四個(gè)階段：

一、以導(dǎo)致遺傳病得基因突變位點(diǎn)為靶標(biāo)，以DNA分子雜交為核心

二、以PCR技術(shù)為核心

三、以生物芯片為核心

四、以DNA測(cè)序技術(shù)為核心

廣義:分子標(biāo)志物包括基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)與各種代謝物

臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)靶標(biāo)主要以核酸（DNA與RNA）為主

基因組DNA就是臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)中最常用得分子靶標(biāo)

病原生物基因1、菌種鑒定：PCR-測(cè)序與PCR-DNA探針雜交;縮短檢測(cè)時(shí)間

2、確定病毒感染與病毒載量：明確感染源,判斷病情,監(jiān)測(cè)療效

3、病毒分析:基因型變異產(chǎn)生不同臨床癥狀

4、細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)與分子流行病學(xué)調(diào)查：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；指導(dǎo)選擇

治療方案,控制病原菌得感染傳播

基因變異1、致病基因得分子缺陷2、線粒體基因突3、腫瘤相關(guān)基因

單基因病1、致病基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，影響了編碼產(chǎn)物量與質(zhì)得改變，如血紅蛋白病、

血友病、Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良等。

2、致病基因中核昔酸三聯(lián)體重復(fù)序列發(fā)生高度擴(kuò)展，如脆性X綜合征、亨廷

頓病、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良等。

基因多態(tài)性用于：1、基因定位與疾病相關(guān)性分析2、疾病診斷與遺傳咨詢3、多基因病

得研究4、器官移植配型與個(gè)體識(shí)別

循環(huán)游離核酸檢測(cè)（包括游離DNA與游離RNA）用于:產(chǎn)前診斷、惡性腫瘤早期診斷、病

例檢測(cè)

臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)以分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)與DNA測(cè)序技術(shù)、芯片技術(shù)、雙

向電泳技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)為主要技術(shù)

分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可用于微生物感染得確診、感染性病原體得分型、耐藥監(jiān)測(cè)。

分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)有利于臨床上對(duì)遺傳性疾病得早期預(yù)防、早期診斷、早期治療。

重要國(guó)際生物信息中心:1、美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBD2、歐洲生物信息學(xué)冊(cè)究

所（EBI）3、日本國(guó)立遺生研究所（DDBJ）

一級(jí)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)有GenBank、EMBL與DDBJ;

蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)有SWISS-PROT、PIR、UNIPROT等。蛋白質(zhì)X射線晶體三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)

庫(kù)有PDB等。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)常用得有SWISS-PROT、PIR、PDB數(shù)據(jù)庫(kù)。

二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)非常多,如人類基因組圖譜庫(kù)GDB、轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)合位點(diǎn)庫(kù)TRANSFAC、蛋白

質(zhì)結(jié)構(gòu)家族庫(kù)SCOP等。

**乙型肝炎病毒核酸得檢測(cè)常用技術(shù)：1、普通PCR技術(shù)2、熒光定量PCR技術(shù)3、支

鏈DNA技術(shù)4、核酸雜交技術(shù)5、雜交捕獲系統(tǒng)6、基因芯片技術(shù)

**HBV基因分型得方法：1,PCR-RFLP2、PCR-RBD3、ELISA4、基因芯片

人乳頭瘤病毒基因組結(jié)構(gòu)：HPVDNA為一雙鏈閉環(huán)分子，基因組可分三個(gè)區(qū)段:早期區(qū)

(E)、晚期區(qū)(L)、長(zhǎng)控制區(qū)或上游調(diào)節(jié)區(qū)或非編碼區(qū)。

***HPVDNA檢測(cè)及基因分型：

1、核酸雜交技術(shù)(主要包括核酸印跡、原位雜交,雜交捕獲等技術(shù)。目前常采用HCII

技術(shù)、核酸分子雜交與PCR相結(jié)合得方法。具有較強(qiáng)得特異性，并可分型)2、

PCR技術(shù)**

(采用型特異性引物進(jìn)行HPV快速分型,現(xiàn)已成為HPV惑染最常用得檢測(cè)方法之一。目

前常用通用引物-PCR(GP-PCR)與實(shí)時(shí)定置PCRo1、GP-PCR,依據(jù)不同HPV亞型有共同

保守序列得特點(diǎn)來設(shè)計(jì)通用引物,可廣譜擴(kuò)增HPVDNA,具有較高得敏感性，可檢測(cè)出

10-400拷貝得HPV病毒含量。在GP-PCR得基礎(chǔ)上,建立了巢式PCR與巢式多重PCR檢

測(cè)HPVDNA。提高了檢測(cè)敏感性與多重感染率。2、實(shí)時(shí)定量PCR法，該法可實(shí)現(xiàn)HPV

DNA定量與快速檢測(cè)?，F(xiàn)在市售產(chǎn)品可以檢測(cè)E6與E7得mRNA;進(jìn)行HPV16、18、31、

33與45分型。檢測(cè)靈敏度高，但設(shè)備昂貴，操作繁瑣，不適于宮頸癌得大規(guī)模篩查。)

3、基因芯片技術(shù)(基因芯片可對(duì)HPV進(jìn)行分型與多重感染診斷,適于高通量HPV篩

查)4、流式熒光液芯技術(shù)

5、飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)

臨床意義：(一)宮頸疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)(-)療效評(píng)估及術(shù)后跟蹤(三)預(yù)防控制與疫苗研發(fā)

**HIV-1基因組中，gag、pol、env為結(jié)構(gòu)基因，編碼病毒核心蛋白(gag)、多聚酶(pol)、

與外膜蛋白(env)。vprvrevxvif、tatvvpu/vpx、nef等6個(gè)基因?yàn)檎{(diào)控基因，編碼

調(diào)控蛋白與輔助蛋白。

核酸序列依賴擴(kuò)增(NASBA)就是一種等溫?cái)U(kuò)增RNA得技術(shù)，能直接擴(kuò)增單鏈RNA特異序

列,通過合成cDNA,在等溫條件下進(jìn)行體外序列特異性核酸擴(kuò)增。

NASBA需要AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、噬菌體T7RNA聚合酶共同作用完成。NASBA

分非循環(huán)相(模板RNA與引物I互補(bǔ))與循環(huán)相(轉(zhuǎn)錄得反義RNA與引物II互補(bǔ))兩個(gè)

階段

流行性感冒病毒核酸檢測(cè):主要有R—PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、基因芯片、逆轉(zhuǎn)錄-

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)等。

結(jié)核分枝桿菌核酸得檢測(cè)：1、PCR2xReal-timePCR3、PCR-RFLP4、線性探

針雜交法(LPA)5、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(SDA)6、擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌直接試驗(yàn)(AMTDT)7、

基因芯片技術(shù)8、GeneXpert全自動(dòng)結(jié)合檢測(cè)平臺(tái)

結(jié)核分枝桿菌得耐藥性檢測(cè)：(1)DNA測(cè)序(2)PCR-SSCP(3)PCR-RFLP(4)PCR-RDB⑸

基因芯片技術(shù)

淋病奈瑟菌核酸得檢測(cè)：1、PCR2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)3、連接酶鏈反應(yīng)4、

連替代擴(kuò)增技術(shù)(SDA)

淋病奈瑟菌得主要耐藥基因：(1)gyrA與parC基因(2)penAxponA基因(3)porB基

因(4)Mtr系統(tǒng)調(diào)控基因(5)erm基因

淋病奈瑟菌耐藥檢測(cè)得分子生物學(xué)技術(shù)：(1)DNA測(cè)序⑵PCR-SSCP(3)PCR-RFLP(4)

基因芯片技術(shù)

*醫(yī)院細(xì)菌感染得常用分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)：1、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)被認(rèn)為就是菌

株分子分型得“金標(biāo)準(zhǔn)”2、PCR-RFLP3、擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP)

4、重復(fù)序列PCR5、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)6、多位點(diǎn)測(cè)序分型

白假絲酵母菌得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1、PCR普通PCR、實(shí)時(shí)PCR、巢式PCR與多重PCR

等2、PCR-斑點(diǎn)雜交3、DNA指紋技術(shù)，包括RFLP、隨即擴(kuò)增多態(tài)性分析(RADP)、

電泳核型分析等4、AP-PCR5、DNA序列分析6、基因芯片技術(shù)

新型隱球菌得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1、PCR2、斑點(diǎn)雜交3、PCR-RFLP

沙眼衣原體得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1、PCR2、連接酶鏈反應(yīng)3、DNA序列分析

肺炎衣原體得分子生物學(xué)檢驗(yàn):PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、巢式PCR與競(jìng)爭(zhēng)性PCR

肺炎支原體得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1、PCR2、核酸雜交,探針有特異性DNA片段探件、

人，合成得寡核甘酸探針、全DNA探針。常用斑點(diǎn)雜交。3、PCR-RFLP

梅毒螺旋體得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1、PCR2、核酸雜交3、PCR-RFLP

分子生物學(xué)檢驗(yàn)可早期診斷患者得梅毒感染,及時(shí)治療,防止病情惡化與蔓延。另外就

是耐藥基因分析與流行病學(xué)研究得首選方法。

弓形蟲DNA主要有三種形式:染色體DNA、線粒體DNA、與胞質(zhì)DNA利

用分子生物學(xué)技術(shù)已檢出弓形蟲得主要基因有B1基因、P22基因(SAG2)、P30基因

(SAG1)、P43(SAG3)與棒狀體蛋白1(R0P1)等。分生檢

測(cè)：1、PCR主要側(cè)重檢測(cè)B1基因與P30基因。2、斑點(diǎn)雜交

a珠蛋白合成障礙性貧血得分子生物學(xué)檢驗(yàn)1、PCR2、Southern印跡雜交3、AS-

PCR4、SSCP5、gap-PCR

B珠蛋白生成障礙性貧血得分子生物學(xué)檢驗(yàn):PCR-RDB、PCR-RFLP、基因芯片、PCR-ASO、

AS-PCR

血友病B得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：直

接檢測(cè)法有Southern印跡雜交、DNA測(cè)序、基因芯片與毛細(xì)管電泳；間接

檢測(cè)方法有RFLP、SSCP、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、雙脫氧指紋圖譜、變性高效液相

色譜(DHPLC)。

脆性X綜合征得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：

(一)Southern印跡雜交(二)PCR(三)微衛(wèi)星序列分析通過分

子診斷FMR-1基因突變開展患者判定、攜帶者篩查、產(chǎn)前診斷與群體篩查等。

腫瘤相關(guān)得基因：原癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、細(xì)胞凋亡基因以及維持

細(xì)胞基因組穩(wěn)定性基因等。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因：周期蛋白(cyclins)、周期蛋白依賴性激酶(CDKs)、CDK抑制因子

(CKIs)及細(xì)胞周期檢查點(diǎn)等其她蛋白

細(xì)胞凋亡相關(guān)基因可分三類:促細(xì)胞凋亡基因、抑制細(xì)胞凋亡基因、細(xì)胞凋亡過程中表

達(dá)得基因。

P53就是研究得較為充分得與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系明確得抑癌基因,絕大多數(shù)腫瘤都伴

有P53基因得突變。

乳腺癌（17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上）得發(fā)生、發(fā)展緊密聯(lián)系得基因有BRCA1、BRCA2、TP53、t

erbB2xc-MycvP53、Bcl-2、BAX、iASPP、ATMXMDM-2以及PTEN等

乳腺癌得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1、

雌激素受體（ER）與孕激素受體（PR）檢測(cè)（免疫組織化學(xué)）2vc-

erbB-2/HER2檢測(cè)（免疫組化、熒光原位雜交）

3、PS2檢測(cè)

4、Ki67檢測(cè)

5、乳腺癌復(fù)發(fā)基因檢測(cè)（DNA微集陣列技術(shù)、多基因RT-PCR定量檢測(cè)技術(shù)）（70基因

檢測(cè)方法、21基因檢測(cè)方法）

遺傳性結(jié)直腸癌相關(guān)基因:結(jié)腸腺瘤性息肉?。ˋPC）基因、DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）基因、

微衛(wèi)星異常

微衛(wèi)星異常主要表現(xiàn)為:微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）;微衛(wèi)星雜合性丟失（LOH）o

結(jié)直腸癌得分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1、HNPCC得篩查2、微衛(wèi)星異常檢測(cè)3、APC基因突變

檢測(cè)4、DCC基因突變檢測(cè)5、DNA甲基化得檢測(cè)6、結(jié)直腸癌個(gè)體化治療得相關(guān)檢

測(cè)

白血病相關(guān)基因突變：C-KIT、FLT3、NPM（核仁磷酸蛋白）、N-RAS、N0TCH1

白血病相關(guān)基因表達(dá)異常：WT1、H0X1K白血病融合基因。（WT1可作為不伴特異分子

異常得AML微小殘留白血病（MRD）得理想檢測(cè)指標(biāo)）

白血病得分子生物學(xué)檢驗(yàn):FISH、PCR、RT-PCRx實(shí)時(shí)定量PCR（FISH適于多種臨床標(biāo)本,

但靈敏度不及PCR,主要用于初診與復(fù)發(fā)得檢測(cè)。）

線粒體12SrRNA基因得A1555G與C1494T突變就是導(dǎo)致氨基糖昔類抗生素耳毒性得主

要分子致病基礎(chǔ)。tRW°T7511c等突變則與非綜合征型耳聾相關(guān);而

tRNA，頡）A3243G等突變可導(dǎo)致綜合征型耳聾。

耳聾相關(guān)得mtDNA突變得檢測(cè)：1、PCR-RFLP2、DHPLC3、DNA測(cè)序4、基因芯

片

LHON（Leber遺傳性視神經(jīng)病變）相關(guān)得mtDNA突變位點(diǎn)得檢測(cè)方法有PCR-RFLP、PCR-

SSCPxDHPLCxDNA測(cè)序、熒光定■PCR、AS-PCR、及基因芯片等

tRNALeugA3243G仍就是目前國(guó)際上唯一公認(rèn)得線粒體糖尿病致病突變

線粒體糖尿病得分子生物學(xué)方法:PCR-DHPLC、PCR-RFLP、PCR-測(cè)序、熒光定量PCR、

基因芯片等。

染色體結(jié)構(gòu)異常類型有缺失、重復(fù)、倒位、等臂染色體、環(huán)狀染色體、易位等類型。

染色體疾病常用得分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù):FISH、MLPA、CGH、無(wú)損傷產(chǎn)前染色體病分子

生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

藥物相關(guān)基因分類:藥物作用靶點(diǎn)相關(guān)基因、藥物代謝酶基因（CYP450、N-乙酰基轉(zhuǎn)移

酶）、藥物副反應(yīng)相關(guān)基因

植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）:PCR及其相關(guān)技術(shù)、多色熒光原位雜交技術(shù)、全基因組擴(kuò)增

及基因芯片等相繼應(yīng)用于PGD。

PGD最早適用于包括性別診斷、某些單基因遺傳病、染色體結(jié)構(gòu)與數(shù)目異常等

植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）常用得分子生物學(xué)技術(shù):單細(xì)胞PCR技術(shù)、熒光原位雜交、植

入前遺傳學(xué)單倍型分析（PGH）技術(shù)、非整倍體篩選（PGS）

分子生物學(xué)技術(shù)在HLA分型中得應(yīng)用（DNA分型技術(shù)）:1、RFLP與PCR-RFLP技術(shù)2、

PCR-SSCP技術(shù)3、測(cè)序技術(shù)4、PCR-SSO技術(shù)5、PCR-SSP技術(shù)6、基因芯片技

術(shù)7、流式細(xì)胞儀技術(shù)8、氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)分型技術(shù)

測(cè)序技術(shù)（就是最可靠、最直接、最準(zhǔn)確得HLA分型方法）

法醫(yī)物證學(xué)主要內(nèi)容包括:個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、性別鑒定、種族與種屬認(rèn)定。

核酸標(biāo)志物存在多種不同得形式,包括基因突變位點(diǎn)、基因多態(tài)性位點(diǎn)、等位基因,

mRNA、mircoRNAv線粒體DNA、病原生物基因組DNA、DNA甲基化位點(diǎn)與循環(huán)核酸等。

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）得原理:將標(biāo)記得核酸探針變性后，利用探針與被檢樣本上已

變性得靶核酸序列在退火溫度下復(fù)性,進(jìn)行分子雜交,對(duì)大得靶序列（＞1kb）采用直接標(biāo)

記得熒光探針，對(duì)于小得靶核酸序列以及弱雜交信號(hào)通過生物素或地高辛標(biāo)記核酸探針,

在用熒光標(biāo)記得配體（如抗體）進(jìn)行雜交信號(hào)放大,最后用熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào),在

不改變被檢標(biāo)本（即維持其原位）得情況下對(duì)靶核酸序列進(jìn)行定位、定性與半定量分析。

（用于FISH得探針可以就是DNA或RNA,核酸探針得標(biāo)記方法可用缺口翻譯法、隨機(jī)引

物法、PCR法或體外轉(zhuǎn)錄法）

FISH就是一種非放射性原位雜交,其原理就是將標(biāo)記了熒光得探針與固定在載玻片上

細(xì)胞染色體或染色質(zhì)得特異部位進(jìn)行原位雜交，然后用熒光顯微鏡在不同波長(zhǎng)得激發(fā)光

下觀察，判斷特定染色體得數(shù)目或其存在或缺失得情況。具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、

特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

熒光原位雜交技術(shù)得方法特點(diǎn):1、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、直觀、省時(shí)2、檢測(cè)結(jié)果得局限性

FISH檢測(cè)得一般過程①標(biāo)本玻片得制備;②標(biāo)本預(yù)處理；③探針與標(biāo)本得變性；④原

位雜交；⑤雜交后得洗滌與復(fù)染；⑥FISH信號(hào)分析。

多重連接依賴性探針擴(kuò)增（MLPA）:利用多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)與探針雜交與連接反應(yīng)得

組合,可在同一反應(yīng)管內(nèi)司時(shí)檢測(cè)被檢樣本40~50個(gè)不同得DNA或RNA序列得拷貝數(shù)變

化。

MLPA技術(shù)得原理:樣本得每個(gè)被檢測(cè)位點(diǎn)包括兩個(gè)特異得寡核昔酸片段探針,一個(gè)由化

學(xué)合成（5'端探針,如圖1A與2A）,另一個(gè)通常經(jīng)M13噬菌體衍生法制備（也可由化學(xué)合

成法合成,探針設(shè)計(jì)略有不同）得探針（3’端探針,1B與2B）,5'端探針包括探針5'端

一段通用引物序列X