ICS

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T/CVDA

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVDAXXXXX—2024

改善寵物腸黏膜功能產(chǎn)品的有效性檢驗(yàn)方

法和程序

Effectivenesstestingmethodsandproceduresforimprovingpet

intestinalmucosalproducts

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸藥協(xié)會(huì)發(fā)布

T/CVDAXXXXX—XXXX

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定改善寵物腸粘膜功能產(chǎn)品的術(shù)語(yǔ)和定義，并規(guī)范改善寵物腸粘膜產(chǎn)品有效性檢驗(yàn)操作，

包括試驗(yàn)動(dòng)物和受試樣品要求、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、測(cè)試項(xiàng)目、試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定及注意事項(xiàng)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于聲稱具有改善腸粘膜屏障功能的寵物飼料（食品）、保健產(chǎn)品、飼料原料及添加劑的

有效性評(píng)價(jià)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用的寵物品種包括犬、貓為主的伴侶動(dòng)物。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB14925實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27476.1檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室安全第1部分:總則

GB/T31190實(shí)驗(yàn)室廢棄化學(xué)品收集技術(shù)規(guī)范

GB/T35507生化用試劑測(cè)定通則

GB/T35823實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通用要求

GB/T35892實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南

SN/T3509實(shí)驗(yàn)室樣品管理指南

SN/T3592實(shí)驗(yàn)室化學(xué)藥品和樣品廢棄物處理的標(biāo)準(zhǔn)指南

SN/T4835實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物管理要求

GB2760食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)

GB13432預(yù)包裝特殊膳食用食品標(biāo)簽通則

GB16740保?。üδ埽┦称吠ㄓ脴?biāo)準(zhǔn)

GB26687食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)復(fù)配食品添加劑通則

GB28050食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽通則

GB/T18823飼料檢測(cè)結(jié)果判定的允許誤差。

《寵物飼料標(biāo)簽規(guī)定》，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第20號(hào)公告《寵物飼料管理辦法》

保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（2023年版）

保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法（2023年版）

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1腸黏膜intestinalmucosa

腸腔內(nèi)最表面的一層結(jié)構(gòu)，分為小腸粘膜和大腸粘膜。

3.2腸道屏障功能intestinalmucosalbarrierfunction

3

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指腸道能夠防止腸內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素穿過腸黏膜進(jìn)入機(jī)體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)的

結(jié)構(gòu)和功能的總和。腸道屏障主要由機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障組成。

3.3機(jī)械/物理屏障Mechanical/physicalbarriers

機(jī)械屏障又叫物理屏障，其生理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是黏膜上皮、固有層和黏膜肌層。腸上皮細(xì)胞通過細(xì)胞連

接緊密排列，細(xì)胞之間的連接由緊密連接、黏附連接和橋粒等組成，能有效的阻擋細(xì)菌、病毒及內(nèi)毒素

進(jìn)入。

3.4化學(xué)屏障Chemicalbarrier

由腸上皮細(xì)胞所分泌的粘液、消化液及正常菌分泌的抑菌物質(zhì)組成。如短鏈脂肪酸、膽汁酸等。

3.5免疫屏障Immunologicbarri

由腸道相關(guān)淋巴細(xì)胞組織和彌散免疫細(xì)胞組成。腸道相關(guān)淋巴組織包括上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、固有層淋

巴細(xì)胞和腸道淋巴結(jié)。在腸道黏膜上皮細(xì)胞間、固有層以及黏膜下層分布大量淋巴組織和細(xì)胞。環(huán)境中

的細(xì)菌、病毒、毒素等抗原刺激腸道黏膜產(chǎn)生免疫反應(yīng)，腸道粘膜免疫系統(tǒng)可對(duì)機(jī)體中抗原識(shí)別，產(chǎn)生

體液免疫和細(xì)胞免疫，對(duì)抗原進(jìn)行有效清除，具有抵御病原微生物入侵、抗過敏反應(yīng)、抑制免疫應(yīng)答等

功能。

3.6生物屏障biologicalbarri

腸道菌群主要包括黏膜菌群和腸腔菌群，黏膜菌群主要以雙歧桿菌和乳酸桿菌為主，腸腔菌群多為

大腸桿菌和腸球菌，它們黏附在腸道黏膜層上，形成了一個(gè)多層次的腸道微生物屏障。

4通用要求與原則

4.1試驗(yàn)原則

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和寵物試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目；正常動(dòng)物或各種模型動(dòng)物（腸道炎癥、腸道菌群

紊亂、便秘模型動(dòng)物）任選其一；受試樣品中含雙歧桿菌、乳桿菌以外的其它益生菌時(shí)，應(yīng)在動(dòng)物和寵

物試驗(yàn)中加測(cè)該益生菌；在進(jìn)行寵物試食試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。

4.2受試樣品及處理要求

應(yīng)提供受試樣品的名稱、性狀、規(guī)格、批號(hào)、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、保存條件、申請(qǐng)單位名稱、生產(chǎn)

企業(yè)名稱、配方、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、營(yíng)養(yǎng)功能以及推薦攝入量等信息；受試樣品應(yīng)是規(guī)格化的定型

產(chǎn)品，即符合既定的配方、生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)提供受試樣品的主要成分、功效成分/標(biāo)志性成分

及可能的有害成分的分析報(bào)告；申請(qǐng)產(chǎn)品審定或登記的受試物，應(yīng)與擬上市的產(chǎn)品完全一致。

4.3對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼料、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求

4.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求

根據(jù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的具體要求，合理選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。常用大鼠和小鼠，品系不限，應(yīng)使用適用于相應(yīng)功

能評(píng)價(jià)的動(dòng)物品系，推薦使用近交系動(dòng)物。動(dòng)物的性別、周齡依實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量要

求為小鼠每組10-15只（單一性別），大鼠每組8-12只（單一性別）。

4

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4.3.2飼養(yǎng)環(huán)境

動(dòng)物及其實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合國(guó)家對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其實(shí)驗(yàn)環(huán)境的有關(guān)規(guī)定。

4.3.3動(dòng)物飼料

應(yīng)提供飼料生產(chǎn)商等相關(guān)資料。如為定制飼料，應(yīng)提供基礎(chǔ)飼料配方、配制方法，并提供動(dòng)物飼料

檢驗(yàn)報(bào)告。

4.4寵物試食試驗(yàn)的基本要求

4.4.1基本原則

4.4.1.1寵物試食試驗(yàn)受試樣品必需經(jīng)過動(dòng)物毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，并確認(rèn)為安全的食品。

4.4.1.2原則上受試樣品已經(jīng)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，確定其具有改善腸黏膜的保健功能。

4.4.1.3原則上寵物試食試驗(yàn)應(yīng)在動(dòng)物功能學(xué)實(shí)驗(yàn)有效的前提下進(jìn)行。

4.4.1.4根據(jù)試食試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求、受試樣品的性質(zhì)、期限等，選擇一定數(shù)量的受試者。試食試驗(yàn)報(bào)告

中試食組和對(duì)照組的有效例數(shù)不少于50例，且試驗(yàn)的脫離率一般不得超過20％。

4.4.1.5開始試食前要根據(jù)受試樣品性質(zhì)，估計(jì)試食后可能產(chǎn)生的反應(yīng)，并提出相應(yīng)的處理措施。

4.4.2受試寵物的要求

4.4.2.1選擇受試者應(yīng)根據(jù)所需判定功能的要求進(jìn)行選擇。

4.4.2.2受試者應(yīng)當(dāng)符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)要求，以排除可能干擾試驗(yàn)?zāi)康牡母鞣N因素。

4.4.2.3在受試者身上采集各種生物樣本應(yīng)詳細(xì)記錄采集樣本的種類、數(shù)量、次數(shù)、采集方法和采集

日期。

4.4.2.4納入標(biāo)準(zhǔn)：一個(gè)月內(nèi)未患過胃腸疾病者；一個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素者；受試對(duì)象為具有腸黏

膜損傷癥狀的寵物（腹瀉、腹脹、腹痛和不規(guī)律的排便、惡臭便、便血以及食欲不振等）。

4.4.2.5排除標(biāo)準(zhǔn)：老齡犬貓、妊娠或哺乳期犬貓；合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；短

期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品，影響結(jié)果判斷者；未能按標(biāo)準(zhǔn)服用受試樣品，資料不全影響功效判斷

者。

5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

腸黏膜監(jiān)測(cè)主要包括腸黏膜通透性監(jiān)測(cè)、血漿內(nèi)毒素含量測(cè)定、細(xì)菌移位等。腸黏膜通透性監(jiān)測(cè)是

反映腸黏膜屏障功能的重要指標(biāo)。

腸道評(píng)分是一種通過評(píng)估腸道健康狀態(tài)的方式，可以通過多種因素對(duì)腸道功能、菌群、黏膜屏障等

進(jìn)行評(píng)估。腸道評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)通常包括腸道癥狀、糞便特征、腸道菌群、腸道黏膜屏障等指標(biāo)。

5.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

5.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

推薦用近交系小鼠，18－22g，單一性別，每組10－15只。

5.1.2劑量分組及受試樣品給予

實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)陰性對(duì)照組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間30d，必要時(shí)可以

延長(zhǎng)至45d。

5

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5.1.3腸道粘膜損傷動(dòng)物模型

5.1.3.1原理

葡聚糖硫酸鈉（DextranSulfateSodiumSalt，DSS）誘導(dǎo)建模法。DSS是一種聚陰離子衍生物，

可誘導(dǎo)結(jié)腸炎性粘膜損傷模型,雖然DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的機(jī)制雖仍未?分明確,但通常認(rèn)為與巨噬細(xì)

胞功能失調(diào)、腸道菌群失調(diào)、DSS對(duì)結(jié)腸上皮的毒性作用、細(xì)胞因子在DSS結(jié)腸炎性粘膜損傷模型的發(fā)

病中起重要作用（腫瘤壞死因子、白介素、干擾素、IL-10和IL-12）等機(jī)制有關(guān)。也就說明，該模型

引起腸粘膜的機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障功能均會(huì)產(chǎn)生影響，是目前腸炎造模研究領(lǐng)域

金標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.3.2急性結(jié)腸炎粘膜損傷模型

選取成年小鼠正常飼養(yǎng)1-2周，飲水中加入2%-5%DSS，自由飲水5-7d，觀察癥狀體征，7d后處

死動(dòng)物用于分析檢測(cè)。

5.1.3.3慢性結(jié)腸炎粘膜損傷模型

選取成年小鼠正常飼養(yǎng)1-2周，飲水中加入2%-3%DSS，自由飲水5-7d，觀察癥狀體征，停止飲用

含有DSS水，改為正常飲水7-14d后，再用含2%-3%DSS的水飼喂5-7d，觀察癥狀體征，停止飲用含

有DSS水，改為正常飲水7-14d后，處死動(dòng)物用于分析檢測(cè)。

5.1.3.4DSS腸炎造模的觀察指標(biāo)和方法

主要包括a.疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI，表1）的評(píng)估：包括體重，大便性狀和血便。b.組織學(xué)損傷指數(shù)

（HI）的評(píng)估：觀察結(jié)腸內(nèi)有無(wú)出血，潰瘍等。取一小塊組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，觀察組

織學(xué)改變并進(jìn)行評(píng)分；c.病理切片，HE染色觀察。

表1DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

體重下降（%）大便性狀*大便隱血/肉眼血便記分

0正常正常0

1-5松散隱血陽(yáng)性1

5-102

10-15稀便肉眼血便3

>154

*正常大便：成型大便；松散大便；不黏附于肛門的糊狀、半成形大便；稀便：可黏附于肛門的稀水樣便。

5.2分析測(cè)定指標(biāo)

5.2.1體征指標(biāo)

5.2.1.1體重

給與受試樣品前和后每周稱量體重，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，并做好記錄。

5.2.1.2DAI評(píng)分

各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的DAI評(píng)分方法見表1。

5.2.2組織學(xué)觀察

5.2.2.1組織學(xué)損傷指數(shù)（HI）的評(píng)估

觀察結(jié)腸內(nèi)有無(wú)出血，潰瘍等。取一小塊組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，觀察組織學(xué)改變。

5.2.2.2病理形態(tài)

采用HE染色觀察有無(wú)病理學(xué)改變。

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5.2.3腸黏膜物理/機(jī)械屏障功能分析

腸道黏膜具有一定的選擇性滲透性，可以允許有益物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，同時(shí)阻止有害物質(zhì)的通過。但是，

當(dāng)腸道通透性增加時(shí)，有害物質(zhì)、細(xì)菌等可能會(huì)通過腸道壁，引發(fā)炎癥和其他健康問題。腸黏膜的通透

性增高是腸黏膜物理屏障功能受損害的一個(gè)重要指標(biāo)。常用的檢測(cè)腸黏膜通透性的血液生化指標(biāo)包括

D-乳酸、二胺氧化酶（DAO）、細(xì)菌內(nèi)毒素（ET）。

5.2.3.1D-乳酸檢測(cè)

原理：D-乳酸是腸內(nèi)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體嚴(yán)重創(chuàng)傷或感染后腸黏膜缺血、缺氧致腸黏膜頂部上

皮脫落，腸黏膜通透性增高，大量D-乳酸進(jìn)入血流，而哺乳動(dòng)物不具有將其分解的酶系統(tǒng)，故血漿D-

乳酸水平可顯著升高。因此，測(cè)定血中D-乳酸含量可反映腸黏膜缺血程度和腸通透性的改變。

采用酶催化法，用血液自動(dòng)分析儀。酶催化法測(cè)定血液乳酸含量。原理是在NAD存在時(shí)，乳酸脫氫

酶催化乳酸氧化成丙酮酸，同時(shí)生成NADH。加入肼或氨基脲與丙酮酸生成復(fù)合物，使丙酮酸不斷從反

應(yīng)體系中減少，促使反應(yīng)向右進(jìn)行。在紫外可見分光光度計(jì)波長(zhǎng)340nm處監(jiān)測(cè)吸光度的升高速率，計(jì)算

乳酸含量。在測(cè)量血液乳酸含量時(shí)，應(yīng)選擇肝素-氟化鈉作為抗凝劑，盡快分離出血漿。避免選擇草酸

鉀/氟化鈉作為抗凝劑，因?yàn)椴菟徕泴?duì)乳酸脫氫酶有一定的抑制作用；采血前應(yīng)空腹，使血中乳酸濃度

達(dá)到穩(wěn)定。

5.2.3.2二胺氧化酶（DAO）檢測(cè)

原理：DAO是存在于哺乳動(dòng)物小腸的黏膜或纖毛上皮細(xì)胞中催化二胺的細(xì)胞內(nèi)酶，能夠催化多胺氧

化生成醛，并可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子平衡、影響傳導(dǎo)通路、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)等，對(duì)腸黏膜起保護(hù)作用。

當(dāng)腸黏膜細(xì)胞受損、壞死后DAO即釋放入血，致血中活性升高。血DAO水平可作為反映腸道機(jī)械屏障的

完整性和受損傷程度的重要指標(biāo)，可評(píng)估腸粘膜損傷和修復(fù)程度。

比色法測(cè)定DAO含量。DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過

氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成有色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰，通過測(cè)定該波長(zhǎng)吸光度增加速率，計(jì)

算DAO活性。（可用檢測(cè)試劑盒的方法進(jìn)行）。

5.2.3.3細(xì)菌內(nèi)毒素（ET）

原理：腸道內(nèi)存在大量的G-桿菌，能產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，當(dāng)腸黏膜通透性增加，腸屏障功能破壞，

內(nèi)毒素入血，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥。故血漿內(nèi)毒素水平也可反映腸道黏膜屏障功能情況，評(píng)估細(xì)菌易位，可

作為輔助檢測(cè)指標(biāo)。細(xì)菌脂多糖的測(cè)定是監(jiān)測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的直接指標(biāo)。

細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖測(cè)定：脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，對(duì)宿主有毒性。脂多糖只

有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來(lái)，所以叫做內(nèi)毒素。其毒性成分主要為類脂質(zhì)

A。血液肝素抗凝，使用脂多糖檢測(cè)試劑盒(光度法)方法測(cè)定。

5.2.4腸黏膜化學(xué)屏障功能分析

5.2.4.1黏蛋白2（MUC2）測(cè)定

小鼠結(jié)腸粘膜中MUC2含量采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定。

5.2.4.2短鏈脂肪酸（SCFAs）含量測(cè)定

腸黏膜化學(xué)屏障物質(zhì)主要是腸道菌群的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸、脂多糖等。當(dāng)腸道菌群的代謝產(chǎn)

物出現(xiàn)異常時(shí)，可能會(huì)影響腸道蠕動(dòng)和收縮力。其中，短鏈脂肪酸的含量作為腸黏膜化學(xué)屏障功能分析

的主要指標(biāo)。短鏈脂肪酸（SCFAs）是指鏈長(zhǎng)為1-6個(gè)碳原子的脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、

丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸。SCFAs是由未消化的膳食纖維、蛋白質(zhì)及碳水化合物經(jīng)腸道微生物代謝

生成，其中乙酸、丙酸、丁酸約占總量90%以上。SCFAs的檢測(cè)方法采用氣相色譜法（GC）或氣相色譜

法與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）。

5.2.4.2.1氣相色譜法（GC）

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將60mg糞便與1.5mL磷酸鹽緩沖液混合均勻，加入0.1mL磷酸溶液，冰浴中渦旋使其充分溶解，

12000r/min離心10min,取上清液，用氣相色譜（GC）檢測(cè)SCFAs含量，參數(shù)如下：色譜柱為DB-FFAP

毛細(xì)管柱（30mm×250μm×0.25μm），柱箱溫度60℃，前進(jìn)樣口溫度250℃，壓力15psi，流速27mL/min

隔墊吹掃流量3.0mL/min，前檢測(cè)器FID檢測(cè)器，溫度280℃，燃?xì)饬髁?9mL/min，進(jìn)樣量1μL。甲酸、

乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的

SCFAs含量。

5.2.4.2.2氣相色譜法與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）

取適量樣品加入2mL磷酸溶液（V（磷酸）∶V（去離子水）＝1∶3），渦旋均漿2min，加入2mL

乙醚萃取10min，4000r/min低溫離心20min；離心后取出乙醚相，再加入2mL乙醚萃取，4000r/min

低溫離心10min，離心后再次取出乙醚相，將兩次萃取液合并揮發(fā)定容至2mL，進(jìn)樣進(jìn)行氣相色譜-

質(zhì)譜分析。色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX色譜柱（25m×0.20mm，0.40μm）；柱溫為初溫100℃

保持5min，以5℃/min升至150℃，再以30℃/min升至240℃，保持30min；進(jìn)樣口溫度為240℃；

載氣流速為1.0mL/min；不分流。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；離子源溫度為200℃；傳輸線溫度為

250℃；轟擊電壓為70eV；單離子掃描模式為定量離子60、73。短鏈脂肪酸的含量按下式計(jì)算。

ω＝(ρ×V×N)/(m×M)

式中：ω為試樣中短鏈脂肪酸的含量/（mmol/g）；ρ為試樣測(cè)定液中短鏈脂肪酸的質(zhì)量濃度/（mg/L）；

V為定容體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為試樣的質(zhì)量/g；M為摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

5.2.5腸黏膜免疫屏障功能分析

免疫球蛋白sIgA和腸黏膜炎癥因子（IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-6、IL-1β等）水平測(cè)定均采用酶

聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定。取出目的腸道組織，在冰冷的PBS中縱向剪開，小心洗去腔內(nèi)的消化

液，在平板紙上吸去多余液體；10mL圓底離心管中加入1～2mL組織裂解液和漂洗后的腸組織，在冰

浴狀態(tài)下勻漿30s；冰上孵育10min，全部轉(zhuǎn)移1.5mLEP管中，4℃、12000r/min離心15min；

小心分離上清，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度；測(cè)定濃度后的上清分裝后-80℃保存或冰上等待，立刻

用于ELISA檢測(cè)。

5.2.6腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

無(wú)菌采取小鼠結(jié)腸內(nèi)容物或者糞便1.0g，抽提其菌群DNA，采用16SrRNA高通量測(cè)序法檢測(cè)腸道

菌群。針對(duì)編碼16SrRNA的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，可以對(duì)微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

a.對(duì)腸道菌群OUT主成分分析。獲得OTURank曲線是一種展現(xiàn)樣品中物種多樣性的形式，可同

時(shí)反映樣品多樣性的豐富度和均勻度。

b.α-多樣性分析。一種用來(lái)反映微生物群落多樣性和豐度的指標(biāo)。

c.菌群結(jié)構(gòu)分析。分別在門的分類水平上、在屬水平的菌群豐度，進(jìn)行分析，采用LEfSe分析不

同物種在各個(gè)分類水平上的差異，根據(jù)LDA評(píng)分鑒定生物標(biāo)志分類群。

d.微生物功能預(yù)測(cè)。根據(jù)Tax4Fun預(yù)測(cè)，受試犬貓腸道微生物群與代謝、遺傳信息處理和環(huán)境

信息處理相關(guān)的功能。

6寵物試食試驗(yàn)

根據(jù)受試樣品的性質(zhì)和改善寵物腸黏膜作用確定觀察的指標(biāo)，應(yīng)包括一般指標(biāo)和功效性指標(biāo)。

6.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組要求

采用自身和組間兩種對(duì)照設(shè)計(jì)。按受試者的菌群狀況隨機(jī)分為試食和對(duì)照組，盡可能考慮影響結(jié)果

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的主要因素如年齡、性別、飲食因素等，進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，以保證組間的可比性。每組受試者不少于15

例。

6.2受試樣品的劑量和使用方法

試食組按推薦服用方法、服用量服用受試產(chǎn)品，對(duì)照組可服用安慰劑或采用空白對(duì)照。受試樣品給

予時(shí)間14天，必要時(shí)可以延長(zhǎng)至30天。試驗(yàn)期間不改變?cè)瓉?lái)的飲食習(xí)慣，正常飲食。

6.3一般指標(biāo)

在受試期間應(yīng)取得下列資料：

6.3.1一般狀況

包括精神、睡眠、飲食、大小便等。

6.3.2血、尿、便常規(guī)檢查

6.3.3肝、腎功能檢查

6.3.4常規(guī)的血液學(xué)指標(biāo)

包括血紅蛋白、紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)，必要時(shí)做白細(xì)胞分類。

6.3.5常規(guī)生化指標(biāo)

包括轉(zhuǎn)氨酶、血清總蛋白、白蛋白，尿素、肌酐、血脂、血糖等。

6.4功效性指標(biāo)

6.4.1糞便評(píng)分

每日記錄受試者試食前后排便情況，并按照表2對(duì)糞便評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)中，3分為最理想的形

態(tài)。在此基礎(chǔ)上，分?jǐn)?shù)越大，糞便中含水量越低，結(jié)合其他癥狀?？梢詰岩赡c胃蠕動(dòng)功能減弱，大便在

腸道中停留時(shí)間過長(zhǎng)，再加上動(dòng)物飲水量不夠，就會(huì)出現(xiàn)大便干硬，嚴(yán)重的可能會(huì)出現(xiàn)腸梗阻和腸壞

死等。分?jǐn)?shù)越低，糞便中含水量越多，結(jié)合臨床癥狀，可以懷疑出現(xiàn)胃腸道疾病、急性或慢性胃炎、過

敏等。某些急性傳染病，如犬細(xì)小病毒感染、犬瘟，均會(huì)出現(xiàn)5分的糞便。

表2糞便等級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

分值糞便形態(tài)

5含水量極低，干燥、易碎，呈塊狀

4糞便表面有清晰可見的紋路和干裂，容易拾起，基本不在地面有殘留

3糞便潮濕，呈圓柱狀，從地面撿起時(shí)會(huì)有殘留

2糞便濕度較大，但不是完全呈液態(tài)。不易拾起，有些時(shí)候還會(huì)在寵物肛周粘連

1完全的液態(tài)糞便

6.4.2機(jī)械屏障功能分析

血液中D-乳酸、二胺氧化酶（DAO）、細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定。抽取受試寵物空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血3mL。

方法同5.2.3

6.4.3短鏈脂肪酸（SCFAs）含量測(cè)定

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參見5.2.4。

6.4.4生物屏障功能分析

腸道菌群16SrRNA高通量測(cè)序。針對(duì)編碼16SrRNA的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，可以對(duì)微生物群落

的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。無(wú)菌采取受試者糞便1.0g，抽提其菌群DNA，采用16SrDNA高通量測(cè)序法檢

測(cè)腸道菌群。

a.對(duì)腸道菌群OUT主成分分析。獲得OTURank曲線是一種展現(xiàn)樣品中物種多樣性的形式，可

同時(shí)反映樣品多樣性的豐富度和均勻度。

b.α-多樣性分析。一種用來(lái)反映微生物群落多樣性和豐度的指標(biāo)。

c.菌群結(jié)構(gòu)分析。分別在門的分類水平上、在屬水平的菌群豐度，進(jìn)行分析，采用LEfSe分析

不同物種在各個(gè)分類水平上的差異，根據(jù)LDA評(píng)分鑒定生物標(biāo)志分類群。

d.微生物功能預(yù)測(cè)。根據(jù)Tax4Fun預(yù)測(cè)，受試犬貓腸道微生物群與代謝、遺傳信息處理和環(huán)境

信息處理相關(guān)的功能。

7數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定

7.1數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)使用國(guó)家法定劑量單位。

使用數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算總實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)內(nèi)的平均值，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表

示。一般采用方差分析，但需先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，則計(jì)算F值。若F值<F0.05，結(jié)論為各組

均數(shù)間差異無(wú)顯著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05），結(jié)論為各組均數(shù)間差異有顯著性，需進(jìn)一步使用

多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)需進(jìn)行

適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)分布或方差齊的要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；若經(jīng)變量轉(zhuǎn)換仍

不能達(dá)到正態(tài)分布或方差齊的目的，則改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

比較試驗(yàn)組自身或試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異，差異有顯著性（P<0.05），則實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

7.2結(jié)果判定

7.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

①機(jī)械/物理屏障功能指標(biāo)中D-乳酸、二胺氧化酶（DAO）、細(xì)菌內(nèi)毒素（ET）三項(xiàng)有一項(xiàng)指標(biāo)較模

型對(duì)照組明顯降低，且差異有顯著性，可判定該受試樣品具有一定改善小鼠機(jī)械/物理屏障功能的作用。

②化學(xué)屏障功能指標(biāo)中黏蛋白2（MUC2）和短鏈脂肪酸（SCFAs）含量?jī)身?xiàng)指標(biāo)較模型對(duì)照組明顯

降低，且差異有顯著性，可判定該受試樣品具有一定改善小鼠化學(xué)屏障功能的作用。

③免疫屏障功能指標(biāo)中免疫球蛋白sIgA較模型對(duì)照組明顯降低，且差異有顯著性；腸黏膜炎癥因

子中有一項(xiàng)指標(biāo)較模型對(duì)照組明顯降低，且差異有顯著性?？膳卸ㄔ撌茉嚇悠肪哂幸欢ǜ纳菩∈竺庖咂?/p>

障功能的作用。

④生物屏障功能指標(biāo)中，腸道菌群多樣性（有益菌群）較模型對(duì)照組明顯增加，且差異有顯著性，

可判定該受試樣品具有一定改善小鼠生物屏障功能的作用。

四項(xiàng)功能指標(biāo)中，有兩項(xiàng)為陽(yáng)性，即可判定受試樣品具有改善小鼠腸黏膜功能。

7.2.2犬貓?jiān)囀硨?shí)驗(yàn)結(jié)果判定

①機(jī)械/物理屏障功能指標(biāo)中D-乳酸、二胺氧化酶（DAO）、細(xì)菌內(nèi)毒素（ET）三項(xiàng)有一項(xiàng)指標(biāo)較模

型對(duì)照組明顯降低，且差異有顯著性，可判定該受試樣品具有一定改善犬貓機(jī)械/物理屏障功能的作用。

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②化學(xué)屏障功能指標(biāo)中短鏈脂肪酸（SCFAs）含量較模型對(duì)照組明顯降低，且差異有顯著性，可判

定該受試樣品具有一定改善犬貓化學(xué)屏障功能的作用。

③免疫屏障功能指標(biāo)血液炎癥因子中有一項(xiàng)指標(biāo)較模型對(duì)照組明顯降低，且差異有顯著性。可判定

該受試樣品具有一定改善犬貓免疫屏障功能的作用