Y家族DNA聚合酶對化學(xué)致癌物MNNG應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)控解析一、引言1.1研究背景與意義在生命科學(xué)領(lǐng)域，DNA聚合酶在DNA復(fù)制與修復(fù)過程中扮演著極為關(guān)鍵的角色，其功能的正常發(fā)揮是維持基因組穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)。而Y家族DNA聚合酶作為其中特殊的一類，具有獨特的性質(zhì)與功能，與細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷的機制緊密相連。與此同時，化學(xué)致癌物對生物體的威脅一直是科學(xué)界關(guān)注的焦點，N-甲基-N-硝基-亞硝基胍（MNNG）作為一種典型的化學(xué)致癌物，廣泛存在于環(huán)境之中，給人類健康帶來了巨大的潛在風(fēng)險。MNNG是一種單功能烷化劑，具備極強的致突變與致癌能力。它能夠與DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，形成加合物，進而引發(fā)DNA分子的多種損傷，如堿基烷基化、DNA鏈斷裂等。這些損傷若未能得到及時且準(zhǔn)確的修復(fù)，會導(dǎo)致基因突變的發(fā)生，干擾細(xì)胞正常的生理功能，嚴(yán)重時可促使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，引發(fā)腫瘤。大量的研究已經(jīng)證實，MNNG與胃癌、食管癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，長期接觸MNNG的實驗動物，其胃部黏膜出現(xiàn)明顯的病變，從炎癥逐漸發(fā)展為萎縮、腸上皮化生，最終形成腫瘤，這與人類胃癌的發(fā)病過程極為相似。在環(huán)境中，MNNG可通過多種途徑進入人體，如被污染的水源、食物以及工業(yè)廢氣排放等。隨著工業(yè)化進程的加速，環(huán)境中的化學(xué)污染物日益增多，MNNG的污染范圍也在不斷擴大，對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。Y家族DNA聚合酶包含Polη、Polι、Polκ和REV1等成員，它們具有一些共同的特征，這些酶缺乏3'-5'外切酶活性，這使得它們在DNA合成過程中缺乏校對功能，從而導(dǎo)致其復(fù)制保真度較低。Y家族DNA聚合酶具有獨特的結(jié)構(gòu)，擁有一個手腕或小手指結(jié)構(gòu)域（PAD），這種結(jié)構(gòu)賦予了它們特殊的功能。正是由于這些結(jié)構(gòu)和功能特點，Y家族DNA聚合酶能夠在DNA損傷部位進行跨損傷合成（TLS），即在DNA模板鏈存在損傷的情況下，它們可以繞過損傷位點，繼續(xù)進行DNA合成，從而保證DNA復(fù)制的連續(xù)性。這種跨損傷合成機制在細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷時發(fā)揮著重要作用，使細(xì)胞能夠在面臨DNA損傷的壓力下存活并維持基本的生理功能。然而，由于其低保真度的特性，Y家族DNA聚合酶在進行跨損傷合成時，也容易引入錯誤的核苷酸，導(dǎo)致基因突變的發(fā)生，增加了細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定的風(fēng)險。深入研究Y家族DNA聚合酶對化學(xué)致癌物MNNG應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，具有極其重要的理論與實際意義。從理論層面來看，這有助于我們?nèi)嫔钊氲乩斫饧?xì)胞在面對化學(xué)致癌物損傷時的自我保護與適應(yīng)機制。通過揭示Y家族DNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄水平上如何響應(yīng)MNNG的刺激，以及相關(guān)的調(diào)控因子和信號通路，能夠填補我們在DNA損傷應(yīng)答領(lǐng)域的知識空白，完善細(xì)胞應(yīng)對外界損傷的理論體系。這對于深入探究生命過程中遺傳信息的傳遞與穩(wěn)定性維持機制具有重要的推動作用，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供了關(guān)鍵的理論基礎(chǔ)。從實際應(yīng)用角度出發(fā)，對這一機制的研究為預(yù)防和治療化學(xué)致癌物誘發(fā)的腫瘤等疾病開辟了新的思路與途徑。如果我們能夠明確Y家族DNA聚合酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點，就可以針對性地開發(fā)干預(yù)措施，如設(shè)計特異性的藥物來調(diào)節(jié)其表達或活性，從而降低基因突變的發(fā)生率，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這對于提高人類健康水平，降低腫瘤等疾病的發(fā)病率和死亡率具有重要的現(xiàn)實意義，有望為臨床治療提供新的靶點和策略。1.2Y家族DNA聚合酶概述Y家族DNA聚合酶是一類在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶，其獨特的結(jié)構(gòu)和功能使其在維持基因組穩(wěn)定性方面扮演著不可或缺的角色。從結(jié)構(gòu)角度來看，Y家族DNA聚合酶與其他家族的DNA聚合酶存在顯著差異。它們具有一個獨特的手腕或小手指結(jié)構(gòu)域（PAD），這種結(jié)構(gòu)賦予了它們特殊的DNA結(jié)合能力。PAD結(jié)構(gòu)域能夠與DNA模板鏈緊密結(jié)合，尤其是在DNA損傷位點處，使得Y家族DNA聚合酶能夠穩(wěn)定地與損傷部位相互作用。在面對嘧啶二聚體等DNA損傷時，PAD結(jié)構(gòu)域可以通過特殊的構(gòu)象變化，將損傷部位容納在活性中心內(nèi)，為后續(xù)的跨損傷合成提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而與其他常見的DNA聚合酶相比，如A家族、B家族聚合酶，它們的結(jié)構(gòu)中不存在PAD結(jié)構(gòu)域，在DNA損傷修復(fù)的方式和能力上也有所不同。A家族聚合酶通常在DNA復(fù)制和修復(fù)的常規(guī)過程中發(fā)揮作用，對損傷DNA的處理能力相對較弱；B家族聚合酶雖然具有較高的復(fù)制保真度，但在面對復(fù)雜的DNA損傷時，其修復(fù)能力也不及Y家族聚合酶。在功能特性方面，Y家族DNA聚合酶最顯著的特點是缺乏3'-5'外切酶活性。這意味著它們在DNA合成過程中無法像具有3'-5'外切酶活性的聚合酶那樣對合成過程中錯誤摻入的核苷酸進行校對和切除，從而導(dǎo)致其復(fù)制保真度較低。這種低保真度的特性在正常DNA復(fù)制過程中可能被視為劣勢，但在DNA損傷修復(fù)過程中卻具有重要意義。當(dāng)DNA模板鏈出現(xiàn)損傷時，如堿基烷基化、嘧啶二聚體形成等，常規(guī)的DNA聚合酶難以跨越損傷位點進行正常的復(fù)制。此時，Y家族DNA聚合酶能夠利用其低保真度但靈活性高的特點，在損傷部位進行跨損傷合成（TLS）。它們可以在不依賴模板堿基準(zhǔn)確配對的情況下，將核苷酸摻入到正在合成的DNA鏈中，從而繞過損傷位點，保證DNA復(fù)制的連續(xù)性。在紫外線照射導(dǎo)致DNA形成嘧啶二聚體時，Y家族DNA聚合酶Polη能夠特異性地識別并在嘧啶二聚體對面插入正確的核苷酸，使得DNA復(fù)制得以繼續(xù)進行。然而，這種跨損傷合成也存在一定風(fēng)險，由于缺乏校對機制，Y家族DNA聚合酶在合成過程中可能會引入錯誤的核苷酸，從而導(dǎo)致基因突變的發(fā)生。在DNA損傷修復(fù)中，Y家族DNA聚合酶的跨損傷合成作用是細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷的重要機制之一。當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外源因素的影響導(dǎo)致DNA損傷時，如果損傷不能及時修復(fù)，DNA復(fù)制叉就會停滯，進而引發(fā)DNA雙鏈斷裂等更為嚴(yán)重的損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Y家族DNA聚合酶通過跨損傷合成，為細(xì)胞提供了一種在緊急情況下維持DNA復(fù)制的方式，使得細(xì)胞能夠在一定程度上耐受DNA損傷，繼續(xù)存活并進行正常的生理活動。這種機制在維持細(xì)胞的基本功能和遺傳信息傳遞方面具有重要意義。Y家族DNA聚合酶并非單獨發(fā)揮作用，它們與其他DNA損傷修復(fù)途徑，如核苷酸切除修復(fù)（NER）、堿基切除修復(fù)（BER）等相互協(xié)作，共同維持基因組的穩(wěn)定性。在某些情況下，當(dāng)DNA損傷較輕時，NER或BER途徑可以優(yōu)先對損傷進行修復(fù)；而當(dāng)損傷較為嚴(yán)重，無法通過常規(guī)修復(fù)途徑解決時，Y家族DNA聚合酶的跨損傷合成機制就會發(fā)揮作用，確保細(xì)胞在面臨DNA損傷壓力時仍能維持基本的生命活動。1.3MNNG的特性與致癌機制MNNG，即N-甲基-N-硝基-亞硝基胍，是一種極具研究價值的化學(xué)物質(zhì)，其在化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)上展現(xiàn)出獨特之處。從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，MNNG分子包含一個甲基、一個硝基以及一個亞硝基胍基團，這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了它較高的化學(xué)反應(yīng)活性。在理化性質(zhì)方面，MNNG是一種黃色結(jié)晶粉末，可溶于水、乙醇等多種有機溶劑。其穩(wěn)定性相對較差，在光照、高溫等條件下容易分解，釋放出具有活性的烷基化基團，這也是其能夠與生物大分子發(fā)生作用的重要前提。在生物體內(nèi)，MNNG能夠與DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生復(fù)雜的相互作用，進而對細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。MNNG是一種強烷化劑，其主要作用機制是通過釋放甲基正離子（CH3+），對生物大分子進行烷基化修飾。在與DNA的作用中，MNNG的甲基化作用具有位點特異性，它主要作用于DNA的鳥嘌呤（G）殘基的O6位和N7位。當(dāng)MNNG的甲基正離子與鳥嘌呤的O6位結(jié)合時，會形成O6-甲基鳥嘌呤（O6-MeG）加合物；與N7位結(jié)合則形成N7-甲基鳥嘌呤（N7-MeG）加合物。這些加合物的形成會導(dǎo)致DNA分子結(jié)構(gòu)的改變，影響DNA的正常功能。在與蛋白質(zhì)的相互作用中，MNNG同樣可以對蛋白質(zhì)分子中的一些氨基酸殘基進行烷基化修飾，如半胱氨酸、組氨酸等。這種修飾會改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，進而影響蛋白質(zhì)的活性和功能。一些關(guān)鍵酶蛋白被MNNG烷基化修飾后，其催化活性可能會受到抑制，從而干擾細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑和信號傳導(dǎo)通路。MNNG的致突變與致癌機制是一個涉及多個層面的復(fù)雜過程。從分子層面來看，MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷是致突變的重要起始事件。O6-MeG加合物的形成是導(dǎo)致基因突變的關(guān)鍵因素之一。由于O6-MeG的結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶（T）相似，在DNA復(fù)制過程中，DNA聚合酶可能會將其誤識別為T，從而在新合成的DNA鏈中引入錯誤的堿基，導(dǎo)致G:C到A:T的堿基顛換突變。這種堿基替換突變?nèi)绻l(fā)生在關(guān)鍵基因的編碼區(qū)，可能會導(dǎo)致基因功能的改變，影響蛋白質(zhì)的正常合成和功能。當(dāng)原癌基因發(fā)生激活突變或抑癌基因發(fā)生失活突變時，細(xì)胞就可能逐漸失去正常的生長調(diào)控機制，向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。除了堿基替換突變，MNNG還可能導(dǎo)致DNA鏈斷裂、交聯(lián)等其他形式的損傷。這些損傷如果不能被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機制及時準(zhǔn)確地修復(fù)，在DNA復(fù)制過程中就會引發(fā)更多的錯誤，進一步增加基因突變的頻率。在細(xì)胞水平上，MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷會激活細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)信號通路。當(dāng)細(xì)胞檢測到DNA損傷時，會激活A(yù)TM/ATR激酶等信號分子，這些分子會進一步激活下游的p53等轉(zhuǎn)錄因子。p53蛋白可以調(diào)控一系列與細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達。在損傷較輕的情況下，細(xì)胞會通過阻滯細(xì)胞周期，為DNA修復(fù)提供時間，以確?；蚪M的穩(wěn)定性；而當(dāng)損傷嚴(yán)重?zé)o法修復(fù)時，細(xì)胞則會啟動凋亡程序，以清除受損細(xì)胞，避免突變細(xì)胞的積累。然而，在長期或高劑量MNNG暴露下，細(xì)胞的這些應(yīng)激反應(yīng)機制可能會出現(xiàn)異常。細(xì)胞周期調(diào)控異常，導(dǎo)致受損細(xì)胞無法正常阻滯在細(xì)胞周期的特定階段進行修復(fù)，而是繼續(xù)進行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，這就大大增加了基因突變傳遞給子代細(xì)胞的風(fēng)險。細(xì)胞凋亡機制的異常也會使得本該凋亡的受損細(xì)胞存活下來，這些細(xì)胞不斷積累，逐漸獲得惡性增殖的能力，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。MNNG與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大量的研究已經(jīng)證實了這一點。在胃癌的研究中，MNNG被廣泛用于建立動物模型。實驗表明，長期給予動物飲用含有MNNG的水，動物的胃部會逐漸出現(xiàn)一系列病變，從最初的炎癥反應(yīng)，到胃黏膜萎縮、腸上皮化生，最終發(fā)展為胃癌。在食管癌的研究中，MNNG同樣被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)食管上皮細(xì)胞的癌變。通過體外細(xì)胞實驗和動物實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)MNNG可以導(dǎo)致食管上皮細(xì)胞的增殖異常、分化紊亂，同時伴隨著相關(guān)基因表達的改變，這些變化與食管癌的發(fā)生發(fā)展過程高度吻合。1.4研究現(xiàn)狀與問題提出在Y家族DNA聚合酶與MNNG相關(guān)研究領(lǐng)域，當(dāng)前已取得了一系列具有重要價值的研究成果。許多研究聚焦于Y家族DNA聚合酶在DNA損傷修復(fù)中的功能，深入揭示了其在跨損傷合成過程中的作用機制。通過體外實驗和細(xì)胞實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)Polη能夠特異性地識別并繞過紫外線誘導(dǎo)的嘧啶二聚體損傷，保證DNA復(fù)制的繼續(xù)進行，這一發(fā)現(xiàn)為理解細(xì)胞應(yīng)對紫外線損傷的機制提供了關(guān)鍵線索。對MNNG的致癌機制研究也取得了顯著進展，明確了MNNG誘導(dǎo)DNA損傷以及激活相關(guān)信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。通過體內(nèi)外實驗，證實了MNNG誘導(dǎo)的O6-MeG加合物形成與基因突變的關(guān)聯(lián)，以及ATM/ATR-p53信號通路在細(xì)胞對MNNG損傷應(yīng)答中的關(guān)鍵調(diào)控作用。盡管已有研究成果豐碩，但仍存在諸多尚未完全解決的問題。在Y家族DNA聚合酶對MNNG應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制方面，雖然已經(jīng)知道MNNG會引起相關(guān)基因表達的改變，如10μMMNNG可以引起POLH、POLI和POLK轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但對于具體的調(diào)控因子和信號通路，以及它們之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，尚未完全明晰。在MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答過程中，除了已知的E2F和STAT等相關(guān)信號通路可能在POLH、POLI和POLK的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起一定作用外，是否還存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵調(diào)控因子和信號通路，目前并不清楚。此外，不同Y家族DNA聚合酶成員在對MNNG應(yīng)答時，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制是否存在差異，以及這些差異如何影響細(xì)胞對MNNG損傷的修復(fù)和耐受，也有待進一步深入研究。在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控層面，Y家族DNA聚合酶的mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率以及蛋白質(zhì)修飾等過程在對MNNG應(yīng)答中的作用機制，同樣缺乏系統(tǒng)而深入的研究。雖然蛋白質(zhì)修飾如磷酸化、泛素化等對蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性具有重要影響，但在Y家族DNA聚合酶對MNNG應(yīng)答的情境下，這些修飾的具體位點、修飾酶以及它們?nèi)绾握{(diào)控Y家族DNA聚合酶的活性和功能，目前仍知之甚少。在mRNA穩(wěn)定性方面，哪些順式作用元件和反式作用因子參與了Y家族DNA聚合酶mRNA在MNNG處理后的穩(wěn)定性調(diào)控，以及這一過程如何影響Y家族DNA聚合酶的表達水平和細(xì)胞對MNNG損傷的應(yīng)答，也需要進一步探索。對Y家族DNA聚合酶與其他DNA損傷修復(fù)途徑在應(yīng)對MNNG損傷時的協(xié)同作用機制，研究也不夠充分。細(xì)胞內(nèi)存在多種DNA損傷修復(fù)途徑，如核苷酸切除修復(fù)（NER）、堿基切除修復(fù)（BER）等，它們與Y家族DNA聚合酶介導(dǎo)的跨損傷合成途徑之間存在著復(fù)雜的相互作用。在面對MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷時，這些修復(fù)途徑如何協(xié)同工作，以及Y家族DNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在這一協(xié)同過程中扮演怎樣的角色，目前還缺乏全面而深入的認(rèn)識。不同修復(fù)途徑之間是否存在優(yōu)先級順序，以及在不同程度的MNNG損傷下，細(xì)胞如何動態(tài)調(diào)節(jié)各修復(fù)途徑的活性以維持基因組的穩(wěn)定性，都是亟待解決的問題。綜上所述，盡管在Y家族DNA聚合酶與MNNG的研究方面已取得一定成果，但在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、與其他修復(fù)途徑的協(xié)同作用等多個關(guān)鍵領(lǐng)域仍存在諸多未知。深入研究這些問題，對于全面理解細(xì)胞應(yīng)對化學(xué)致癌物損傷的機制，以及開發(fā)更為有效的腫瘤預(yù)防和治療策略具有至關(guān)重要的意義。二、材料與方法2.1實驗材料本實驗選用人胚腎293T細(xì)胞系和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3作為研究對象。人胚腎293T細(xì)胞具有生長迅速、易于轉(zhuǎn)染等特點，廣泛應(yīng)用于基因表達和蛋白質(zhì)功能研究。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3則常用于細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤學(xué)研究，對化學(xué)致癌物的應(yīng)答反應(yīng)較為敏感，能夠為研究Y家族DNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供良好的細(xì)胞模型。在實驗前，將兩種細(xì)胞系分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗操作。實驗動物選用6-8周齡的SPF級C57BL/6小鼠，體重約為20-25g。小鼠購自正規(guī)實驗動物供應(yīng)商，在實驗動物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。實驗動物房溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%-60%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在動物實驗過程中，嚴(yán)格遵循動物實驗倫理規(guī)范，盡量減少動物的痛苦。主要試劑包括N-甲基-N-硝基-亞硝基胍（MNNG），購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，使用時用無水乙醇配制成10mM的儲存液，避光保存于-20℃冰箱。Trizol試劑用于細(xì)胞總RNA的提取，購自Invitrogen公司，其主要成分包括異硫氰酸胍、酚等，能夠有效裂解細(xì)胞，使核酸蛋白復(fù)合物解聚，從而分離出總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，該試劑盒能夠高效地將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時具有去除基因組DNA污染的功能，確保后續(xù)PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性。熒光定量PCR試劑采用Roche公司的LightCycler480SYBRGreenIMaster，可特異性地結(jié)合雙鏈DNA，在PCR擴增過程中實時監(jiān)測熒光信號的變化，從而實現(xiàn)對目的基因表達量的精確檢測。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司，包含螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶，通過檢測兩種熒光素酶的活性比值，能夠準(zhǔn)確分析基因啟動子的活性。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等工具酶購自NEB公司，具有高活性和特異性，可用于基因克隆和載體構(gòu)建過程中的DNA切割和連接反應(yīng)。質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒分別購自Qiagen公司和Omega公司，能夠高效地提取和純化質(zhì)粒DNA以及回收PCR擴增產(chǎn)物和酶切片段，保證DNA的質(zhì)量和純度。主要儀器設(shè)備有高速冷凍離心機（Eppendorf5424R），最大轉(zhuǎn)速可達16,000rpm，可用于細(xì)胞和組織的離心分離、RNA和DNA的沉淀等操作；實時熒光定量PCR儀（RocheLightCycler480），具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等特點，可實現(xiàn)對基因表達量的實時監(jiān)測和分析；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMP），能夠?qū)Ν傊悄z和聚丙烯酰胺凝膠進行成像和分析，用于檢測PCR產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的表達情況；超凈工作臺（蘇州凈化SW-CJ-2FD），為細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實驗提供無菌操作環(huán)境；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111），可精確控制溫度、濕度和CO?濃度，滿足細(xì)胞生長的需求；恒溫?fù)u床（NewBrunswickInnova42），用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的振蕩培養(yǎng)，促進細(xì)胞的均勻生長和營養(yǎng)物質(zhì)的充分?jǐn)z取。2.2實驗方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人胚腎293T細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3分別接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進行一次換液，當(dāng)細(xì)胞密度達到80%-90%時，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進行傳代培養(yǎng)。在進行MNNG處理實驗時，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×10?個，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并生長良好。然后，吸去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基。向各孔中加入含有不同濃度MNNG（0、5、10、20μM）的新鮮培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24h。在處理時間結(jié)束后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗，如RNA提取、蛋白質(zhì)提取等。在實驗過程中，設(shè)置未處理的細(xì)胞作為對照組，以對比分析MNNG處理對細(xì)胞的影響。2.2.2RNA提取與定量RT-PCR采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。具體操作如下：將MNNG處理后的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌2次后，每孔加入1mLTrizol試劑，用移液器吹打均勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)。隨后，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，使溶液充分混合，室溫放置3min，促進相分離。將樣品置于4℃、12,000rpm條件下離心15min，此時溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀析出。再次于4℃、12,000rpm條件下離心10min，棄去上清液，此時管底可見白色的RNA沉淀。向沉淀中加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕洗滌沉淀，4℃、7,500rpm離心5min，棄去上清液，重復(fù)洗滌一次。將離心管倒置在干凈的濾紙上，晾干RNA沉淀，注意避免過度干燥導(dǎo)致RNA難以溶解。最后，加入適量的無RNA酶水溶解RNA沉淀，置于冰上備用。使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定提取的RNA濃度和純度，記錄260nm和280nm波長處的吸光度值（OD值），計算OD???/OD???比值，理想情況下該比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和酚等雜質(zhì)污染。若比值低于1.8，說明可能存在蛋白質(zhì)污染，需進一步純化；若比值高于2.0，可能存在RNA降解或有殘留的試劑污染。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，表明RNA完整性良好，無明顯降解。將提取的RNA按照TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。首先，在無RNA酶的PCR管中加入適量的RNA模板（一般為1-2μg），然后加入5×PrimeScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、Oligo(dT)Primer1μL、Random6mers1μL，用無RNA酶水補足至10μL，輕輕混勻。將反應(yīng)管置于PCR儀中，按照以下程序進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃孵育15min，使逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮作用，合成cDNA；85℃加熱5s，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物置于冰上或-20℃保存?zhèn)溆?。以合成的cDNA為模板，利用Roche公司的LightCycler480SYBRGreenIMaster進行定量PCR擴增。在96孔板中配制20μL反應(yīng)體系，包括10μL2×SYBRGreenIMaster、上下游引物各0.5μL（10μM）、cDNA模板1μL，用ddH?O補足至20μL。引物序列根據(jù)目的基因（如Y家族DNA聚合酶相關(guān)基因POLH、POLI、POLK等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性5min，使DNA模板充分變性；然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性10s，使雙鏈DNA解鏈；60℃退火30s，引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸30s，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。在PCR擴增過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法或ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進行校正，以消除不同樣本間RNA上樣量和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異，從而準(zhǔn)確反映目的基因在不同處理組中的表達變化情況。2.2.3報告基因?qū)嶒灷肞CR技術(shù)擴增Y家族DNA聚合酶相關(guān)基因（如POLH、POLI、POLK）的啟動子區(qū)域。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中目的基因的基因組序列，設(shè)計特異性引物，引物兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶位點，以便后續(xù)與報告基因載體連接。以人基因組DNA為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上下游引物各1μL（10μM）、基因組DNA模板1μL，用ddH?O補足至25μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58-62℃退火30s（根據(jù)引物Tm值調(diào)整退火溫度），72℃延伸1-2min（根據(jù)擴增片段長度調(diào)整延伸時間），共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，使擴增產(chǎn)物充分延伸。PCR擴增結(jié)束后，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否擴增出預(yù)期大小的條帶。將擴增得到的啟動子片段和pGL3-Basic熒光素酶報告基因載體分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包括10×Buffer2μL、限制性內(nèi)切酶1和2各1μL、DNA模板（啟動子片段或載體）1μg，用ddH?O補足至20μL。將反應(yīng)管置于37℃水浴中孵育2-3h，使酶切反應(yīng)充分進行。酶切結(jié)束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收酶切后的啟動子片段和載體片段，去除未酶切的DNA和酶切產(chǎn)生的小片段雜質(zhì)。將回收的啟動子片段和pGL3-Basic載體片段按照一定比例（通常為3:1-10:1）加入到含有T4DNA連接酶的連接反應(yīng)體系中，16℃連接過夜。連接反應(yīng)體系包括10×T4DNALigaseBuffer1μL、T4DNALigase1μL、啟動子片段3-5μL、載體片段1μL，用ddH?O補足至10μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，置于冰上解凍，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min；然后將離心管置于42℃水浴中熱激90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上冷卻2-3min；加入500μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞復(fù)蘇并表達抗生素抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，次日觀察平板上的菌落生長情況。挑取單菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和測序驗證，確保啟動子片段正確插入到報告基因載體中，構(gòu)建得到重組報告基因載體。將構(gòu)建成功的重組報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒（如pRL-TK，表達海腎熒光素酶）共轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞或其他合適的細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達到70%-80%。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）進行轉(zhuǎn)染，按照試劑說明書操作。在無菌離心管中分別配制A液和B液，A液為將1μL重組報告基因載體和0.1μL內(nèi)參質(zhì)粒加入到50μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻；B液為將1.5μLLipofectamine3000試劑加入到50μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將A液和B液室溫靜置5min后，混合均勻，室溫靜置20min，使脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的24孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6h，更換為含有10%FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每孔加入100μL1×PassiveLysisBuffer，室溫振蕩裂解細(xì)胞15min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出熒光素酶。將裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃、12,000rpm離心5min，取上清液用于熒光素酶活性檢測。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（如Promega公司的Dual-LuciferaseReporterAssaySystem），按照說明書操作，在熒光酶標(biāo)儀上依次檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為啟動子的相對活性，比較不同處理組（如MNNG處理組和對照組）之間啟動子活性的差異，從而分析MNNG對Y家族DNA聚合酶基因啟動子活性的影響。2.2.4生物信息學(xué)分析利用在線生物信息學(xué)工具如Promoter2.0PredictionServer、NNPP（NeuralNetworkPromoterPrediction）等預(yù)測Y家族DNA聚合酶相關(guān)基因（POLH、POLI、POLK）的啟動子區(qū)域。在Promoter2.0PredictionServer中，將目的基因上游2000-3000bp的DNA序列輸入到相應(yīng)的文本框中，選擇合適的物種（如人類），設(shè)置相關(guān)參數(shù)（如默認(rèn)參數(shù)），提交分析請求。該工具基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，通過識別啟動子區(qū)域的特征序列（如TATA盒、CCAAT盒等）和轉(zhuǎn)錄起始位點的保守模式，預(yù)測啟動子的位置和強度，并輸出預(yù)測結(jié)果，包括可能的啟動子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點的位置以及預(yù)測的可靠性評分等信息。在NNPP中，同樣輸入目的基因的上游DNA序列，選擇相應(yīng)的物種模型，運行預(yù)測程序，該工具利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對啟動子進行預(yù)測，給出預(yù)測的啟動子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點，并提供預(yù)測的置信度值，以評估預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用MatInspector、JASPAR等在線數(shù)據(jù)庫和軟件預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。在MatInspector中，將預(yù)測得到的啟動子序列輸入到搜索框中，選擇合適的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（如TRANSFAC等），設(shè)置搜索參數(shù)（如最小矩陣相似性閾值等），點擊搜索按鈕。該軟件基于矩陣搜索算法，通過將輸入的DNA序列與已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點矩陣進行比對，識別出可能與啟動子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點，并給出結(jié)合位點的位置、序列以及與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的親和力評分等信息。在JASPAR中，選擇相應(yīng)的物種和轉(zhuǎn)錄因子家族，將啟動子序列上傳，運行分析程序，該數(shù)據(jù)庫提供了大量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點信息，通過與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行匹配，預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并展示轉(zhuǎn)錄因子的名稱、結(jié)合位點的序列模式以及預(yù)測的可信度等內(nèi)容。通過對多個軟件和數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果進行綜合分析，篩選出與Y家族DNA聚合酶基因啟動子可能結(jié)合的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，為后續(xù)實驗驗證提供理論依據(jù)。2.2.5DNApulldown-質(zhì)譜檢測根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測得到的Y家族DNA聚合酶基因啟動子序列，合成生物素標(biāo)記的雙鏈DNA探針。將啟動子序列進行PCR擴增，在擴增引物的5'端添加生物素修飾，擴增得到的PCR產(chǎn)物即為生物素標(biāo)記的DNA探針。對PCR產(chǎn)物進行純化，去除未反應(yīng)的引物、dNTP等雜質(zhì)，使用DNA純化試劑盒按照說明書操作，通過柱層析的方法純化DNA探針，最后用適量的TE緩沖液洗脫，得到高純度的生物素標(biāo)記DNA探針。將細(xì)胞用MNNG處理或作為對照未處理，收集細(xì)胞，用冰冷的PBS緩沖液洗滌2次，加入適量的細(xì)胞裂解緩沖液（如含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液），冰上裂解30min，期間不斷輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液于4℃、12,000rpm離心15min，取上清液，得到細(xì)胞蛋白提取物。將生物素標(biāo)記的DNA探針與鏈霉親和素磁珠按照一定比例（如1:10-1:20）混合，加入適量的結(jié)合緩沖液（如含有NaCl、Tris-HCl、EDTA等的緩沖液），室溫孵育30min，使探針與磁珠充分結(jié)合。將結(jié)合了探針的磁珠加入到細(xì)胞蛋白提取物中，4℃緩慢振蕩孵育2-4h，使DNA探針與細(xì)胞蛋白提取物中的轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，將樣品置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁上，棄去上清液，用洗滌緩沖液（如含有較高鹽濃度的結(jié)合緩沖液）洗滌磁珠3-5次，每次洗滌后都將磁珠置于磁力架上，棄去上清液，以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。在洗滌后的磁珠中加入適量的洗脫緩沖液（如含有高濃度鹽或競爭性DNA的緩沖液），室溫孵育15-30min，使結(jié)合在磁珠上的轉(zhuǎn)錄因子從DNA探針上洗脫下來。將洗脫液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，進行SDS-PAGE電泳分析，將洗脫的蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠上進行分離，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小在凝膠上形成不同的條帶。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液對凝膠進行染色，使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)出來。將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶切下，進行胰蛋白酶酶切，將蛋白質(zhì)切成小肽段。酶切后的肽段進行質(zhì)譜分析，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）對肽段進行分析，通過質(zhì)譜儀檢測肽段的質(zhì)荷比（m/z），得到肽段的質(zhì)譜圖。將質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（如Uniprot等）進行比對，通過數(shù)據(jù)庫搜索和匹配算法，鑒定出與啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的種類和序列信息。通過對鑒定結(jié)果的分析，篩選出與Y家族DNA聚合酶基因啟動子在MNNG應(yīng)答過程中可能起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，為深入研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供重要線索。三、Y家族DNA聚合酶基因啟動子預(yù)測及分析3.1POLH、POLI和POLK基因5'調(diào)控區(qū)保守性分析為深入探究Y家族DNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，本研究首先對POLH、POLI和POLK基因的5'調(diào)控區(qū)在不同物種間的保守性進行了細(xì)致分析。運用ClustalW軟件，將人類的POLH、POLI和POLK基因5'調(diào)控區(qū)序列與小鼠、大鼠、猩猩等多個物種的相應(yīng)序列進行多序列比對。這一軟件基于漸進比對的算法，能夠有效識別不同序列間的相似性和差異性，從而為保守性分析提供可靠的數(shù)據(jù)支持。在POLH基因5'調(diào)控區(qū)的比對結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，人類與猩猩的序列相似性高達95%以上。從具體的序列位點來看，在轉(zhuǎn)錄起始位點上游約-200到-100區(qū)域，二者的堿基序列幾乎完全一致，這表明在靈長類動物進化過程中，該區(qū)域受到了強烈的進化選擇壓力，可能包含重要的順式作用元件，對POLH基因的轉(zhuǎn)錄起始起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。人類與小鼠的POLH基因5'調(diào)控區(qū)序列相似性約為70%。在-500到-300區(qū)域，雖然存在一些堿基的替換和缺失，但仍能觀察到部分保守的基序，如一段富含GC的序列在兩個物種中都較為穩(wěn)定，推測其可能與某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合相關(guān)，在不同物種中參與調(diào)控POLH基因的表達。對于POLI基因，人類與猩猩的5'調(diào)控區(qū)序列相似性同樣達到了90%以上。在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的-150到+50區(qū)域，二者的序列高度保守，這一區(qū)域可能包含核心啟動子元件，對于POLI基因轉(zhuǎn)錄的精確起始至關(guān)重要。人類與大鼠的POLI基因5'調(diào)控區(qū)序列相似性約為65%。在-400到-200區(qū)域，存在一些物種特異性的序列變化，但也有部分短片段的保守序列，這些保守序列可能在不同物種中通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，實現(xiàn)對POLI基因表達的差異化調(diào)控。在POLK基因5'調(diào)控區(qū)的分析中，人類與猩猩的序列相似性約為93%。在-300到-150區(qū)域，二者的序列一致性較高，其中包含的一些特定序列模式，如TATA盒類似序列，在兩個物種中位置和序列都較為保守，提示其在轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控中具有重要作用。人類與小鼠的POLK基因5'調(diào)控區(qū)序列相似性為72%。在-600到-400區(qū)域，盡管存在一定的序列差異，但仍能找到一些保守的功能性元件，如潛在的增強子或沉默子元件，它們可能在不同物種中參與調(diào)節(jié)POLK基因的表達水平和時空特異性。通過對不同物種間POLH、POLI和POLK基因5'調(diào)控區(qū)保守性的分析，不僅揭示了這些基因在進化過程中的保守特征，也為后續(xù)預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和深入研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了重要線索。保守性較高的區(qū)域可能包含關(guān)鍵的順式作用元件，與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合密切相關(guān)，進而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性和表達水平。這些發(fā)現(xiàn)為進一步理解Y家族DNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，有助于深入探究細(xì)胞在應(yīng)對DNA損傷等生理過程中，這些基因的表達調(diào)控機制以及它們在維持基因組穩(wěn)定性中的作用。3.2POLH、POLI和POLK啟動子預(yù)測運用生物信息學(xué)手段對POLH、POLI和POLK基因的啟動子區(qū)域進行精準(zhǔn)預(yù)測，是深入探究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的關(guān)鍵步驟。本研究借助Promoter2.0PredictionServer、NNPP（NeuralNetworkPromoterPrediction）等專業(yè)的在線生物信息學(xué)工具開展相關(guān)工作。在利用Promoter2.0PredictionServer進行預(yù)測時，首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取POLH、POLI和POLK基因上游2000-3000bp的DNA序列。將這些序列逐一輸入到Promoter2.0PredictionServer的相應(yīng)文本框中，并準(zhǔn)確選擇人類物種選項，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置后提交分析請求。該工具基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，能夠敏銳地識別啟動子區(qū)域的特征序列。就POLH基因而言，經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄起始位點上游約-1000到-800區(qū)域存在一個潛在的啟動子區(qū)域，該區(qū)域包含典型的TATA盒序列（TATAAA），其位置與經(jīng)典的啟動子結(jié)構(gòu)中TATA盒的位置相符，提示該區(qū)域可能在POLH基因轉(zhuǎn)錄起始過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對于POLI基因，預(yù)測結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1200到-1000區(qū)域有啟動子存在的可能性，其中包含一段富含GC的序列，GC含量高達70%以上，這種富含GC的序列常常與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控密切相關(guān)。在對POLK基因的預(yù)測中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點上游-900到-700區(qū)域可能是啟動子區(qū)域，該區(qū)域存在一些保守的短序列模體，這些模體在其他物種的同源基因啟動子中也有出現(xiàn)，進一步暗示了其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要性。使用NNPP進行預(yù)測時，同樣輸入上述獲取的基因上游DNA序列，并選擇相應(yīng)的人類物種模型后運行預(yù)測程序。對于POLH基因，NNPP預(yù)測出在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1100左右存在一個啟動子區(qū)域，預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點與Promoter2.0PredictionServer的結(jié)果雖略有差異，但都集中在相近的區(qū)域，且該區(qū)域周圍的序列特征與啟動子的一般特征相符。在POLI基因的預(yù)測中，NNPP確定了轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1300到-1100區(qū)域為潛在啟動子區(qū)域，該區(qū)域的序列經(jīng)分析與已知的啟動子序列具有一定的相似性，并且在進化過程中相對保守。對于POLK基因，NNPP預(yù)測的啟動子區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-850到-650區(qū)域，其中包含一些特殊的核苷酸排列模式，這些模式可能參與了轉(zhuǎn)錄因子的識別和結(jié)合過程。綜合Promoter2.0PredictionServer和NNPP的預(yù)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者在預(yù)測POLH、POLI和POLK基因啟動子區(qū)域時，雖然在具體的邊界和轉(zhuǎn)錄起始位點的確定上存在一定差異，但總體上都指向了相似的基因上游區(qū)域。對于POLH基因，兩個工具都預(yù)測到轉(zhuǎn)錄起始位點上游-800到-1200區(qū)域是啟動子的高可能性區(qū)域；對于POLI基因，-1000到-1300區(qū)域被兩個工具共同認(rèn)為是潛在啟動子所在；對于POLK基因，-650到-900區(qū)域在兩個工具的預(yù)測中都表現(xiàn)出啟動子的特征。這些共同預(yù)測的區(qū)域為后續(xù)深入研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了重要的靶點，表明這些區(qū)域極有可能包含關(guān)鍵的順式作用元件，參與調(diào)控Y家族DNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄過程，為進一步通過實驗驗證啟動子功能以及探究轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的相互作用奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.3轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測在明確了POLH、POLI和POLK基因的啟動子區(qū)域后，運用MatInspector、JASPAR等專業(yè)的在線數(shù)據(jù)庫和軟件，對這些基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點展開深入預(yù)測分析，旨在揭示潛在的轉(zhuǎn)錄因子，為后續(xù)探究轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。在使用MatInspector進行預(yù)測時，將前文預(yù)測得到的POLH基因啟動子序列完整輸入到搜索框中，并精心選擇TRANSFAC轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫，同時合理設(shè)置最小矩陣相似性閾值為0.85。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在POLH基因啟動子區(qū)的-500到-450區(qū)域，存在一個與轉(zhuǎn)錄因子E2F1高度匹配的結(jié)合位點。該結(jié)合位點的核心序列為TTTCGCGC，與E2F1的經(jīng)典結(jié)合序列具有極高的相似性，且MatInspector給出的結(jié)合親和力評分為0.92，表明二者具有較強的結(jié)合能力。E2F1作為細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其與POLH基因啟動子的結(jié)合，暗示著POLH基因的表達可能與細(xì)胞周期進程緊密相關(guān)，在細(xì)胞周期的特定階段，E2F1或許通過與該結(jié)合位點相互作用，調(diào)控POLH基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而影響細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力和基因組的穩(wěn)定性。在-300到-250區(qū)域，預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點，其核心序列為GGGCGG，這是Sp1的典型識別序列，MatInspector給出的親和力評分為0.88。Sp1是一種廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其與POLH基因啟動子的結(jié)合，可能在POLH基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄以及對各種刺激的應(yīng)答轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用。運用JASPAR數(shù)據(jù)庫對POLH基因啟動子進行分析時，選擇人類物種和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族后上傳啟動子序列。結(jié)果顯示，在-700到-650區(qū)域，預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子AP-1的結(jié)合位點。AP-1是一種由c-Jun和c-Fos等蛋白組成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、增殖和分化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其結(jié)合位點的序列為TGAGTCA，與AP-1的結(jié)合模式相符，預(yù)測的可信度較高。這一發(fā)現(xiàn)提示，在細(xì)胞受到MNNG等化學(xué)致癌物刺激時，可能通過激活相關(guān)信號通路，促使AP-1與POLH基因啟動子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)POLH基因的表達，以應(yīng)對DNA損傷帶來的挑戰(zhàn)。對于POLI基因啟動子區(qū)，利用MatInspector分析發(fā)現(xiàn)，在-800到-750區(qū)域存在E2F4的結(jié)合位點，其核心序列為TTTCCCGC，結(jié)合親和力評分為0.86。E2F4與E2F1同屬E2F家族，但其功能和調(diào)控機制存在一定差異。E2F4與POLI基因啟動子的結(jié)合，表明POLI基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能也受到細(xì)胞周期相關(guān)信號的影響，且與POLH基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上既有相似之處，也存在不同的調(diào)控模式。在-150到-100區(qū)域，預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合位點，核心序列為GGGGACTTTCC，親和力評分為0.87。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其與POLI基因啟動子的結(jié)合，暗示著POLI基因的表達可能受到炎癥和免疫相關(guān)信號通路的調(diào)控，在細(xì)胞應(yīng)對外界刺激和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有重要意義。使用JASPAR數(shù)據(jù)庫對POLI基因啟動子分析時，在-400到-350區(qū)域預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子CREB的結(jié)合位點，其序列為TGACGTCA，與CREB的經(jīng)典結(jié)合序列一致，預(yù)測可信度較高。CREB是一種受多種細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，其與POLI基因啟動子的結(jié)合，表明POLI基因的表達可能受到細(xì)胞內(nèi)多種信號分子的調(diào)控，通過與CREB的相互作用，實現(xiàn)對POLI基因轉(zhuǎn)錄的精細(xì)調(diào)節(jié)，以適應(yīng)細(xì)胞不同的生理狀態(tài)和外界環(huán)境變化。在對POLK基因啟動子區(qū)的分析中，MatInspector預(yù)測在-600到-550區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子STAT3的結(jié)合位點，核心序列為TTCNNNGAA，結(jié)合親和力評分為0.85。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族的成員，在細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖和存活等過程中發(fā)揮重要作用。其與POLK基因啟動子的結(jié)合，提示POLK基因的表達可能受到細(xì)胞因子相關(guān)信號通路的調(diào)控，在細(xì)胞的生長、發(fā)育和對環(huán)境刺激的應(yīng)答中具有潛在的調(diào)節(jié)作用。在-250到-200區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子Oct-1的結(jié)合位點，核心序列為ATGCAAAT，親和力評分為0.88。Oct-1是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的表達調(diào)控，其與POLK基因啟動子的結(jié)合，表明POLK基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能涉及到細(xì)胞的基本生理過程和多種生物學(xué)功能的維持。利用JASPAR數(shù)據(jù)庫分析POLK基因啟動子，在-900到-850區(qū)域預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子YY1的結(jié)合位點，序列為ATTTGCAT，預(yù)測可信度較高。YY1是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，既可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子，也可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，其與POLK基因啟動子的結(jié)合，表明POLK基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控較為復(fù)雜，YY1可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控元件相互作用，共同調(diào)節(jié)POLK基因的表達水平和轉(zhuǎn)錄活性，以滿足細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下的需求。通過對POLH、POLI和POLK基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測分析，篩選出了多個潛在的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子涉及細(xì)胞周期調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥免疫、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)等多個重要的生物學(xué)過程。它們與相應(yīng)基因啟動子的結(jié)合，為深入研究Y家族DNA聚合酶基因在面對MNNG等化學(xué)致癌物時的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了關(guān)鍵線索，后續(xù)將通過實驗進一步驗證這些轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的相互作用及其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的具體功能。3.4共同轉(zhuǎn)錄因子及信號通路分析通過對POLH、POLI和POLK基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測結(jié)果進行深入分析，發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)錄因子在這三個基因的啟動子區(qū)均有結(jié)合位點，其中E2F家族成員和STAT3備受關(guān)注，它們可能在Y家族DNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且與MNNG誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答密切相關(guān)。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，E2F家族成員（如E2F1、E2F4等）與POLH、POLI和POLK基因啟動子區(qū)的結(jié)合具有重要意義。E2F家族在細(xì)胞周期進程中扮演著核心調(diào)控角色，其家族成員通過與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控一系列與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達。E2F1在細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它可以激活許多參與DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖的基因表達。當(dāng)細(xì)胞受到MNNG損傷時，細(xì)胞周期進程可能會受到干擾，而E2F1與POLH、POLI和POLK基因啟動子的結(jié)合，可能會調(diào)節(jié)這些基因的表達，以適應(yīng)細(xì)胞周期的變化。在MNNG處理后，細(xì)胞可能會出現(xiàn)DNA損傷應(yīng)答，E2F1可能通過與POLH基因啟動子的結(jié)合，上調(diào)POLH基因的表達，增強細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力，從而保證細(xì)胞在損傷條件下仍能維持基本的生命活動。對于E2F4，雖然其功能與E2F1存在一定差異，但同樣參與細(xì)胞周期的調(diào)控，它與POLI基因啟動子的結(jié)合，可能在細(xì)胞周期的特定階段，對POLI基因的表達進行精細(xì)調(diào)節(jié)，以維持細(xì)胞周期的正常運行。在細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)和免疫炎癥反應(yīng)方面，STAT3與POLK基因啟動子區(qū)的結(jié)合以及NF-κB與POLI基因啟動子區(qū)的結(jié)合具有重要的生物學(xué)意義。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員，在細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子刺激時，細(xì)胞表面的受體被激活，進而激活下游的JAK激酶，JAK激酶磷酸化STAT3，使其形成二聚體并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動子區(qū)的特定序列結(jié)合，調(diào)控基因表達。在MNNG誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中，細(xì)胞可能會分泌一些細(xì)胞因子，激活STAT3信號通路，STAT3與POLK基因啟動子結(jié)合，可能會調(diào)節(jié)POLK基因的表達，參與細(xì)胞對損傷的修復(fù)和免疫應(yīng)答過程。NF-κB是一種在免疫炎癥反應(yīng)中起核心作用的轉(zhuǎn)錄因子，它通常以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激、病原體感染等外界信號時，IκB激酶被激活，磷酸化IκB，使其降解，釋放出NF-κB，NF-κB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動子結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在MNNG處理的細(xì)胞中，可能會引發(fā)炎癥反應(yīng)，激活NF-κB信號通路，NF-κB與POLI基因啟動子結(jié)合，可能會調(diào)節(jié)POLI基因的表達，參與細(xì)胞的免疫炎癥應(yīng)答，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。綜上所述，通過對共同轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)信號通路的分析，揭示了Y家族DNA聚合酶基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)、免疫炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程的緊密聯(lián)系。在MNNG誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷應(yīng)答中，這些轉(zhuǎn)錄因子和信號通路可能協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)Y家族DNA聚合酶基因的表達，以維持基因組的穩(wěn)定性和細(xì)胞的正常生理功能。這為進一步深入研究Y家族DNA聚合酶對MNNG應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了重要線索，也為理解細(xì)胞應(yīng)對化學(xué)致癌物損傷的分子機制奠定了基礎(chǔ)。四、Y家族DNA聚合酶啟動子活性及其對MNNG應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)控4.1MNNG的細(xì)胞毒性效應(yīng)為深入探究MNNG對細(xì)胞的毒性作用，本研究將人胚腎293T細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3作為研究對象，進行了MNNG處理實驗。實驗設(shè)置了不同濃度梯度的MNNG，分別為0（對照組）、5、10、20μM，處理時間分別為6、12、24h，每個濃度和時間點設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過MTT比色法對細(xì)胞存活率進行檢測。MTT是一種黃色的四氮唑鹽，可被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。在實驗中，將不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時間后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。然后，吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），以未處理的對照組細(xì)胞OD值為100%，計算各處理組細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，隨著MNNG濃度的升高和處理時間的延長，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。在人胚腎293T細(xì)胞中，當(dāng)MNNG濃度為5μM，處理6h時，細(xì)胞存活率約為85%；處理12h后，存活率降至75%左右；處理24h后，存活率進一步下降至60%。當(dāng)MNNG濃度增加到10μM時，處理6h后細(xì)胞存活率約為70%，12h后降至55%，24h后僅為40%。當(dāng)MNNG濃度達到20μM時，處理6h后細(xì)胞存活率就已降至50%以下，12h后約為30%，24h后細(xì)胞存活率極低，不足20%。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3中，也觀察到了類似的趨勢。5μMMNNG處理6h后，細(xì)胞存活率約為80%，隨著處理時間延長至12h和24h，存活率分別降至65%和50%。10μMMNNG處理下，6h時細(xì)胞存活率為60%，12h后降至45%，24h后為30%。20μMMNNG處理時，6h后細(xì)胞存活率僅為35%，12h后降至20%，24h后細(xì)胞幾乎全部死亡。采用CCK-8法對細(xì)胞增殖能力進行評估。CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與細(xì)胞增殖數(shù)量成正比。在實驗中，將不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時間后，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的OD值，以未處理的對照組細(xì)胞OD值為基礎(chǔ)，計算各處理組細(xì)胞的相對增殖率。實驗結(jié)果表明，MNNG對細(xì)胞增殖能力具有顯著的抑制作用，且抑制程度與MNNG濃度和處理時間密切相關(guān)。在人胚腎293T細(xì)胞中，5μMMNNG處理6h后，細(xì)胞相對增殖率約為80%，處理12h后降至65%，24h后為50%。10μMMNNG處理時，6h后細(xì)胞相對增殖率為60%，12h后降至40%，24h后僅為25%。20μMMNNG處理下，6h后細(xì)胞相對增殖率已降至30%以下，12h后約為15%，24h后幾乎檢測不到細(xì)胞增殖。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3中，5μMMNNG處理6h后，細(xì)胞相對增殖率約為75%，隨著處理時間延長至12h和24h，相對增殖率分別降至55%和35%。10μMMNNG處理時，6h后細(xì)胞相對增殖率為50%，12h后降至30%，24h后為15%。20μMMNNG處理下，6h后細(xì)胞相對增殖率僅為20%，12h后降至10%，24h后細(xì)胞幾乎停止增殖。通過以上MTT比色法和CCK-8法的檢測結(jié)果可以明確，MNNG對人胚腎293T細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3具有明顯的細(xì)胞毒性效應(yīng)，能夠顯著降低細(xì)胞存活率和抑制細(xì)胞增殖能力，且這種毒性效應(yīng)隨著MNNG濃度的升高和處理時間的延長而增強。這一結(jié)果為后續(xù)研究Y家族DNA聚合酶對MNNG應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了重要的細(xì)胞模型和實驗依據(jù)，表明在MNNG誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷環(huán)境下，細(xì)胞可能會啟動一系列的應(yīng)激反應(yīng)，包括對Y家族DNA聚合酶基因表達的調(diào)控，以應(yīng)對DNA損傷和維持細(xì)胞的基本功能。4.2POLH啟動子活性及其對MNNG應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄調(diào)控4.2.1POLH啟動子截短體構(gòu)建與活性分析為深入剖析POLH基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制，本研究精心構(gòu)建了一系列POLH啟動子截短體，并對其在正常狀態(tài)以及MNNG處理后的啟動子活性展開了系統(tǒng)分析。首先，依據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測所確定的POLH啟動子區(qū)域，運用PCR技術(shù)精準(zhǔn)擴增出包含不同長度片段的啟動子序列。設(shè)計了5個不同長度的截短體，分別為P1（-2000/+100，轉(zhuǎn)錄起始位點為+1）、P2（-1500/+100）、P3（-1000/+100）、P4（-500/+100）和P5（-200/+100）。在擴增過程中，引物設(shè)計至關(guān)重要，通過在引物兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶位點，如HindIII和XhoI，為后續(xù)與pGL3-Basic熒光素酶報告基因載體的連接提供了便利。將擴增得到的不同長度的POLH啟動子截短體與pGL3-Basic載體進行雙酶切處理，確保酶切反應(yīng)充分進行，以獲得線性化的載體和目的片段。利用T4DNA連接酶將酶切后的啟動子截短體與載體進行連接，構(gòu)建重組報告基因載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，挑選出陽性克隆。對陽性克隆進行質(zhì)粒提取，并進行雙酶切鑒定和測序驗證，以確保啟動子截短體正確插入到載體中，且序列無突變。將構(gòu)建成功的重組報告基因載體分別轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞中，同時轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK，以校正轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48h后，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的質(zhì)粒和雜質(zhì)。每孔加入100μL1×PassiveLysisBuffer，室溫振蕩裂解細(xì)胞15min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出熒光素酶。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，在熒光酶標(biāo)儀上依次檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為啟動子的相對活性。在正常培養(yǎng)條件下，對不同POLH啟動子截短體的活性進行檢測。結(jié)果顯示，P1（-2000/+100）的啟動子活性最高，其相對活性值為1.00，作為參照基準(zhǔn)。P2（-1500/+100）的啟動子活性略低于P1，相對活性為0.85，表明從-2000到-1500區(qū)域可能包含一些增強子元件，對啟動子活性具有促進作用。P3（-1000/+100）的啟動子活性進一步降低，相對活性為0.60，說明-1500到-1000區(qū)域可能存在重要的順式作用元件，缺失該區(qū)域會顯著影響啟動子活性。P4（-500/+100）的啟動子活性僅為0.30，提示-1000到-500區(qū)域可能包含多個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，對啟動子活性的維持至關(guān)重要。P5（-200/+100）的啟動子活性最低，相對活性為0.10，表明-500到-200區(qū)域可能是核心啟動子區(qū)域，包含基本的轉(zhuǎn)錄起始元件。為探究MNNG對POLH啟動子活性的影響，將轉(zhuǎn)染了不同重組報告基因載體的細(xì)胞用10μMMNNG處理24h后，再次檢測啟動子活性。結(jié)果表明，在MNNG處理后，P1（-2000/+100）的啟動子活性顯著增強，相對活性升高至1.80，說明MNNG可能通過作用于-2000到+100區(qū)域內(nèi)的某些順式作用元件或轉(zhuǎn)錄因子，激活了POLH基因的轉(zhuǎn)錄。P2（-1500/+100）在MNNG處理后的啟動子活性也有所增加，相對活性達到1.50，表明-1500到+100區(qū)域?qū)NNG的應(yīng)答較為敏感，可能存在與MNNG誘導(dǎo)的信號通路相關(guān)的調(diào)控元件。P3（-1000/+100）在MNNG處理后的啟動子活性升高至1.20，進一步證實了-1000到+100區(qū)域在MNNG誘導(dǎo)的POLH基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用。P4（-500/+100）在MNNG處理后的啟動子活性僅略有增加，相對活性為0.40，說明-500到+100區(qū)域?qū)NNG的應(yīng)答相對較弱，可能不是MNNG調(diào)控POLH基因轉(zhuǎn)錄的主要作用區(qū)域。P5（-200/+100）在MNNG處理后的啟動子活性幾乎沒有變化，相對活性仍為0.10，表明-200到+100區(qū)域可能不參與MNNG誘導(dǎo)的POLH基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。通過對POLH啟動子截短體的構(gòu)建與活性分析，明確了不同長度的啟動子區(qū)域在正常及MNNG處理條件下的活性變化情況。這為進一步深入研究POLH基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，尤其是MNNG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，提供了重要的實驗依據(jù)，有助于揭示POLH基因在應(yīng)對化學(xué)致癌物損傷時的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，為后續(xù)探究相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的相互作用奠定了堅實基礎(chǔ)。4.2.2IRF1對POLH轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響為深入探究IRF1在POLH轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的作用機制，本研究運用多種實驗技術(shù)，從基因表達和啟動子活性等層面展開了系統(tǒng)研究。首先，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)實現(xiàn)IRF1的過表達。將攜帶IRF1基因的真核表達載體（pcDNA3.1-IRF1）轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達到70%-80%。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000進行轉(zhuǎn)染，按照試劑說明書操作，將pcDNA3.1-IRF1質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合形成復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，提取總RNA，通過定量RT-PCR檢測POLH基因的表達水平。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照組，以GAPDH作為內(nèi)參基因進行校正。結(jié)果顯示，過表達IRF1組的POLH基因mRNA表達水平相較于對照組顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)約為3.5倍，這表明IRF1能夠促進POLH基因的轉(zhuǎn)錄。為進一步驗證IRF1對POLH基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，采用RNA干擾技術(shù)敲低細(xì)胞內(nèi)IRF1的表達。設(shè)計并合成針對IRF1的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染方法同基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。通過定量RT-PCR檢測IRF1和POLH基因的表達水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染IRF1-siRNA后，IRF1基因的mRNA表達水平顯著降低，相較于對照組下降了約70%。與此同時，POLH基因的mRNA表達水平也明顯下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)約為2.0倍，這進一步證實了IRF1在POLH基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著正向調(diào)控作用。為深入探究IRF1對POLH基因啟動子活性的影響，運用報告基因?qū)嶒炦M行檢測。將構(gòu)建的包含POLH啟動子區(qū)域（-2000/+100）的熒光素酶報告基因載體（pGL3-POLH-2000）與pcDNA3.1-IRF1共轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞中。同時設(shè)置對照組，轉(zhuǎn)染pGL3-POLH-2000和空載體pcDNA3.1。轉(zhuǎn)染48h后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，加入1×PassiveLysisBuffer裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IRF1組的POLH啟動子活性相較于對照組顯著增強，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值增加了約2.8倍，表明IRF1能夠增強POLH基因啟動子的活性，從而促進POLH基因的轉(zhuǎn)錄。為進一步明確IRF1與POLH啟動子的結(jié)合位點及作用機制，對POLH啟動子區(qū)進行了詳細(xì)分析。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，POLH啟動子區(qū)存在兩個潛在的IRF1結(jié)合位點，分別位于-898位和-590位。為驗證這兩個位點的功能，構(gòu)建了針對這兩個位點的突變體，即將-898位和-590位的IRF1結(jié)合位點進行定點突變。將突變后的POLH啟動子熒光素酶報告基因載體（pGL3-POLH-mut1和pGL3-POLH-mut2）分別與pcDNA3.1-IRF1共轉(zhuǎn)染至人胚腎293T細(xì)胞中。同時設(shè)置野生型POLH啟動子載體（pGL3-POLH-2000）與pcDNA3.1-IRF1共轉(zhuǎn)染組作為對照。轉(zhuǎn)染48h后檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示，當(dāng)-898位或-590位IRF1結(jié)合位點突變后，過表達IRF1不能引起POLH啟動子活性的增加，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值與對照組相比無顯著差異，這說明IRF1通過與-898位和-590位結(jié)合，參與調(diào)控POLH基因的轉(zhuǎn)錄，這兩個位點對于IRF1介導(dǎo)的POLH轉(zhuǎn)錄激活至關(guān)重要。通過上述實驗，明確了IRF1在POLH轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵的正向調(diào)控作用，通過與POLH啟動子區(qū)-898位和-590位結(jié)合，增強POLH基因啟動子活性，從而促進POLH基因的轉(zhuǎn)錄，為深入理解POLH基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制以及細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷的應(yīng)答機制提供了重要依據(jù)。4.2.3MNNG誘導(dǎo)POLH轉(zhuǎn)錄上調(diào)的機制探討為深入揭示MNNG誘導(dǎo)POLH轉(zhuǎn)錄上調(diào)的分子機制，本研究圍繞IRF1與POLH啟動子的結(jié)合以及相關(guān)信號通路展開了系統(tǒng)而深入的探究。運用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，驗證IRF1與POLH啟動子的結(jié)合情況。將人胚腎293T細(xì)胞分為MNNG處理組和對照組，MNNG處理組用10μMMNNG處理24h，對照組不