ICS11.220B41備案號：DB42Enzyme-linkedimmunosorbentassaytodetectantibodyagainstnonstructureoffoot-and-mouthdiseasevirus湖北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB42/T793—2012前言 12縮略詞 13實驗原理 14實驗條件 15實驗材料 26實驗方法 27結(jié)果判定 38注意事項 3 4 6DB42/T793—2012本標準按GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標準由華中農(nóng)業(yè)大學提出。本標準由湖北省農(nóng)業(yè)廳歸口。本標準起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院、武漢科前動物生物制品有限責任公司、湖北省動物疫病預防控制中心。本標準主要起草人：吳斌、金梅林、錢平、曹勝波、陳煥春、盧順、李淑云、宋念華。DB42/T793—2012口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是偶蹄動物的一種急性、高度接觸性傳染病，其病原是口蹄疫病毒。該病傳播途徑多，傳染性強，發(fā)病率高，曾多次在世界上發(fā)生過大流行。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將本病列為必報傳染病之首，我國將其列為一類動物疫病。本標準的檢測技術(shù)參考OIE《診斷試驗和疫苗標準手冊》（2009版）2.1.5章中推薦的方法，并結(jié)合起草單位在口蹄疫血清學診斷技術(shù)方面的研究基礎(chǔ)編寫制定。本文件的發(fā)布機構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及到《一種口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因3ABC及其制備方法與應(yīng)用》（專利號：ZL2003101001145）相關(guān)的專利的使用。本文件的發(fā)布機構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構(gòu)保證，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：專利持有人姓名：陳煥春、顧貧、曹勝波、錢平、唐勇、金梅林、吳斌、方六榮、劉正飛、呂建強。地址：武漢市洪山區(qū)獅子山街1號華中農(nóng)業(yè)大學郵政編碼：430070聯(lián)系電話真注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。DB42/T793—20121口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法本標準規(guī)定了口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法的縮略詞、實驗原理、實驗條件、實驗材料、實驗方法、結(jié)果判定和注意事項等。本標準適用于檢測豬血清中口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。2縮略詞下列縮略詞適用于本標準。ELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）：酶聯(lián)免疫吸附試驗FMDV(foot-and-mouthdiseasevirus)：口蹄疫病毒OD630nm值：630納米波長處的吸光值S：樣品孔OD630nm值P：陽性對照孔OD630nm平均值3實驗原理口蹄疫感染動物體內(nèi)產(chǎn)生口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，而口蹄疫疫苗免疫動物主要產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體，因此可以通過檢測非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體來區(qū)分疫苗免疫動物和野毒感染動物。在FMDV各蛋白的抗體中，非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體是檢測FMDV感染的最可靠指標。FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA檢測技術(shù)是利用待檢樣品中的抗體與包被在酶標板上的重組非結(jié)構(gòu)蛋白抗原發(fā)生反應(yīng)，然后通過洗滌把抗原抗體復合物和其他物質(zhì)分開；再加入酶標記抗體（酶標二抗酶標記抗體也可以通過反應(yīng)與抗原抗體復合物結(jié)合，此時酶標板上的酶量與樣品中的抗體量成正比；加入底物后，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，有色產(chǎn)物的量與樣品中抗體的量直接相關(guān)，故可根據(jù)OD630nm值 進行分析。4實驗條件4.1實驗室實驗操作宜在常溫（18℃~25℃)進行。4.2儀器臺式低溫高速離心機、微量移液器、冰箱、恒溫箱、酶標檢測儀。4.3人員注意個人防護和環(huán)境保護。2DB42/T793—20125實驗材料口蹄疫病毒重組非結(jié)構(gòu)蛋白、酶標記抗體、陽性對照血清、陰性對照血清；包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、底物液A、底物液B、終止液；試劑配方見附錄A。6實驗方法6.1樣品處理取豬血液，待血液凝固后，4000r/min離心10min，收集血清。血清宜清亮，無嚴重溶血。具體血液采集與樣品處理的注意事項見附錄B。6.2包被用包被液將抗原稀釋到工作濃度（3.1μg/mL）加入酶標板孔內(nèi)，每孔100μL，在2℃~8℃下包6.3封閉取出抗原包被板，棄去孔中的包被液，拍干；每孔加洗滌液200μL，靜置3min；棄去洗滌液，加封閉液，200μL/孔，于37℃封閉2h；棄去封閉液，拍干。于2℃~8℃冷藏過夜，自然干燥。6.4樣品稀釋用血清稀釋液按1:40的比例稀釋血清樣品（195μL樣品稀釋液中加5μL血清樣品），用血清稀釋液按1：4的比例稀釋對照血清（180μL樣品稀釋液中加60μL對照血清），輕輕振蕩混勻。6.5加樣將稀釋好的待檢血清和對照血清各取100μL加入到抗原包被板孔中，待檢血清作1孔，陰性對照和陽性對照各作2孔，輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃下溫育30min。6.6洗滌棄掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板5次，200μL/孔，每次靜置3min后倒掉液體，并在干凈的吸水紙上拍干。6.7加酶標記抗體每孔加酶標記抗體100μL，置37℃下溫育30min，按6.6中方法洗板5次。6.8加底物每孔加底物液A、底物液B各50μL，輕輕振蕩混勻，室溫（18℃~25℃)避光顯色10min。6.9終止反應(yīng)每孔加終止液50μL，輕輕振蕩混勻，10min內(nèi)測定結(jié)果。6.10測定吸光值在酶標儀上于630nm波長處測各孔OD630nm值。DB42/T793—20127結(jié)果判定試驗成立的條件：陽性對照孔OD630nm值均≥0.8；陰性對照孔OD630nm值均＜0.3。如果S≥0.3，判為陽性；如果S＜0.3，判為陰性。8注意事項實驗過程中注意做好個人的生物安全防護措施，廢棄物應(yīng)做無害化處理。DB42/T793—20124（規(guī)范性附錄）試劑的配置A.1洗滌液氯化鈉（NaCl）8.0g氯化鉀（KCl）0.2g磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O)2.9g磷酸二氫鈉（NaH2PO4）0.2g吐溫-20（Tween-20）0.5mL加蒸餾水至1000mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆谩.2樣品稀釋液牛血清白蛋白（BSA）0.5g加洗滌液至100mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆?。A.3酶標記抗體用樣品稀釋液按1:5000稀釋，置4℃保存可使用7d。A.4底物液A的配制磷酸氫二鈉（Na2HPO4）14.6g檸檬酸（C6H8O7）9.33g過氧化脲（CH6N2O3）0.52g加蒸餾水至1000mL用HCl調(diào)pH值至5.0～5.4，置2℃~8℃下保存?zhèn)溆?。A.5底物液B的配制四甲基聯(lián)苯胺（TMB）無水乙醇（C2H6O）加蒸餾水至置2℃~8℃下避光保存?zhèn)溆谩?0mg1000mLA.6終止液40%的氫氟酸(HF)加蒸餾水至置2℃~8℃下保存?zhèn)溆谩?25μL100mLA.7包被液DB42/T793—2012碳酸鈉（Na2CO3）碳酸氫鈉(NaHCO3)2.93g加蒸餾水至1000mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆?。A.8封閉液牛血清白蛋白（BSA）0.5g蔗糖（C12H22O11）加洗滌液至100mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆?。DB42/T793—20126（資料性附錄