、任務(wù)來源依據(jù)《江西省市場監(jiān)管局關(guān)于下達2024年第四批江西省地方標準制修訂計劃的通知》，《淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)規(guī)范大型底棲生物》（DB36-2024-4-03）的編制任務(wù)已于2024年6月11日正式下達。江西省生態(tài)環(huán)境科學研究與規(guī)劃院作為承擔單位，中國科學院水生生物研究所作為協(xié)作單位共同開展《淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)規(guī)范大型底棲生物》制定工作。2、標準制定的意義和必要性分析2.1標準制定的目的和意義生物多樣性的保護和水生態(tài)系統(tǒng)的健康是全球關(guān)注的焦點問題。盡管淡水生態(tài)系統(tǒng)僅占地球表面積不到1%，它卻孕育了超過10%的人類已知生物種類，地球上約40%的魚類和超過30%的脊椎動物棲息在這些水域中。然而，淡水生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性下降速度比山林、陸地、海洋等其他生態(tài)系統(tǒng)更為嚴重，成為地球上退化最嚴重的生態(tài)系統(tǒng)之一。因此，對淡水生態(tài)系統(tǒng)的管理與保護，直接關(guān)系到生物多樣性的保持和物種滅絕風險的降低，對生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要，也更符合生態(tài)文明建設(shè)的發(fā)展理念。大型底棲生物廣泛分布于水體底部，與周圍環(huán)境緊密相連，在生態(tài)系統(tǒng)的多個關(guān)鍵過程中發(fā)揮著不可替代的作用。例如，雙殼貝類通過濾食習性攝取浮游植物和有機碎屑中的氮、磷等營養(yǎng)元素，它們死亡后，這些營養(yǎng)物質(zhì)重新進入底棲環(huán)境，促進了水體與底質(zhì)之間的物質(zhì)循環(huán)。沉積食性的多毛類蠕蟲通過分解底質(zhì)有機碎屑，將復雜有機物轉(zhuǎn)化為簡單無機物，為物質(zhì)循環(huán)提供持續(xù)動力。在食物鏈中，初級消費者螺類以藻類為食，次級消費者蟹類捕食小型底棲動物，從而將能量從低營養(yǎng)級傳遞至更高層級。大型底棲生物在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量傳遞、環(huán)境改善及生物多樣性維護等方面發(fā)揮著核心作用。然而，傳統(tǒng)的基于形態(tài)學的大型底棲生物多樣性監(jiān)測方法存在采樣難度大、物種鑒定困難、分析周期長、監(jiān)測人員專業(yè)要求高、抽樣誤差大等問題。特別是底棲無脊椎動物物種繁多、形態(tài)多樣，使得鑒定分析過程對工作人員的分類學專業(yè)基礎(chǔ)及經(jīng)驗要求較高。同時，由于部分分類群的分類檢索系統(tǒng)尚不完善，也給物種分類鑒定工作帶來了一定的困難。相比之下，環(huán)境DNA監(jiān)測方法僅需采集水樣、沉積物、生物膜或生物組織樣品，設(shè)計通用引物擴增特定基因片段，并通過高通量測序獲得DNA條形碼序列，通過數(shù)據(jù)庫比對可以精準地鑒別出物種種類和群落結(jié)構(gòu)信息。這種方法相比傳統(tǒng)形態(tài)學方法，具有經(jīng)濟高效、流程標準化和精確性高等優(yōu)勢。因此，本標準發(fā)布之后能夠指導環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域底棲動物應(yīng)用環(huán)境DNA技術(shù)開展鑒定工作，使應(yīng)用該方法的實驗室能夠規(guī)范、統(tǒng)一、可控、可查，并在實際工作中逐步完善江西省重點流域底棲動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。2.2必要性分析目前全球物種總量至少有上千萬種，物種的命名分類鑒定工作量非常艱巨。隨著20世紀90年代開始的測序技術(shù)的日趨成熟，分子鑒定技術(shù)被廣泛推廣和使用，2003年，加拿大科學家Hebert研究通過COI序列，即DNA條形碼技術(shù)，可以對物種進行鑒別。DNA條形碼技術(shù)廣泛應(yīng)用在動物、植物和生物鑒別上。DNA條形碼技術(shù)自應(yīng)用以來，在鳥類、魚類、兩棲類、浮游和海洋小型底棲動物等動物物種鑒定方面取得了良好效果。因其具備靈敏度高、經(jīng)濟高效、省時省力、對生態(tài)系統(tǒng)干擾低等優(yōu)點被逐漸應(yīng)用到水生生物鑒定和多樣性評估方面，基于DNA識別技術(shù)監(jiān)測水生生物的標準體系也逐漸構(gòu)建，如北京市《魚類貝類環(huán)境DNA識別技術(shù)規(guī)范》，遼寧省《水質(zhì)DNA條形碼鑒定-底棲動物》和團體標準《水生生物DNA條形碼構(gòu)建規(guī)程》等，這些標準的制定對構(gòu)建基于環(huán)境DNA識別技術(shù)的水生生物監(jiān)測技術(shù)體系提供了參考依據(jù)。2019年9月18日，習近平總書記在黃河流域生態(tài)保護和高質(zhì)量發(fā)展座談會上提出要促進河流生態(tài)系統(tǒng)健康，提高生物多樣性。與此同時，長江大保護戰(zhàn)略的提出，更是要求落實長江“十年禁漁”，改善水生生物多樣性。黃河和長江流域生態(tài)環(huán)境質(zhì)量受到中央如此重視也是前所未有、力度空前，顯示出了中央治理黃河和長江生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的決心和態(tài)度。標志著以整治污染、提高流域水生生物多樣性為目標的保護措施將會持續(xù)推行，并將以水生生物多樣性的增加作為衡量治理成效的重要指標之一。2022年，國家啟動對長江流域17個省（自治區(qū)、直轄市）開展水生態(tài)考核試點工作，明確2025年開展第一次考核。我省長江干流（江西段）、贛江、鄱陽湖等3個水體共計26個點位納入國家考核，并完成了2022年水生態(tài)綜合評價工作。時任副省長陳敏做出批示“要加強協(xié)同攻關(guān)，科學精準治理，第一次考核有更好的成績”。大型底棲生物作為水生態(tài)考核指標的一項關(guān)鍵類群，成為水生態(tài)監(jiān)測評估的新方向。然而，目前水生態(tài)監(jiān)測方法（尤其是針對大型底棲生物類群的監(jiān)測方法）對人員的分類學基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗要求較高，難以滿足當前和未來水生態(tài)考核的需求。因此，亟需引入高效、省時省力的新興監(jiān)測技術(shù)（如環(huán)境DNA技術(shù)）作為輔助手段，為水生生物監(jiān)測和水生態(tài)考核提供更加科學、可靠的技術(shù)支持。受水文條件、地形地貌、河湖分布、物種類型及棲息地環(huán)境等因素的影響，環(huán)境DNA技術(shù)在數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、采樣點布設(shè)、樣品保存等方面存在區(qū)域性差異。因此，制定符合我省省情的大型底棲生物環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測規(guī)范，能夠滿足當前和未來水生態(tài)考核的實際需求（特別是大型底棲生物的考核指標要求），這一標準的制定十分必要。3、標準框架的確定3.1標準制定的總體思路依據(jù)現(xiàn)行的法律法規(guī)和標準規(guī)范，遵循“標本兼治、安全可靠、經(jīng)濟適用”的原則，對江西省河流、湖庫大型底棲無脊椎動物的監(jiān)測技術(shù)進行了深入調(diào)研。在全面總結(jié)過往經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合江西省各地水生態(tài)監(jiān)測的實施現(xiàn)狀和未來需求，通過查閱資料、實地考察、專家咨詢等多種方式，合理構(gòu)建指南的框架結(jié)構(gòu)，并精確界定了監(jiān)測技術(shù)的適用范圍、方法以及評估體系，為我省水生態(tài)考核和修復工作提供堅實的技術(shù)支持。3.2編制依據(jù)本標準內(nèi)容引用了下列文件或其中的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T20001.4標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準GB/T29859生物信息學術(shù)語GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T34265Sanger法測序技術(shù)指南GB/T35537高通量基因測序結(jié)果評價要求GB/T37870個體鑒定的高通量測序方法GB/T37874核酸提取純化方法評價通則GB/T40226環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導HJ710.8生物多樣性觀測技術(shù)導則淡水底棲大型無脊椎動物HJ1295水生態(tài)監(jiān)測技術(shù)指南河流水生生物監(jiān)測與評價(試行)HJ1296水生態(tài)監(jiān)測技術(shù)指南湖泊和水庫水生生物監(jiān)測與評價(試行)3.3編制原則本標準的制定將嚴格遵循《江西省標準化條例》（江西省第十三屆人民代表大會常務(wù)委員會公告第64號）、《江西省地方標準管理辦法》（贛府發(fā)〔2023〕10號）以及《江西省生態(tài)環(huán)境廳標準制修訂工作規(guī)則（試行）》（贛環(huán)法規(guī)〔2022〕18號）等規(guī)定。在全面梳理、總結(jié)并吸收國內(nèi)外相關(guān)標準、規(guī)范方法和文獻研究的成果基礎(chǔ)上，充分考慮省內(nèi)生態(tài)環(huán)境管理的實際需求，結(jié)合監(jiān)測機構(gòu)的技術(shù)能力和人員狀況等因素，依據(jù)《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》（GB/T1.1-2020）、《環(huán)境保護標準編制出版技術(shù)指南》（HJ565-2010）、《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制修訂技術(shù)導則》（HJ168-2010）的相關(guān)技術(shù)要求，制定標準文本及其編制說明。旨在確保所制定的標準既科學又規(guī)范，同時具備良好的可操作性，以便在全省范圍內(nèi)廣泛推廣和應(yīng)用。3.4技術(shù)路線本標準擬從江西省內(nèi)水系特征的實際出發(fā)，以《河流水生態(tài)環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測與評價技術(shù)指南》、《湖庫水生態(tài)環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測與評價技術(shù)指南》等標準指南為基礎(chǔ)，考慮生態(tài)環(huán)境管理的需求和監(jiān)測業(yè)務(wù)的可操作性等因素，系統(tǒng)提升江西省大型底棲生物監(jiān)測技術(shù)的標準化和規(guī)范化水平，支撐江西省水生生物的科學監(jiān)測和依法監(jiān)測。編制組編制標準方法的技術(shù)路線分為：方案制定、實驗研究、征求意見、審查和發(fā)布等五個階段（圖1）。圖1標準編制技術(shù)路線圖4、標準編制過程4.1成立編制組江西省生態(tài)環(huán)境科學研究與規(guī)劃院于2024年6月組織相關(guān)科研人員成立了標準編制組。編制組成員由長期從事水生生物監(jiān)測、環(huán)境DNA水生生物監(jiān)測以及地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的研究技術(shù)人員組成。4.2現(xiàn)有研究基礎(chǔ)在生物多樣性保護和生態(tài)監(jiān)測領(lǐng)域，編制單位和合作機構(gòu)中國科學院水生生物研究所長期專注于大型底棲的監(jiān)測和DNA鑒定的科研工作，通過不懈的努力，積累了大量的底棲基礎(chǔ)數(shù)據(jù)、監(jiān)測經(jīng)驗和DNA監(jiān)測知識?；谶@些寶貴的數(shù)據(jù)和知識儲備，編制組確定了基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測大型底棲的工作方向，并針對這一領(lǐng)域內(nèi)的相關(guān)主題及關(guān)鍵參數(shù)進行了深入而廣泛的研究，確定了環(huán)境DNA監(jiān)測大型底棲生物的基本框架和流程，為標準的制定奠定了堅實的基礎(chǔ)。4.3理論研究過程標準編制組通過多種渠道廣泛收集并深入學習了《海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查》（GB/T12763.6）、《水質(zhì)采樣方案設(shè)計技術(shù)規(guī)定》（HJ495）、《生物多樣性觀測技術(shù)導則淡水底棲大型無脊椎動物》等傳統(tǒng)形態(tài)學監(jiān)測標準。同時，還進一步研究了《生物信息學術(shù)語》（GB/T29859）、《高通量基因測序結(jié)果評價要求》（GB/T35537）和《個體鑒定的高通量測序方法》（GB/T37870）等與高通量測序技術(shù)相關(guān)的標準。此外，還搜集和分析了大量國內(nèi)外關(guān)于環(huán)境DNA監(jiān)測生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的方法和實際案例。通過對這些資料的分析和共性總結(jié)，標準編制組初步梳理和提煉了基于環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測大型底棲的方案，明確了標準制定的方向和思路，從而形成了標準編制的大綱。4.4調(diào)查研究為了確保標準的科學性和可操作性，2024年標準編制組在基于現(xiàn)有的實驗研究和資料分析，選取了多個具有代表性的采樣點，涵蓋了不同的生態(tài)系統(tǒng)和環(huán)境梯度，以確保監(jiān)測結(jié)果的全面性和準確性。通過對采集的樣本進行DNA提取、擴增和測序，獲得了大量高質(zhì)量的環(huán)境DNA數(shù)據(jù)。在實驗過程中，編制組還遇到了一些技術(shù)挑戰(zhàn)，如樣本污染、DNA降解等問題。針對這些問題，編制組積極尋求解決方案，不斷優(yōu)化實驗流程，提高了數(shù)據(jù)的可靠性和準確性。同時，通過與相關(guān)高校專家的交流和合作，編制組也獲得了更多的技術(shù)支持和指導，為標準的制定提供了有力的保障。4.5編寫標準草稿和編制說明在2024年10月至12月期間，標準編制組組織了起草工作研討會，集中討論了標準起草過程中遇到的問題。進一步優(yōu)化了基于環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)監(jiān)測大型底棲的流程。同時，經(jīng)過多次內(nèi)部研討會和專家咨詢會的深入討論，最終形成了標準征求意見稿及其編制說明。2025年1月至3月，編制組向社會公開征求意見，在征求意見過程中，共收集意見67條，采納64條，部分采納2條，不采納1條。其中，對部分采納和不采納情況已與相關(guān)單位溝通，并達成一致意見。5、技術(shù)規(guī)范主要內(nèi)容的制定依據(jù)5.1標準框架結(jié)構(gòu)本標準結(jié)構(gòu)按照《標準化工作導則（GB/T1.1-2020）》的要求進行編排，本標準規(guī)定了利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測大型底棲生物等主要內(nèi)容，主要包括適用范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語與定義、試劑和器材、樣品采集、PCR擴增與測序、質(zhì)量控制與評價指標七個部分。（1）適用范圍：對指南的主體內(nèi)容與適用范圍進行說明。（2）規(guī)范性引用文件：對指南中引用的標準、規(guī)范等進行說明。（3）術(shù)語與定義：對指南中關(guān)鍵詞語的解釋。（4）試劑和器材：對樣品采集和檢測過程中對需使用的試劑和器材進行了說明。（5）樣品采集：對采樣點布設(shè)、采樣頻次、樣品采集等進行了說明。（6）PCR擴增與測序：對引物選擇、高通量測序等情況進行了說明。（7）質(zhì)量控制與評價指標：對監(jiān)測和檢測的質(zhì)量控制與評價進行了對比說明。5.2條文說明5.2.1范圍本文件規(guī)定了利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測大型底棲動物的點位布設(shè)、監(jiān)測頻次與時間、試劑和材料、儀器和設(shè)備、監(jiān)測內(nèi)容和方法以及質(zhì)量控制與評價指標。本文件適用于湖泊、水庫、溪流、河流、河口區(qū)等水域大型底棲動物的監(jiān)測。除執(zhí)行本標準外，尚應(yīng)符合國家、地方及行業(yè)現(xiàn)行的有關(guān)標準、規(guī)范的規(guī)定。5.2.2規(guī)范性引用文件本標準所引用的國家有關(guān)規(guī)范、規(guī)程、標準均為現(xiàn)行且有效的，條文中給出編號，以便于使用時查找。本標準內(nèi)容引用了下列文件或其中的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T20001.4標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準GB/T29859生物信息學術(shù)語GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T34265Sanger法測序技術(shù)指南GB/T35537高通量基因測序結(jié)果評價要求GB/T37870個體鑒定的高通量測序方法GB/T37874核酸提取純化方法評價通則GB/T40226環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導HJ710.8生物多樣性觀測技術(shù)導則淡水底棲大型無脊椎動物HJ1295水生態(tài)監(jiān)測技術(shù)指南河流水生生物監(jiān)測與評價(試行)HJ1296水生態(tài)監(jiān)測技術(shù)指南湖泊和水庫水生生物監(jiān)測與評價(試行)5.2.3術(shù)語與定義本標準涉及了18個術(shù)語和定義。具體說明如下：（1）引物：指在DNA復制過程中，結(jié)合于模板鏈上并作為復制延伸的起始位點和/或終止位點的，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。【條文說明】該定義參照江蘇省《淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)方法》（DB32/T4539—2023）中的解釋。（2）聚合酶鏈式反應(yīng)：指一種體外酶促合成特異DNA片段的分子技術(shù)，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便省時等特點?！緱l文說明】該定義參照江蘇省《淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)方法》（DB32/T4539—2023）中的解釋。（3）Sanger測序：指用于基因測序的雙脫氧末端終止法，在鏈延伸過程中利用熒光標記雙脫氧堿基隨機阻斷，產(chǎn)生以A/T/G/C結(jié)束的四組不同長度的核苷酸鏈，通過讀取熒光信號實現(xiàn)對核酸堿基序列信息的讀取?！緱l文說明】該定義參照江蘇省《淡水生物環(huán)境DNA監(jiān)測技術(shù)方法》（DB32/T4539—2023）中的解釋。（4）高通量測序：指區(qū)別于傳統(tǒng)Sanger（雙脫氧鏈末端終止法）測序，能夠同時對大量核酸分子進行并行測序的技術(shù)?！緱l文說明】該定義參照GB/T34265—2017，3.4中的解釋。（5）環(huán)境DNA：指通過從環(huán)境介質(zhì)（水、土壤、沉積物等）或混合生物組織中提取的DNA?！緱l文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（6）DNA條形碼：指細胞核或者細胞器中一段公認的能夠代表該物種的標準的、有足夠變異的、易擴增的短DNA序列，可用于物種的識別和鑒定?！緱l文說明】該定義參照LY/T3191—2020，3.6中的解釋，有修改。（7）線粒體細胞色素c氧化酶I：指后生動物線粒體基因組上的線粒體細胞色素c氧化酶I對應(yīng)的DNA序列?！緱l文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（8）DNA宏條形碼技術(shù)：指利用高通量測序獲取環(huán)境介質(zhì)（如水、沉積物、土壤、空氣等）或混合生物組織中的特定DNA片段，根據(jù)物種間特定DNA序列差異識別物種，獲取物種組成和群落結(jié)構(gòu)?！緱l文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（9）索引：指通過PCR或文庫準備過程中為每個樣品添加一個短序列的核苷酸堿基對，允許多個樣品在一個高通量測序運行中被匯集。這個序列對于同一個運行中的每個樣本都是不同的，并使序列能夠在測序后分配回它們來自的樣本。【條文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（10）序列相似性：指不同序列之間相同DNA堿基或氨基酸殘基序列所占的比例。在環(huán)境DNA宏條形碼分析中，通?；谛蛄邢嗨菩詫y序數(shù)據(jù)進行物種注釋。【條文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（11）序列相似性閾值：指判定兩條核酸序列的相似程度，特定閾值以上堿基相同的序列，可以認定為同一物種?！緱l文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（12）擴增序列變體：指DNA宏條形碼技術(shù)中，通過生物信息學剔除PCR擴增和測序產(chǎn)生的錯誤序列后形成的獨特DNA序列，即每條序列至少有一個堿基不相同，可以根據(jù)ASV的序列差異進行物種鑒定。【條文說明】瑞士環(huán)境聯(lián)邦蜀發(fā)布的指南《EnvironmentalDNAapplicationsinbiomonitoringandbioassessmentofaquaticecosystems》中定義ASV為去除PCR擴增測序過程中產(chǎn)生的假序列后，高通量擴增測序產(chǎn)生的獨特DNA序列。（13）操作分類單元：指DNA宏條形碼測序數(shù)據(jù)按照一定的序列相似性閾值進行聚類，獲得的用于表征物種的分子水平的分類單元?！緱l文說明】瑞士環(huán)境聯(lián)邦蜀發(fā)布的指南《EnvironmentalDNAapplicationsinbiomonitoringandbioassessmentofaquaticecosystems》中定義OTU為按照相似性聚類獲得的一組序列，用于代表分子水平的分類單元。歐洲科技合作機構(gòu)發(fā)布的指南《ApracticalguidetoDNA-basedmethodsforbiodiversityassessment》中定義OTU為將DNA宏條形碼數(shù)據(jù)按照一定的序列相似性閾值進行聚類獲得的用于代表物種的分子水平的分類單元。（14）嵌合體：指在PCR擴增的延伸步驟中由兩種或更多種序列組合生成的錯誤序列?！緱l文說明】瑞士環(huán)境聯(lián)邦蜀發(fā)布的指南《EnvironmentalDNAapplicationsinbiomonitoringandbioassessmentofaquaticecosystems》中定義嵌合體為在PCR擴增過程中結(jié)合不同來源的DNA片段形成的人工序列。（15）檢出率：指特定物種檢出的樣品數(shù)除以總樣品數(shù)。【條文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（16）相對豐度：指樣品中分配到某一分類單元的序列數(shù)占該樣品序列總數(shù)的比例?！緱l文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（17）陰性質(zhì)控樣本：指確定不含特定物種或者所有物種的樣本（例如無菌水），與待測樣本同步實驗，用于判斷待測樣本是否被污染。【條文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。（18）陽性質(zhì)控樣本：指確定已知物種組成的樣本，與待測樣本同步實驗，用于判斷測序結(jié)果是否可靠。【條文說明】該定義參照團體標準《水生生物監(jiān)測環(huán)境DNA宏條形法》（T/CSES81—2023）中的解釋。5.2.4試劑和器材5.2.4.1試劑和材料PCR擴增試劑。PCR擴增引物。PCR產(chǎn)物純化試劑盒。DNA濃度測定試劑。凝膠電泳相關(guān)試劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，C12H25SO4Na），1%瓊脂糖凝膠：稱取0.3g瓊脂糖，加入30mL去離子水，微波爐加熱至恰好全部熔化，立即倒入七孔制膠槽中，插入制膠梳，冷卻凝固拔出制膠梳后檢查上樣孔是否完整無損，臨用現(xiàn)制。也可使用其他孔數(shù)制膠槽的電泳儀，并適當調(diào)整瓊脂糖凝膠的制備量。高通量測序：根據(jù)測序平臺選取相關(guān)試劑和材料。超純水或去離子水121℃滅菌。通用無菌手套。離心管：無DNA和生物殘留。DNA提取試劑或試劑盒。無水乙醇：分析純。5.2.4.2儀器和設(shè)備樣品采集及前處理設(shè)備要求如下：大型底棲生物采集工具：采泥器、D形網(wǎng)、索伯網(wǎng)等。水樣抽濾設(shè)備。沉積物采樣設(shè)備：抓斗、采泥器等。實驗室分析儀器和設(shè)備要求如下：低溫離心機：離心轉(zhuǎn)速可達13000r/min，溫控范圍低至4℃。微量移液器：0.5-10μL、20-200μL和100-1000μL等。PCR儀：溫控范圍0-100℃，升溫速度6℃/s，配套PCR管200μL。核酸電泳儀：水平式。凝膠成像分析儀。天平：精準到0.001g。高壓蒸汽滅菌儀：可達到標準要求的121℃、18min滅菌條件。冰箱：溫度調(diào)節(jié)范圍為-20℃-4℃。冷凍干燥儀。微量紫外分光光度計?！緱l文說明】所使用的試劑均應(yīng)符合國家標準的分析純試劑，實驗用水滿足國家相關(guān)標準的要求。5.2.5樣品采集5.2.5.1采樣點設(shè)置采樣點的布設(shè)原則：參照HJ1295和HJ1296中相關(guān)要求執(zhí)行。布設(shè)方法：1）湖泊型水體：根據(jù)區(qū)域內(nèi)湖庫形態(tài)、水文狀況、水生生物分布等因素的差異，將湖泊分為不同的小區(qū)域，如湖庫濱岸帶、沿岸帶、湖心區(qū)、主要河流出入口等，湖心區(qū)應(yīng)每2km2設(shè)置不少于1個采樣點，其他小區(qū)域設(shè)置不少于1個采樣點。監(jiān)測點的數(shù)量可參考HJ1296執(zhí)行。2）水庫型水體：將水庫分為入庫口、出庫口河口、深水區(qū)等區(qū)域，各個區(qū)域應(yīng)設(shè)置不少于1個采樣點，庫區(qū)每15~20km2設(shè)置不少于1個采樣點，監(jiān)測點的數(shù)量可參考HJ1296執(zhí)行。3）河流型水體：將河流劃分成河口區(qū)、下游河段、中游河段、上游河段，以及支流和干流的匯口區(qū)等區(qū)域，每個區(qū)域設(shè)置不少于1個采樣點。當河流寬度（K）<50m時，在河流中部或靠岸一側(cè)設(shè)置1個采樣點；當50m≤河面寬度<200m以上，在河流兩側(cè)分別布設(shè)1個采樣點，等比采集混合水樣；當河面寬度≥200m時，在河流中部和左右兩側(cè)分別設(shè)置1個采樣點，等比采集混合水樣。具體參照HJ1295和HJ710.8中相關(guān)要求執(zhí)行。參照點位及參照狀態(tài)：參照HJ1295中相關(guān)要求執(zhí)行。【條文說明】采樣點的設(shè)置主要參考HJ1295、HJ1296和HJ710.8中相關(guān)要求進行規(guī)定。5.2.5.2采樣頻次與時間根據(jù)監(jiān)測目的和監(jiān)測條件，結(jié)合河流和湖庫水文、季節(jié)、大型底棲生物群落的變化，在保證可獲取具有時間代表性環(huán)境DNA樣品的前提下，確定最低的監(jiān)測頻次和監(jiān)測時間。根據(jù)實際調(diào)查任務(wù)需要，可按水期（豐水期、平水期、枯水期）、季度（每三月一次）或月度（每月一次）選擇監(jiān)測頻次和監(jiān)測時間。針對重點關(guān)注區(qū)域和突發(fā)環(huán)境問題，可每日/周監(jiān)測開展階段性監(jiān)測?！緱l文說明】采樣頻次和時間需要根據(jù)實際的調(diào)查任務(wù)進行確定，可按水期（以星子站作為鄱陽湖代表性測站，當星子站水位大于17.00m時為豐水期，13.01～16.00m為平水期，小于12.00m（含12.00m）為枯水期，16.01～17.00m為平-豐過渡期，12.01～13.00m為枯-平過渡期）、季度（每三月一次）或月度（每月一次）選擇監(jiān)測頻次和監(jiān)測時間。針對重點關(guān)注區(qū)域和突發(fā)環(huán)境問題，可每日/周監(jiān)測開展階段性監(jiān)測。5.2.5.3樣品采集環(huán)境DNA樣品采樣取決于生態(tài)系統(tǒng)類型和靶向監(jiān)測類群。不同的棲息地和生物群需采集不同來源的環(huán)境DNA樣品，目前主要從以下3種環(huán)境樣本中分離DNA用于大型底棲生物的監(jiān)測，可根據(jù)實際情況選擇環(huán)境樣本。水樣大型底棲eDNA樣品在距離岸邊0.5m處采集。當水深（h）＜0.5m時，在1/2水深處采樣；當水深（h）>0.5m時，在水底上0.5m處采樣。采樣人佩戴一次性乳膠手套，將1L的滅菌采樣瓶瓶口向上游來水方向，采集1L水樣（可視水樣干凈程度增加或減少采樣量）。采樣瓶裝滿后應(yīng)密封并做標記。為了保證eDNA數(shù)據(jù)的可靠性，每個采樣位點至少有5個重復。水體推薦現(xiàn)場完成eDNA的過濾富集，濾膜低溫（≤4℃）冷藏運輸，當天返回實驗室后-20℃～-80℃保存。未現(xiàn)場過濾的，水體應(yīng)低溫（4℃）冷藏運輸，并在6h內(nèi)返回實驗室，24h內(nèi)完成過濾，濾膜-20℃～-80℃保存。當水環(huán)境澄清、透明度較高時，宜適當增加濾膜過濾水量，每張濾膜最多抽濾2L水；當水體藻類明顯較多時（如藻華爆發(fā)期），濾膜容易堵孔，宜酌情減少濾膜過濾水量同時增加樣點的濾膜數(shù)量，每張濾膜抽濾體積可減少至250mL，每個樣點濾膜數(shù)量應(yīng)增加至15~20張；當水體泥沙/顆粒物較多時，宜靜置后過濾，過濾條件參考藻華爆發(fā)期的過濾方法。沉積物樣品按照HJ494的規(guī)定采集100g的表層沉積物樣品，收集在無菌清晰的塑封袋或采樣瓶中，做好標記，置于車載冰箱4℃冷藏運輸。每個采樣位點至少有5個重復且盡量包含各類小生境。混合生物組織樣品按照HJ710.8的相關(guān)規(guī)定采集和篩選大型底棲無脊椎動物，加入3倍體積的無水乙醇，常溫保存。【條文說明】采樣方法主要參考HJ454、HJ710.8等相關(guān)規(guī)定。一般來說，采樣體積越大，監(jiān)測的物種種類更全。但是采樣和前處理的難度更大，同時也會存在更多的雜質(zhì)和抑制劑，增加DNA提取和PCR擴增實驗的難度。因此采樣體積的選擇需要根據(jù)水體類型和監(jiān)測的生物類群綜合考慮。已有的關(guān)于水樣eDNA監(jiān)測底棲動物的采樣體積也大多在1L左右，美國地調(diào)局發(fā)布的《EnvironmentalDNASamplingProtocol—FilteringWatertoCaptureDNAfromAquaticOrganisms》中提到采用0.45μm的濾膜過濾水樣體積250~1000mL。對于雜質(zhì)和有機質(zhì)較高的溪流或池塘過濾水樣體積為500mL甚至更少。當需要時，可以選擇孔徑更大的濾膜（0.45~3μm）的濾膜過濾，防止堵塞，進而增加過濾體積。另外，為了保證eDNA數(shù)據(jù)的可靠性，通常采用多個平行樣本。例如，當一個物種在多個重復中被檢測到時，它更有可能是真實存在于環(huán)境中的，而不是假陽性。因此，為了在統(tǒng)計上有效，每個位點的eDNA采樣應(yīng)包括多個生物重復。為盡可能覆蓋所有的物種，本研究建議采樣體積一般不小于1L。另外每個點位至少設(shè)置5個生物重復。5.2.5.4環(huán)境DNA提取和純化樣品前處理和DNA提取1）濾膜樣品（水樣）：利用研磨珠和裂解液將濾膜振蕩破碎，將破碎后的樣品置于1.5mL離心管中，采用符合動物組織細胞DNA提取的商業(yè)化試劑盒完成，具體操作可參考試劑盒要求。2）沉積物樣品：經(jīng)均質(zhì)器均質(zhì)后冷凍干燥，用網(wǎng)篩過濾雜質(zhì)并混合均勻。取0.25g底泥樣品置于1.5mL離心管中，采用符合動物組織細胞DNA提取的商業(yè)化試劑盒完成，具體操作可參考試劑盒要求。3）混合生物組織樣品：室溫靜置5天，多次振蕩混勻，吸取浸出液2mL，真空離心濃縮。取真空離心濃縮樣品，采用符合動物組織細胞DNA提取的商業(yè)化試劑盒完成，具體操作可參考試劑盒要求。4）環(huán)境DNA提取也可參照GB/T40226中的操作步驟，采用離心柱法和磁珠法等常規(guī)分子生物學造作提取DNA。5）eDNA純化采用符合要求的柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒完成，具體操作可參考試劑盒要求?！緱l文說明】Piggott等采用eDNA監(jiān)測瀕危魚類澳洲麥氏鱸(Macquariaaustralasica)研究發(fā)現(xiàn)：基于商業(yè)試劑盒QIAGENDNasy試劑盒比傳統(tǒng)酚氯仿的效果更高。《高通量基因測序樣本預處理方法第1部分：動物組織樣本預處理》（GB/T33681.1）中對于核酸提取的定義，核酸提取是用物理、化學或生物酶的方法，釋放生物組織樣本中的核酸并對它進行純化，充分去除生物組織樣本中的蛋白質(zhì)、脂類等PCR抑制劑以及提取核酸時加入的試劑，保證核酸的質(zhì)量和濃度的穩(wěn)定，能滿足實驗要求。因此，本研究對兩種情況均進行了規(guī)定。DNA質(zhì)量與保存1）采用微量紫外分光光度計檢測總DNA濃度和質(zhì)量，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完整性。樣本DNA濃度應(yīng)不低于1ng/μL，最佳濃度范圍為10~100ng/μL。OD260nm/OD280nm比值介于1.8~2.0之間，OD260nm/OD230nm應(yīng)大于2.0。DNA在-20℃及以下保存，避免反復凍融。2）DNA完整性要求：有單一且清晰明亮的主帶，無大量彌散狀降解?！緱l文說明】按GB/T37874《核酸提取純化方法評價通則》的規(guī)定，集中常見的生物樣本合格的DNA不低于1μg，在260nm和280nm波長處的吸光度值比值（OD260nm/OD280nm）應(yīng)在1.7~1.9范圍內(nèi)。若OD260nm/OD280nm值低于1.7，說明提取的DNA中有蛋白質(zhì)、多酚等雜質(zhì)污染；若OD260nm/OD280nm值高于1.9，說明提取的DNA可能有RNA污染。但是由于環(huán)境DNA不同于純物種組織的DNA，存在更多來源的污染（如腐殖質(zhì)等），吸光度比值可適當放寬。eDNA提取一般最終的洗脫體積為100μL，按照GB/T37874要求，DNA濃度應(yīng)不低于10ng/μL。但是由于環(huán)境DNA的來源樣本中DNA含量偏低且含有大量的腐殖質(zhì)等抑制物，因此濃度建議不低于1ng/μL，純度OD260nm/OD280nm在1.8~2.0范圍即可。5.2.6PCR擴增與測序引物選擇1）針對不同生物類群選擇不同的一對或者多對特異性引物擴增目標條形碼序列，大型底棲通用擴增引物選取可參照表1.表1常用DNA條形碼擴增引物信息基因名稱引物名稱引物序列（5’-3’）退火溫度COI-1mlCOIintFGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC45-55℃dgHCO2198TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCACOI-2mlCOIintFGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC45-55℃jgHCO2198TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA2）宏條形碼產(chǎn)物用1~2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，應(yīng)呈現(xiàn)單一清晰明亮、無拖尾的條帶。若樣品出現(xiàn)多個條帶，需純化PCR產(chǎn)物，純化過程參考SY/T4278。PCR通過1%~2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷PCR反應(yīng)是否存在非特異性擴增，及擴增過程中產(chǎn)生的引物二聚體信息。電泳后，PCR產(chǎn)物應(yīng)在相應(yīng)的DNA條形碼序列長度位置出現(xiàn)一條單一的目的條帶，陰性對照無條帶。3）條形碼擴增產(chǎn)物在-20℃以下溫度條件下保存，保存時間不超過一年?！緱l文說明】選擇底棲動物通用擴增引物對eDNA進擴增。用于大型無脊椎底棲動物鑒定的DNA條形碼大多為線粒體COI區(qū)域，但是不同研究選用的COI片段和引物序列略有差異。最為常用的長DNA條形碼碼片段為LCO1490/HCO2198，短的DNA條形碼為mlCOIintF/jgHCO2198。行業(yè)標準《國境口岸醫(yī)學媒介昆蟲DNA條形碼鑒定操作規(guī)程》（SN/T4278）中規(guī)定條形碼片段檢測主要包括制膠，點樣和電泳檢測等過程。若樣品出現(xiàn)多個條帶，需純化PCR產(chǎn)物，也可參考SN/T4278中7.5，即選用膠孔大的梳子，重新制膠、點樣、電泳，將所需的目的條帶進行切膠回收純化，需要時也可委托測序公司進行純化。條形碼擴增產(chǎn)物在-20℃以下溫度條件下保存，保存時間不超過一年。高通量測序1）參照GB/T30989和GB/T35537相關(guān)規(guī)定對宏條形碼擴增產(chǎn)物進行測序。2）建議每個樣本的預期有效序列數(shù)不低于10000條?！緱l文說明】測序深度會直接影響每個樣本中獲得的分子分類單元數(shù)和物種數(shù)目。增加測序深度將有助于識別更多的稀有物種，尤其對于生物多樣性較為豐富的樣本，但是也增加了經(jīng)濟成本。通過查閱相關(guān)文獻，本標準規(guī)定每個樣本的預期有效序列數(shù)不低于10000條（即生物信息學中所述“10000×”）。生物信息學分析同一批試驗數(shù)據(jù)，生物信息學分析流程及關(guān)鍵參數(shù)應(yīng)保持一致?？赏ㄟ^搜索特定序列（去除測序接頭adaptor、樣品索引index和引物），并基于堿基識別質(zhì)量（>Q20，參考）和序列長度（>預期長度的70%，參考）進行序列修剪。根據(jù)每個樣品的Index將序列分配到不同的樣品中。序列聚類及質(zhì)量控制①可選用OTU或ASV方法進行序列聚類和質(zhì)量控制，獲得分子分類單元，并過濾掉PCR擴增過程中產(chǎn)生的嵌合體序列。②OTU方法：將相似性高于或等于閾值（相似性閾值一般為0.97）的序列合并成OTUs，將序列比對到每個OTU的代表性序列，獲得每個OTU在每個樣品中出現(xiàn)的序列數(shù)。③ASV方法：每個獨特的序列即為一個ASV，根據(jù)生物信息學方法過濾潛在的PCR和測序錯誤的ASV序列，將序列比對到每個ASV，獲得每個ASV在每個樣品中出現(xiàn)的序列數(shù)。過濾低豐度的分子分類單元：過濾低豐度（如序列數(shù)為1~5）的分子分類單元（可能為假陽性、污染序列或未去除的嵌合體），也可根據(jù)實際監(jiān)測需求調(diào)整過濾的豐度閾值。序列注釋：將分子分類單元的序列與條形碼數(shù)據(jù)庫比對分析，獲得物種注釋信息。物種注釋方法和物種鑒定閾值（主要是序列相似性）的選擇，應(yīng)綜合考慮選用的條形碼片段、參考數(shù)據(jù)庫的完整性及數(shù)