重登延伸PCR技術(shù)：采用具有互補配對片段的引物，分別進行PCR,獲得有重疊鏈的兩種

DNA片段，再在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因或?qū)⒉煌瑏碓吹娜?/p>

意DNA片段連接起來。

類型五利用PCR技術(shù)擴增未知基因序列——反向PCR

7.（202。江蘇，33節(jié)選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出

已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖（以aoRI酶切為例）：

染色體DNA

陶切|反oRI

混合的DNA片段

?5*在-—知序列未知序罰片段F

H連接|DNA連接前

已知序列、

PCR川物

環(huán)狀DNA

?coRI

|||擴增|TaqDNA聚合施

PCR產(chǎn)物

N測序、分析|片段F的

3'完整序列

請據(jù)圖回答問題：

⑴步驟I用的EcoRI是一種酶,它通過識別特定的切

割特定位點。

⑵步驟II用的DNA連接的催化相鄰核甘酸之間的3'一羥基與5'一磷酸間形成

;PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得；ZqDNA聚合酶

的作用是催化。

⑶若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟HI選用的PCR引物必須是

（從引物①②③④中選擇，填編號）。

DNA序列（虛線處省略了部分核甘酸序列）

己知序列IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

ATTGATACGCGAGTACT..........CGTTACGCATCGGAGA-5,

①5'-AACTATGCGCTCATGA-3

PCR引物

②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3

(3)5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'

答案（1）限制性內(nèi)切核酸（或限制）核甘酸序列（2）磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模

板的DNA鏈的延伸⑶②④

解析（3）PCR過程中，根據(jù)已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板掛和引物的方向是

相反的，引物的核昔酸序列要能夠和相應模板的核昔酸序列發(fā)生堿基互補配對，環(huán)狀DNA

圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知

DNA序列的第一條鏈的左端互補結(jié)合延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物是與已知DNA

序列的第二條鏈的右端互補結(jié)合延伸形成子鏈，該引物是②。

3歸納總結(jié)----------------------------------

反向PCR是反向互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段。利用在已知序列內(nèi)部沒有切

點的限制性內(nèi)切酶對此段DNA進行酶切，在DNA連接酯作用下自連形成環(huán)狀DNA分子，

然后利用方向合適并與已知序列兩端互補的引物，以連接成環(huán)的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，

得到已知序列的旁側(cè)DNA片段。

L巳知序列R>

1VI1-1|3

南切位點|酶切位點

變性并加入根據(jù)已知

序列合成的引物

[PCR擴增

巳知序列巳知序列

類型六利用PCR技術(shù)快速檢測病原體一熒光定量PCR

8.猴痘是由猴痘病毒（一種RNA病毒）感染所致的一種病毒性人畜共患病，臨床上表現(xiàn)為發(fā)

熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大等。猴痘病毒感染的常規(guī)檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定。

（1）首先，從樣本中提取病毒RNA,經(jīng)_______酶作用生成cDNA；然后以cDNA為模板進行

實時熒光PCR擴增，測定樣品中病毒核酸量。

⑵通過實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標記探針（一小段單鏈DNA,可與FI的

基因中部分序列特異性結(jié)合）。當探針完整時，不產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，與目的基因結(jié)

合的探針被及qDNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測到（如圖1）。

癖二忌”

iiiiiiinniiniiiiniiiiiiiiiTT

圖1

①當樣本中有目的基因時，引物和探針與目的基因復性時，通過________________原則而特

異性結(jié)合。

②在PCR循環(huán)的延伸階段，RqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測到的熒光強度

與反應體系中DNA分子數(shù)呈__________（填“正相關(guān)”或“負相關(guān)”）。

（3）通過實時熒光PCR檢測猴痘病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖2所示。

|熒光強度

oJ平7廠

線性增長期I/

Ct值［/熒光閾值

［指數(shù)增長期I

0i（j203（）'4（）,

循環(huán)數(shù)

圖2

①與指數(shù)增長期相比，線性增長期目的基因數(shù)量的增長率下降，原因可能有

②Ct值的含義：在PCR擴增過程中，每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)

歷的擴增循環(huán)數(shù)。因此，當樣本中初始模板越多時，Ct值就O

③某新猴痘病毒核酸檢測說明書標明，CtW37判定為陽性，Ct>40或無Ct值判定為陰性。圖

2所示猴痘病毒核酸檢測結(jié)果應判定為。

（4）陰性結(jié)果也不能排除猴痘病毒感染，可能產(chǎn)生假陰性的因素有（多選）。

a.取樣太早，樣本中病毒量少，達不到實時熒光PCR檢測閾值

b.樣本被污染，RNA能將病毒RNA降解

c.病毒發(fā)生變異

答案⑴逆轉(zhuǎn)錄（2）①堿基互補配對②正相關(guān)（3）①預DNA聚合的活性下降、引物濃度

下降、原料dNTP濃度下降②越?、坳栃裕?）abc

解析（1）由病毒RNA生成cDNA的過程屬于逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。（2）②在PCR循

環(huán)的延伸階段，7h“DNA聚合晦催化子鏈的合成并水解探針。根據(jù)題干信息可知，熒光信號

的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步，檢測到的熒光強度與反應體系中DNA分子數(shù)呈正相關(guān)。

（3）②樣本中初始模板越多時，達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)就越少，Ct值就越

小。③CtW37判定為陽性，Ct>40或無Ct值判定為陰性。圖2中熒光閾值大榻是25,猴痘

病毒核酸檢測結(jié)果應判定為陽性。（4）陰性結(jié)果也不能排除猴痘病毒感染，可能產(chǎn)生假陰性的

因素有取樣太早，樣本中病毒量少，達不到實臉時熒光PCR檢測閾值；樣本被污染，RNA

酶將病毒RNA降解，從用導致樣本中病毒量少：病毒發(fā)生變異，檢測不出來，從而出現(xiàn)假

陰性，故選a、b^Co

S歸納總結(jié)----------------------------------

熒光定量PCR通過在反應體系中加入能夠指示反應進程的熒光探針，當耐高溫的DNA聚合

酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一次，就

有一個熒光分子生成，通過熒光信號的積累來監(jiān)測擴增產(chǎn)物的積累。Q值是熒光信號達到熒

光閾值時PCR循環(huán)數(shù)，模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系，起始

模板量濃度越高，Ct值越??；起始模板量濃度越低，Ct值越大。

課時精練

選擇題1?2題，每小題7分，3?8題，每小題8分，井62分。

一、選擇題

1.（2024.武漢期末）基因工程中，通過PCR可以特異性地快速擴增目的基因，PCR產(chǎn)物常采

用瓊脂糖凝膠電泳實驗進行鑒定。下列有關(guān)該實驗的敘述，正確的是（）

A.在同一電場作用下，DNA片段越長遷移速率越快

B.DNA分子在凝膠中的遷移速率與凝膠的濃度無關(guān)

C.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紅外燈下被檢測出來

D.如果引物特異性不強，擴增出來的條帶可能不止一條

答案D

解析在同一包場作用下，DNA片段越長遷移速率越慢，A錯誤；凝膠的濃度會影響DNA

分子在凝膠中的迂移速率，B錯誤；掠脂糖凝膠中的DNA分子經(jīng)過核酸染料染電后可在波

長為300nm的紫外燈下被檢測出來，C錯誤：如果引物特異性不強，引物可能會與目的基因

以外的其他的DNA片段結(jié)合，擴增出來的條帶可能不止一條，D正確。

2.（2025?武漢一模）油菜的綠葉對黃化葉為顯性。與綠葉基因相比，黃化葉基因有一個堿基對

發(fā)生了改變，從而出現(xiàn)一個限制酶B的酶切位點。為鑒定某綠葉油菜的基因型，提取其DNA

進行了PCR和電泳。下列敘述正確的是（）

A.需設(shè)計能與目的基因結(jié)合的雙鏈DNA作為PCR引物

B.應在PCR擴增體系中添加Mg2+,以激活DNA聚合酶

C.可適當降低復性的溫度，以減少PCR中非特異性條帶的產(chǎn)生

D.用限制酶B作用后進行電泳，若有2條電泳條帶可判斷為雜合子

答案B

解析引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，A錯誤；PCR

過程中用到了緩沖液，緩沖液中一般要添加Mg?+用于激活DNA聚合薛，B正確；復性溫度

過低會導致引物與模板鏈的結(jié)合不牢固，會增加PCR中非特異性條帶，C錯誤：與綠。一基因

相比，黃化葉基因有一個城基對發(fā)生了改變，從而出現(xiàn)一個限制酶B的酶切位點，用眼制酶

B作用后進行電泳，若有3條電泳條帶可判斷為雜合子，D錯誤。

3.（2024.廈門質(zhì)檢）如圖表示PCR過程中某個階段反應體系的情況，①??④表示相關(guān)物質(zhì)，

L、R表示方向。下列敘述正確的是（）

],鏈fTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTI

A.②鏈從L到R的方向為3'-5',①②鏈均可作為子鏈合成的模板

B.PCR過程需要通過解旋前斷開氫鍵，且為邊解旋邊復制

C.以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③

D.物質(zhì)③的5'端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物

答案D

解析根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系及圖示可判斷，②鏈從L到R的方向為

5'-3',A錯誤：PCR過程是通過高溫將雙鏈DNA之間的氫鍵斷開，并且是全部解旋之

后才進行復制，B錯誤；以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23=8,需

消耗7個引物③,C錯誤。

4.（2024?重慶模擬）不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA（ssDNA）的方

法，如圖所示。不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的

被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1:100。PCR反應最初的若干次循環(huán)中，其擴增產(chǎn)

物主要是雙鏈DNA（dsDNA）,但當限制性引物消耗完后，就會產(chǎn)生大量的ssDNA。下歹J相關(guān)

說法錯誤的是（）

/也A限制性引物

甲

A.用不對稱PCR方法擴增目的基因時，不需要知道基因的全部序列

B.進行最初若干次循環(huán)的目的是增加模板DNA的量

C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致

D.因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離

答案C

解析不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性弓1物，非限制性引物與乙

鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯誤。

5.反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計引物對未知序列（圖中L、R）進行擴增的技術(shù)，其過程如

圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是（）

g已知序列

LI

的切位點

環(huán)化并加入根據(jù)已

知序列合成的引物

PCR擴增

R

已知序列已知序列

A.過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進行切割

B.過程②需要使用DNA連接前，形成磷酸二酯鍵

C.過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶

D.該技術(shù)可檢測T-DNA整合到植物染色體DNA的位置

答案C

解析過程③即PCR擴增.PCR技術(shù)中DNA解旋是在高溫下實現(xiàn)的.不需要加入解旋誨.

C錯誤。

6.（2024.無錫模擬）重疊延伸PCR可實現(xiàn)定點基因誘變，其操作過程如圖所示（凸起處代表突

變位點）。下列說法正確的是（）

通用引物FP1突變引物FP2

突變諭引RP1I通用;I物RP2

①一

第1對引物

的PCR產(chǎn)物

第2對引物

幣:卷區(qū)域

的PCR產(chǎn)物

②混合、變性、復性

通用引物RP2

PCR④

-K---------

突變的基因

A.過程①需要把兩對引物同時加入一個擴增體系以提高擴增效率

B.過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物

C.過程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過程

D.若過程④得到16個突變基因，則需要消耗15個通用引物RP2

答案D

解析兩種突變引物能互樸配對，因此過程①必須分兩個反應系統(tǒng)進行，A錯誤；過程①至

少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物，B錯誤；過程②獲得的產(chǎn)物不都可以完成延

伸過程，因為子鏈只能從引物的3'端開始延伸，C錯誤；若過程④得到16個突變基因，由

于模板中不含有通用引物，則產(chǎn)生16個突變基因共需要消耗16X2-2=30（個）通用引物，而

需要通用引物RP2的數(shù)量為3（R2=I5（個），D正確。

7.（2024.安順調(diào)研）熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中DNA含量，用于病毒檢測。其原理

是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針。當耐高溫的DNA

聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一次,

就有一個熒光分子生成（如圖）。通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值（熒光信號達到設(shè)定閾

值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。下列相關(guān)敘述錯誤的是（）

熒光定量PCR

A.PCR每個循環(huán)包括變性、復性（引物和模板結(jié)合）、延伸3個階段

B.耐高溫的DNA聚合酶在該反應中的作用是形成磷酸二酯鍵和水解磷酸二酯鍵

C.最終監(jiān)測的熒光強度與起始時反應管內(nèi)樣本DNA的含量呈正相關(guān)

D.Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險性更高

答案D

解析a值越小，說明所需循環(huán)的次數(shù)越少，被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，D錯誤。

8.（2025.成都期末）某科研小組采用PCR技術(shù)構(gòu)建了紅色熒光蛋白基因3""⑵和a-淀粉酶基

因3用>）的dsred2-amy融合基因，其過程如圖所示，其中引物②和引物③中部分序列（灰色

區(qū)域）可互補配對。下列說法錯誤的是（）

dsred2基因5，加）?基因

叁弓I物③引物④未

3'

5'

=>5'

雜交鏈

u延伸

3'

dsre應-am.v融合基因5'

A.利用PCR技術(shù)擴增基因時不需要解旋酶來打開DNA雙鏈

B.不能在同一反應體系中進行dsred2基因和卬”基因的擴增

C.dsred2基因和基因混合后只能得到一種類型的雜交鏈

D.雜交鏈延伸得到dsredl—amy融合基因的過程不需要加引物

答案C

解析利用PCR技術(shù)擴增基因時，高溫變性使DNA雙鏈解旋，不需要解旋悔來打開DNA

雙鏈，A正確：引物②和引物③中部分序列可互補配對，引物之間的結(jié)合會干擾引物和模板

鏈的結(jié)合，從而影響PCR過程，因此不能在同一個反應體系中進行杰wd2基因和基因

的擴增，B正確；%因和卬冷，基因混合可以得到兩種類型的雜交鏈，C錯誤；雜交鏈

延伸得到必儂/2一〃歿融合基因的過程中，不需要加入引物，兩條母掛的起始位置的堿基序

列即為引物，可以作為子處合成的引物，D正確。

二、非選擇題

9.（12分）（2025?長沙模擬）水稻穗粒數(shù)可影響水稻產(chǎn)量。衣桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA可以轉(zhuǎn)移

并隨機插入野生型水稻基因組中（可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點），導致

被插入的基因功能喪失，從而得到一系列水稻突變體。研究者從中篩選得到一株穗粒數(shù)異常

突變體，為確定T-DNA插入植物細胞的染色體位置，可根據(jù)T-DNA序列，擴增其兩側(cè)

未知序列比對，從而確定插入的染色體。

?未知序列T-DNA未知序列

,I'I'，

3膽怕1%占突變體DNAL.；；占

限制的切點限制醐切點

圖1

引物AJ知子?引物B

口/y\T1

BCR產(chǎn)物

圖3

（1）圖I所示序列使用限制陋陋切后，將所得DNA使用兩連成環(huán)狀（如圖2）,再設(shè)

計引物進行PCR擴增，其中復性過程的作用是。

（2）請根據(jù)圖1的T-DNA的?條鏈的堿基序列，選出PCR中使用的引物序列是和

（填序號）。

T-DNA序列引物序列

①5'—GCGCATAGTT-3'

②5，一ATAGGCTACG-3'

5'-AACTATGCGC……CGTAGCCTATT'

③5，一CGTAGCCTAT—3'

④5'-AACTATGCGC-3'

（3）由圖2中環(huán)狀DNA至少經(jīng)過_____輪循環(huán)才能得到圖示鏈狀PCR產(chǎn)物（如圖3）o

（4）經(jīng)過與野生型水稻基因組序列比對，確定T-DNA插入2號染色體上的B基因中。研究

發(fā)現(xiàn)，該突變體產(chǎn)量明顯低丁野生型，據(jù)此推測B基因可（填“促進”或“抑制”）水

稻穗粒的形成，從而控制高產(chǎn)性狀。

答案⑴DNA連接使弓物通過堿基互補配對結(jié)合到模板鏈上（2）①③（3）3（4）促進

解析（2）

T-DNA序歹U引物序列

5'—AACTATGCGC……CGTAGCCTATT'5'—GCGCATAGTT—3f

3'—TTGATACGCGGCATCGGATA—5f5'—CGTAGCCTATT

據(jù)上述分析，PCR中使用的引物序列是①和③。（4）該突變體產(chǎn)量明顯低于野生型，而突變體

內(nèi)B基因由于插入了T-DNA功能喪失，據(jù)此推測B基因促進水稻穗粒的形成。

10.（14分）（2025?安慶模擬）巢式PCR是?種特殊的聚合酶鏈式反應，使用兩組不同的引物實

現(xiàn)對目標DNA片段的擴增。第一組外引物大小為25bp,復性溫度較高（68℃）,擴增后得到

中間產(chǎn)物；第二組內(nèi)引物大小為17bp,復性溫度較低（46℃）,內(nèi)引物的結(jié)合部位在中間產(chǎn)物

內(nèi)部。具體過程如圖?所示，回答下列問題：

模板二二二二二二二二工二二w

使用外引物進行第一次PCR擴增

,,I-'：12345

中間產(chǎn)物,,-------------

"-A---------------------

使用內(nèi)引物進行第二次PCR擴增B---

目標產(chǎn)物:W

圖一圖二

⑴巢式PCR反應體系中除模板、引物、M/+外，還應加入（答

出兩點即可）等。

（2）巢式PCR時，及性溫度與引物長度呈________（填“正相關(guān)”或“負相關(guān)”）。若使用外引

物進行第一次PCR擴增時產(chǎn)生了錯誤片段，則使用內(nèi)引物進行第二次PCR擴增時，完成配

對并擴增的概率會o由此可知，巢式PCR相較于常規(guī)PCR具有的優(yōu)點是

（3）家畜胚胎的性別鑒定技術(shù)對畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。科研人員利用多重巢式PCR技

術(shù)同時擴增奶牛Y染色體上的雄性決定基因（3火丫）和常突色體上的酪蛋白基因（CSN/S/）,進

行早期胚胎性別鑒定和胚胎移植，獲得高產(chǎn)奶牛。

實驗目的方法步驟要點

囊胚樣品DNA提取選取滋養(yǎng)層細胞提取DNA

PCR引物的設(shè)計和合成根據(jù)牛的SRY和CSN1S1基因序列設(shè)計并合成a.______對引物

PCR擴增預變性一變性一復性一延伸

鑒定分析采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，確定胚胎性別

b._______________對受體奶牛注射前列腺素

胚胎移植將符合要求的胚胎移植到受體奶牛的子宮內(nèi)

①請將表格內(nèi)容補充完整：a是；b是。

②巢式PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖二所示，1?5號為取自不同胚胎的DNA樣品，其中符合要求

的胚胎是o

答案⑴緩沖液、耐高溫的DNA聚合酯（或7河DNA聚合酶）、4種脫氧核甘酸（或dNTP）

⑵正相關(guān)下降特異性強、靈敏度高（3）①4同期發(fā)情②1、2、4

解析（2）PCR過程包括高溫變性、低溫復性、中溫延伸，巢式PCR時，復性溫度與引物長

度呈正相關(guān)。巢式PCR時，若使用外引物進行第一次PCR獷增時產(chǎn)生了錯誤片段，聲使用

內(nèi)引物擴增，在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率會下降，因此，相比于常規(guī)PCR而言，

巢式PCR特異性強、靈敏度高。（3）①本實驗用巢式PCR技術(shù)，用的是兩輪PCR,因此擴增

一種基因片段則需要設(shè)計2對引物，而擴增2種基因片段則需要設(shè)計4對引物。在胚胎移植

前需要對受體奶牛進行同期發(fā)情處理，便于移植。②題中利用多重巢式PCR技術(shù)同時才「增Y

染色體上的雄性決定基因(SRF)和常染色體上的酪蛋白基因(CSMS/)并進行電泳，雌性個體沒

有SRY,只有一條帶，雄性有兩條帶，因此1、2、4是雌性，3、5是雄性，故符合要求的胚

胎是I、2、41,

11.(12分)(2023?江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組

酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請回答卜.列問題:

擬構(gòu)建的72。bp390bpJ注:EGFP熒光不白基因、

法因結(jié)構(gòu)卜所用納米抗體基此

EGFPAnBI

................旺:2片段PCR引物

吐式F1片段甌一?及目的產(chǎn)

F2-R物片段

FTR□-.線性質(zhì)粒

基因重組?)—