演講人：日期:凝膠色譜分離技術(shù)及其應用目錄CATALOGUE01技術(shù)原理02分離模式03儀器組成04操作流程05應用領域06技術(shù)特點PART01技術(shù)原理分離機制基礎體積排阻效應凝膠色譜基于分子在固定相多孔介質(zhì)中的滲透差異實現(xiàn)分離，大分子因無法進入孔隙而快速洗脫，小分子因深入孔隙而滯留。流體動力學半徑?jīng)Q定分離分子的分離效率與其流體動力學半徑直接相關(guān)，而非化學性質(zhì)，因此該技術(shù)特別適用于生物大分子的分級。非吸附性分離與吸附色譜不同，凝膠色譜中固定相與待測物無化學相互作用，避免了樣品損失或變性風險。固定相與流動相常用交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖（Sepharose）或合成聚合物（如TSK-GEL），需根據(jù)目標分子量范圍選擇孔徑大小。固定相材料選擇通常采用緩沖溶液（如Tris-HCl、PBS）維持pH穩(wěn)定性，避免離子強度過高導致孔徑收縮或樣品聚集。流動相優(yōu)化固定相需與流動相化學惰性兼容，例如有機相分離需選用耐溶劑凝膠（如Styragel）。兼容性要求010203分子量分離依據(jù)01.標定曲線建立通過已知分子量標準品繪制洗脫體積-分子量對數(shù)曲線，用于未知樣品的分子量估算。02.線性分離范圍每種凝膠介質(zhì)具有特定的分子量線性分離區(qū)間（如SephadexG-50為1.5-30kDa），超出范圍則分辨率顯著下降。03.多分散性樣品處理對于分子量分布寬的樣品，需結(jié)合分段收集或串聯(lián)色譜柱以提高分離效果。PART02分離模式分子篩色譜基于分子大小差異分離凝膠色譜中的分子篩色譜利用多孔固定相（如葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠）的孔徑大小差異，使不同分子量的物質(zhì)在流動相中按體積排阻效應分離，大分子因無法進入孔徑而先流出，小分子則滯留更久。應用領域廣泛常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的純化與分子量測定，也可用于合成高分子材料的分子量分布分析，是生物制藥和材料科學的重要工具。操作條件溫和通常在常溫、中性pH及低流速下運行，能有效保持生物分子的天然構(gòu)象和活性，避免變性或降解風險。需校準標準品需使用已知分子量的標準品（如藍色葡聚糖）進行柱效校準，確保分離精度，同時需定期再生填料以維持柱效。離子交換色譜特別適用于帶電荷生物分子（如蛋白質(zhì)、核苷酸）的分離純化，分辨率高且載量大，是重組蛋白下游純化的核心步驟。高分辨率與載量優(yōu)勢

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需根據(jù)目標物等電點（pI）選擇填料類型，并通過線性梯度實驗優(yōu)化洗脫條件，避免過度吸附導致的回收率下降。動態(tài)結(jié)合容量優(yōu)化通過帶相反電荷的固定相（如DEAE-陰離子交換樹脂或CM-陽離子交換樹脂）與樣品離子間的靜電吸附實現(xiàn)分離，結(jié)合梯度洗脫（如鹽濃度或pH變化）可選擇性洗脫目標物。依靠電荷相互作用分離需精確控制流動相pH和離子強度以維持目標物與固定相的相互作用，常用Tris-HCl、磷酸鹽等緩沖液，并可能添加尿素或去垢劑處理疏水蛋白。緩沖體系關(guān)鍵性親和色譜特異性生物識別分離利用配體（如抗體、凝集素、金屬離子）與目標分子（如抗原、糖蛋白、組氨酸標簽蛋白）的高特異性結(jié)合，實現(xiàn)“鎖鑰”式分離，洗脫時通過競爭性物質(zhì)（如咪唑、游離配體）或pH變化解離復合物。極高純化效率單步純化即可達到90%以上純度，常用于單克隆抗體、酶、受體蛋白的制備，是生物工程領域的黃金標準。配體固定化技術(shù)需通過溴化氰活化、環(huán)氧基偶聯(lián)等方法將配體共價偶聯(lián)至瓊脂糖或磁珠載體，固定化效率直接影響柱效，需避免配體泄漏導致的交叉污染。成本與再生平衡高特異性配體（如ProteinA）成本昂貴，需通過嚴格清洗（如NaOH原位清洗）實現(xiàn)多次循環(huán)使用，同時需監(jiān)控配體活性衰減。PART03儀器組成色譜柱系統(tǒng)填料選擇與裝填技術(shù)色譜柱的核心是填料，通常采用多孔硅膠或高分子聚合物微球，其孔徑分布需根據(jù)目標分子量范圍選擇。裝填需保證均勻性和高柱效，避免出現(xiàn)溝流或死體積，影響分離分辨率。保護柱與預柱配置保護柱用于攔截樣品中的顆粒物或強吸附雜質(zhì)，延長分析柱壽命；預柱可平衡流動相與固定相，減少基線噪聲。柱溫控制模塊精確的溫控系統(tǒng)（±0.1℃）可穩(wěn)定分離過程，減少溫度波動引起的保留時間漂移，尤其對生物大分子（如蛋白質(zhì)）的分離至關(guān)重要。泵與進樣裝置高壓恒流泵采用雙柱塞往復式設計，提供0.001-10mL/min的流量范圍，脈動低于0.1%，確保流動相流速穩(wěn)定，避免峰形畸變。自動進樣器精度配備微量注射泵（進樣體積誤差<1%），支持程序化進樣序列，適用于高通量分析，減少人為操作誤差。梯度混合系統(tǒng)二元或四元梯度混合器可實現(xiàn)流動相比例的動態(tài)調(diào)整，適用于復雜樣品的多組分分離優(yōu)化。檢測器類型波長范圍190-800nm，可編程多波長檢測，靈敏度達ng級，適合含發(fā)色團的化合物（如蛋白質(zhì)、核酸）。紫外-可見檢測器（UV-Vis）多角度激光光散射檢測器（MALS）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）基于折射率變化檢測，通用性強但靈敏度較低（μg級），適用于無紫外吸收的聚合物或糖類分析。直接測定分子量與分子尺寸，無需標準品校準，廣泛應用于高分子聚合物的絕對分子量分布分析。通過霧化-蒸發(fā)-光散射過程檢測非揮發(fā)性組分，兼容梯度洗脫，適用于脂類、表面活性劑等無紫外吸收物質(zhì)。示差折光檢測器（RID）PART04操作流程樣品預處理樣品溶解與過濾將待測樣品溶解于適當?shù)娜軇┲?，確保完全溶解后通過0.22μm或0.45μm濾膜過濾，以去除顆粒物和雜質(zhì)，防止色譜柱堵塞。脫氣處理樣品溶液需進行脫氣處理，避免氣泡進入色譜系統(tǒng)影響分離效果，常用方法包括超聲脫氣或真空抽濾脫氣。濃度調(diào)整根據(jù)檢測器的靈敏度和色譜柱的負載能力，調(diào)整樣品濃度至合適范圍，避免過載或信號過低影響定量分析?；|(zhì)干擾去除對于復雜基質(zhì)樣品（如生物樣品或環(huán)境樣品），需采用固相萃取、液液萃取等方法去除干擾物，提高分離選擇性。分離條件優(yōu)化流動相選擇根據(jù)樣品性質(zhì)選擇合適極性的流動相（如水、甲醇、乙腈等），必要時添加緩沖鹽或離子對試劑以改善峰形和分離度。色譜柱篩選針對不同分子量范圍的樣品選擇相應孔徑的凝膠色譜柱（如排阻極限為1000Da或10000Da），并優(yōu)化柱長和內(nèi)徑以提高分辨率。溫度控制通過恒溫箱或柱溫箱精確控制分離溫度（通常20-40℃），溫度變化會影響溶劑黏度和樣品擴散速率，從而改變分離效率。流速優(yōu)化系統(tǒng)測試不同流速（0.5-2.0mL/min）對分離效果的影響，平衡分析時間與分辨率的關(guān)系，獲得最佳理論塔板數(shù)。洗脫參數(shù)控制對于簡單樣品采用等度洗脫，復雜樣品則需設計梯度洗脫程序（如乙腈/水梯度），通過改變?nèi)軇┍壤岣叻蛛x效率。等度與梯度洗脫選擇根據(jù)目標化合物的保留特性設定合理的洗脫時間窗口，確保所有組分在預定時間內(nèi)洗脫完全，避免分析周期過長或組分殘留。洗脫時間設定針對不同化合物選擇特征吸收波長（如蛋白質(zhì)280nm、核酸260nm），必要時采用多波長檢測或全波長掃描以提高檢測靈敏度。檢測波長優(yōu)化實時監(jiān)測系統(tǒng)壓力波動（正常范圍3-15MPa），壓力異?？赡芴崾旧V柱污染或流動相泄漏，需及時排查故障。壓力監(jiān)控與調(diào)整PART05應用領域生物制藥純化單克隆抗體純化凝膠色譜技術(shù)廣泛應用于單克隆抗體的分離純化，通過分子篩效應去除宿主細胞蛋白、核酸等雜質(zhì)，提高抗體純度和收率。重組蛋白純化利用凝膠色譜的尺寸排阻特性，可有效分離目標蛋白與聚集體、降解產(chǎn)物，確保重組蛋白的穩(wěn)定性和生物活性。疫苗制備在病毒樣顆粒（VLP）或亞單位疫苗的純化中，凝膠色譜能高效去除內(nèi)毒素和宿主殘留物，滿足藥品監(jiān)管的嚴格標準。食品成分分析功能性多糖分離凝膠色譜可分離食品中的多糖組分（如膳食纖維、果膠），分析其分子量分布及結(jié)構(gòu)特性，評估其營養(yǎng)價值和加工適應性。添加劑檢測通過凝膠色譜結(jié)合其他分析技術(shù)（如HPLC），可定量食品中的防腐劑、色素等添加劑，確保符合食品安全法規(guī)。用于乳制品、肉類等食品中蛋白質(zhì)的分子量分級，檢測過敏原（如乳清蛋白）或摻假成分（如植物蛋白替代物）。蛋白質(zhì)組分鑒定環(huán)境污染物檢測凝膠色譜分離環(huán)境樣品中的微塑料顆粒，結(jié)合紅外光譜或拉曼技術(shù)，鑒定其聚合物類型和粒徑分布，評估生態(tài)風險。微塑料分析針對水體或土壤中的多環(huán)芳烴（PAHs）、農(nóng)藥殘留等，通過凝膠色譜預分離富集目標物，提高后續(xù)檢測的靈敏度和準確性。有機污染物分級分析重金屬與腐殖酸等天然有機物的結(jié)合形態(tài)，揭示其在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律及生物有效性。重金屬-有機物復合物研究010203PART06技術(shù)特點分辨率優(yōu)勢高分離效率凝膠色譜基于分子尺寸差異實現(xiàn)分離，可有效區(qū)分分子量相差僅10%的組分，尤其適用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的精細分離。寬動態(tài)范圍分離過程不依賴化學相互作用，能保持樣品生物活性，適用于后續(xù)功能研究或制備級純化。通過調(diào)整凝膠孔徑和色譜柱長度，可同時分離分子量從幾百到數(shù)百萬道爾頓的樣品，滿足復雜混合物的分析需求。非破壞性分離樣品適用性生物大分子分析特別適合蛋白質(zhì)、多糖、核酸等水溶性生物分子的分離純化，可保留其天然構(gòu)象和功能特性。合成聚合物表征廣泛應用于測定聚乙烯醇、聚苯乙烯等合成高分子的分子量分布及聚合度分析。納米顆粒分離可通過選擇不同排阻極限的