手足口病預防控制指南（2009版）

手足口?。℉and-foot-mouthDisease,HFMD）是由多種人腸道病

毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國法定報告管理的丙類傳染病。

大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為

主要癥狀。少數(shù)患者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、

神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等，個別重癥患兒病情進展快，可導致死亡。

手足口病常出現(xiàn)暴發(fā)或流行，為指導各地做好手足口病的預防控制工

作，制定本指南。

一、目的

（-）指導醫(yī)療機構、疾病預防控制機構開展疫情報告與監(jiān)測。

（-）指導疾病預防控制機構開展流行病學調查、病原學監(jiān)測。

（三）指導疾病預防控制機構、醫(yī)療機構開展重點場所及公眾預防

控制工作。

二、疾病概述

（一）病原學。

引起手足口病的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇

病毒A組（CoxasckievirusA,CVA）的2、4、5、7、9、10、16型

等，B組（CoxasckievirusB,CVB）的1、2、3、4、5型等；腸道病

毒71型（HumanEnterovirus71,EV71）；埃可病毒（Echovirus,ECHO）

等。其中以EV71及CVA16型較為常見。

腸道病毒適合在濕、熱的環(huán)境下生存與傳播，75%酒精和5%來蘇

不能將其滅活，對乙酸、去氯膽酸鹽等不敏感；對紫外線和干燥敏感,

各種氧化劑（高鎰酸鉀、漂白粉等）、甲醛、碘酒以及56c30分鐘可以

滅活病毒。病毒在4℃可存活1年，-20℃可長期保存，在外環(huán)境中可

長期存活。

（二）流行病學。

1.傳染源。人是人腸道病毒的唯一宿主，患者和隱性感染者均為

本病的傳染源，隱性感染者難以鑒別和發(fā)現(xiàn)。發(fā)病前數(shù)天，感染者咽

部與糞便就可檢出病毒，通常以發(fā)病后一周內(nèi)傳染性最強。

2.傳播途徑。腸道病毒可經(jīng)胃腸道（糞-口途徑）傳播，也可經(jīng)

呼吸道（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、

皮膚或粘膜皰疹液及被污染的手及物品等造成傳播。尚不能明確是否

可經(jīng)水或食物傳播。

3.易感性。人對人腸道病毒普遍易感。不同年齡組均可感染發(fā)病,

以5歲及以下兒童為主，尤以3歲及以下兒童發(fā)病率最高。顯性感染

和隱性感染后均可獲得特異性免疫力，產(chǎn)生的中和抗體可在體內(nèi)存留

較長時間，對同血清型病毒產(chǎn)生比較牢固的免疫力，但不同血清型間

鮮有交叉免疫。

4.流行特征。該病流行無明顯的地區(qū)性，全年均可發(fā)生，一般5-7

月為發(fā)病高峰。托幼機構等易感人群集中單位可發(fā)生暴發(fā)。腸道病毒

傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快，控制難度

大，容易出現(xiàn)暴發(fā)和短時間內(nèi)較大范圍流行。

（三）臨床表現(xiàn)。

手足口病潛伏期為2T0天，平均3-5天，病程一般為7-10天。

急性起病，發(fā)熱，口腔粘膜出現(xiàn)散在皰疹，手、足和臀部出現(xiàn)斑

丘疹、皰疹，皰疹周圍可有炎性紅暈，皰內(nèi)液體較少?？砂橛锌人?、

流涕、食欲不振等癥狀。部分患者無發(fā)熱，僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹。一

般預后良好；少數(shù)病例，特別是EV71感染患兒，可出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、

腦脊髓炎、神經(jīng)源性肺水腫、循環(huán)障礙等，病情兇險，可致死亡或留

有后遺癥。

（四）治療原則。

目前無特異性治療方法，以支持療法為主，絕大多數(shù)患者可自愈。

目前尚無特異性的疫苗。病例的治療方法參考衛(wèi)生部《手足口病診療

指南（2008年版）九

三、病例定義

（一）臨床診斷病例。

在流行季節(jié)發(fā)病，常見于學齡前兒童，嬰幼兒多見。

1.普通病例：發(fā)熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無發(fā)熱。

2.重癥病例：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累、呼吸及循環(huán)功能障礙等表現(xiàn)，

實驗室檢查可有外周血白細胞增高、腦脊液異常、血糖增高，腦電圖、

腦脊髓磁共振、胸部X線、超聲心動圖檢查可有異常。

極少數(shù)重癥病例皮疹不典型，臨床診斷困難，需結合實驗室檢測

做出診斷。

若無皮疹，臨床不宜診斷為手足口病。

（-）實驗室確診病例。

臨床診斷病例符合下列條件之一者，即可診斷為實驗室確診病例：

1.自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子、腦脊液、皰疹液、血清

以及腦、肺、脾、淋巴結等組織標本中分離到人腸道病毒（指包括CVA16

和EV71等有明確證據(jù)表明可以導致手足口病的人腸道病毒）。

2.自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標本中檢測到CVA16或

EV71特異性核酸，或從腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴

結等組織標本等標本中檢測到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有

明確證據(jù)表明可以導致手足口病的人腸道病毒）的特異性核酸。

3.血清標本人腸道病毒型特異性中和抗體滴度21：256,或急性

期與恢復期血清腸道病毒特異性中和抗體有4倍或4倍以上的升高。

（三）聚集性病例。

1周內(nèi)，同一托幼機構或學校等集體單位發(fā)生5例及以上手足口病

病例；或同一班級（或宿舍）發(fā)生2例及以上手足口病病例；或同一

自然村發(fā)生3例及以上手足口病病例；或同一家庭發(fā)生2例及以上手

足口病病例。

四、疾病監(jiān)測

（一）疫情報告。

1.個案報告。各級各類醫(yī)療機構應按照《中華人民共和國傳染病

防治法》和《傳染病信息報告管理規(guī)范》的有關規(guī)定，對符合病例定

義的手足口病病例進行報告。

如為重癥病例，請在“重癥患者”處選擇“是"；如為實驗室診斷

病例，請在“實驗室結果”處選擇相應的腸道病毒病原學分型信息。

實行網(wǎng)絡直報的醫(yī)療機構應于24小時內(nèi)進行網(wǎng)絡直報，未實行網(wǎng)

絡直報的醫(yī)療機構應于24小時之內(nèi)寄送出傳染病報告卡。

2.聚集性病例報告。托幼機構和學校、醫(yī)療機構發(fā)現(xiàn)手足口病聚

集性病例時，應以最快的方式向縣（區(qū)）級疾病預防控制機構報告。

3.突發(fā)公共衛(wèi)生事件報告。局部地區(qū)或集體單位發(fā)生流行或暴發(fā)

時，按照《突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急條例》、《全國突發(fā)公共衛(wèi)生事件應

急預案》、《突發(fā)公共衛(wèi)生事件與傳染病疫情監(jiān)測信息報告管理辦法》

及有關規(guī)定，及時進行突發(fā)公共衛(wèi)生事件信息報告。

（二）病原學監(jiān)測。

各省區(qū)市衛(wèi)生行政部門要組織醫(yī)療衛(wèi)生機構開展病原學監(jiān)測，了

解病原動態(tài)分布變化。所有重癥和死亡病例均需采樣。此外，以縣（區(qū)）

為單位，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標本；當月縣（區(qū)）

病例總數(shù)少于5例時，全部采樣。

以省（區(qū)、市）為單位，在手足口病流行年份中每年至少采集20

對EV71和10對CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清，以闡明和分

析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動態(tài)變化，評價血清學抗體

試劑盒的敏感性和特異性。

以省（區(qū)、市）為單位，每月至少從手足口病病例中分離10株毒

株并做血清型別鑒定，鑒定完成后并將毒株及鑒定結果于5個工作日

內(nèi)報送至中國疾病預防控制中心。具備測序條件的省份，可開展VP1

基因序列測定和分析，進行基因定型，序列測定完成后將序列結果于5

個工作日內(nèi)報送至中國疾病預防控制中心；不具備測序條件者，將毒

株送至中國疾病預防控制中心進行序列測定，中國疾病預防控制中心

要于28個工作日內(nèi)反饋基因定型結果。

所有病例的采樣均由醫(yī)療機構完成，及時送至縣（區(qū)）級疾病預

防控制機構或指定的檢測機構檢測。檢測機構將實驗室檢測結果于24

小時內(nèi)反饋給縣（區(qū)）級疾病預防控制機構；縣（區(qū)）級疾病預防控

制機構接到結果后，于24小時內(nèi)對檢測病例的傳染病報告卡信息進行

訂正，將其病例類型訂正為“實驗室診斷”，并在“實驗室結果”處補

填腸道病毒病原學分型信息。

各種標本采集和檢測方法詳見《手足口病標本采集及檢測技術方

案》（附件1）。

（三）監(jiān)測信息分析與反饋。

各級疾病預防控制機構要每日對網(wǎng)絡直報系統(tǒng)進行瀏覽，及時對

報告的病例進行審核、查重、訂正等工作，定期對監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析,

判斷發(fā)病趨勢，發(fā)現(xiàn)異常升高或病例呈聚集性分布或出現(xiàn)重癥及死亡

病例時，要及時核實并向同級衛(wèi)生行政部門及上級疾病預防控制機構

報告，并定期向下級疾病預防控制機構和醫(yī)療機構反饋疫情分析信息o

五、預防控制

（-）現(xiàn)場調查處置。

發(fā)現(xiàn)手足口病聚集性病例、重癥或死亡時，縣（區(qū)）級及以上疾

病預防控制機構要立即組織開展現(xiàn)場調查處置。

1.流行病學調查。

（1）聚集性病例調查：了解聚集性病例的臨床表現(xiàn)、流行特征，

以分析流行因素，為采取防控措施提供依據(jù)。要對首發(fā)或指示病例開

展流行病學調查，填寫《手足口病個案調查表》(附件2)。

(2)重癥或死亡病例調查：詳細了解病例的基本信息、臨床癥狀、

發(fā)病就診治療過程、感染傳播情況、病原檢測結果，以分析重癥及死

亡病例的主要危險因素，填寫《手足口病重癥或死亡病例個案調查表》

(附件3)。調查結束后，各省級疾病預防控制中心應將結果錄入統(tǒng)一

數(shù)據(jù)庫，報送中國疾病預防控制中心。

(3)專題調查：根據(jù)當?shù)厥肿憧诓∫咔樘攸c及流行特征，可開展

專題調查，以了解當?shù)氐闹饕獋鞑シ绞揭约案腥疚ｋU因素等，為制定

干預措施提供依據(jù)。專題調查的方案及其內(nèi)容，應根據(jù)調查目的專門

設計。

(4)醫(yī)療機構要協(xié)助疾病預防控制機構對病例進行流行病學調

查。

2.傳染源的管理。

患兒應及時就醫(yī)，并遵醫(yī)囑采取居家或住院方式進行治療。居家

患兒，家長或監(jiān)護人應在社區(qū)(村)醫(yī)生的指導下，密切關注患兒的

病情變化，如發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等相關癥狀時，應

立即送醫(yī)院就診，同時，要盡量避免與其他兒童接觸。住院患兒應在

指定區(qū)域內(nèi)接受治療，防止與其他患兒發(fā)生交叉感染。

管理時限為自患兒被發(fā)現(xiàn)起至癥狀消失后1周。

鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院/社區(qū)衛(wèi)生服務中心、村衛(wèi)生室/社區(qū)衛(wèi)生服務站等負

責本轄區(qū)居家治療的手足口病患兒的隨訪工作，掌握居家治療患兒的

病情進展情況。

3.標本采集和檢測。

(1)所有重癥和死亡病例均要采集標本，可以采集咽拭子、糞便

或肛拭子、皰疹液、腦脊液、血清等，死亡病例還可采集腦、肺、腸

淋巴結等組織標本。聚集性病例至少要采集2例病例標本開展病原學

檢測。

(2)醫(yī)療機構負責樣本采集，疾病預防控制機構應指導醫(yī)療機構

進行相關生物學標本的采集。

（3）疾病預防控制機構根據(jù)本地的技術能力，對采集的標本開展

核酸檢測、病毒分離；不具備技術條件時，及時送上級機構進行檢測

（附件1）。

4.消毒措施。

病家、托幼機構和小學的消毒應在當?shù)丶膊☆A防控制機構的指導

下，由單位及時進行消毒，或由當?shù)丶膊☆A防控制機構負責對其進行

消毒處理。醫(yī)療機構的消毒由醫(yī)療機構安排專人進行。消毒方法參見

《消毒技術規(guī)范》（2002版）和《手足口病疫源地消毒指南》（附件4）o

5.健康教育。

各級醫(yī)療衛(wèi)生機構應在政府領導下，與當?shù)亟逃?、宣傳、廣電等

部門密切合作，充分利用12320公共衛(wèi)生公益熱線、廣播、電視、報

紙、網(wǎng)絡、手機短信、宣傳單/宣傳畫等多種方式，開展手足口病防治

知識的宣傳工作，使5歲以下兒童家長及托幼機構工作人員等了解手

足口病的臨床癥狀，掌握最基本的預防措施，強調保持良好的個人衛(wèi)

生習慣及環(huán)境衛(wèi)生措施對于有效預防手足口病的重要性，動員托幼機

構老師和管理人員、兒童家長成為手足口病防控工作的主動參與者，

形成群防群控。與重癥或死亡病例發(fā)病前1周或發(fā)病后有共同生活、

居住史的5歲以下兒童，要對其家長或監(jiān)護人進行健康教育，做好兒

童的密切觀察，出現(xiàn)癥狀要及時就診和治療。

（-）重點人群及重點機構的預防控制措施。

為降低人群手足口病的發(fā)病率，減少聚集性病例，避免醫(yī)院感染，

各地要做好以散居兒童為主的重點人群和以托幼機構、醫(yī)療機構為主

的重點場所的預防控制工作。

1.散居兒童的預防控制措施。

(1)飯前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等給兒童洗手；看

護人接觸兒童前、替幼童更換尿布、處理糞便后均要洗手；

(2)嬰幼兒的尿布要及時清洗、曝曬或消毒；注意保持家庭環(huán)境

衛(wèi)生，居室要經(jīng)常通風，勤曬衣被；

(3)嬰幼兒使用的奶瓶、奶嘴及兒童使用的餐具使用前后應充分

清洗、消毒；不要讓兒童喝生水、吃生冷食物；

(4)本病流行期間不宜帶兒童到人群聚集、空氣流通差的公共場

所；避免接觸患病兒童；

(5)兒童出現(xiàn)發(fā)熱、出疹等相關癥狀要及時到醫(yī)療機構就診；

(6)居家治療的患兒避免與其他兒童接觸，以減少交叉感染；父

母要及時對患兒的衣物進行晾曬或消毒，對患兒糞便及時進行消毒處

理。

2.托幼機構預防控制措施。

(1)每日進行晨檢，發(fā)現(xiàn)可疑患兒時，要采取立即送診、居家觀

察等措施；對患兒所用的物品要立即進行消毒處理；

(2)出現(xiàn)重癥或死亡病例，或1周內(nèi)同一班級出現(xiàn)2例及以上病

例，建議病例所在班級停課10天；1周內(nèi)累計出現(xiàn)10例及以上或3

個班級分別出現(xiàn)2例及以上病例時，經(jīng)風險評估后，可建議托幼機構

停課10天；

(3)教育、指導兒童養(yǎng)成正確洗手等良好的衛(wèi)生習慣；老師要保

持良好的個人衛(wèi)生狀況；

(4)教室和宿舍等場所要保持良好通風；定期對玩具、兒童個人

衛(wèi)生用具(水杯、毛巾等)、餐具等物品進行清洗消毒;

(5)定期對活動室、寢室、教室、門把手、樓梯扶手、桌面等物

體表面進行擦拭消毒；

(6)托幼機構應每日對廁所進行清掃、消毒，工作人員應戴手套,

工作結束后應立即洗手；

(7)托幼機構應配合衛(wèi)生部門采取手足口病防控措施。

3.醫(yī)療機構的預防控制措施。

(1)各級醫(yī)療機構應加強預檢分診，專辟診室(臺)接診發(fā)熱、

出疹的病例。增加候診及就診等區(qū)域的清潔消毒頻次，室內(nèi)清掃時應

采用濕式清潔方式；

(2)醫(yī)務人員在診療、護理每一位病例后，均應認真洗手或對雙

手消毒，或更換使用一次性手套；

(3)診療、護理手足口病病例過程中所使用的非一次性儀器、體

溫計及其他物品等要及時消毒；

(4)對住院患兒使用過的病床及桌椅等設施和物品必須消毒后才

能繼續(xù)使用；

(5)患兒的呼吸道分泌物和糞便及其污染的物品要進行消毒處

理。

附件：1.手足口病標本采集及檢測技術方案

2.手足口病個案調查表

3.手足口病重癥或死亡病例個案調查表

4.手足口病疫源地消毒指南

附件1

手足口病標本采集及檢測技術方案

一、采集標本的種類、保存和運輸

（一）糞便標本。

采集病人發(fā)病3日內(nèi)的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集

量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，外表貼上帶有唯一識別

號碼的標簽，4℃暫存12小時內(nèi)送達實驗室，-20℃以下低溫冷凍保藏,

需長期保存的標本存于-70℃冰箱。

（二）咽拭子標本。

采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣

棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅

速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推

薦使用維持液）的15nli外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿,

旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃

暫存并在12小時內(nèi)送達實驗室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保

存的標本存于-70℃冰箱。

（三）血清標本。

各?。▍^(qū)、市）在手足口病流行年份中均應采集EV71和CVA16

感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復

期（發(fā)病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染

后IgG和IgM抗體的動態(tài)變化，評價血清學抗體試劑盒的敏感性和

特異性。靜脈采集3-5m全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，

分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有

唯一識別號碼的標簽。將血清置于-20℃以下冰箱中冷凍保存。

（四）皰疹液。

在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診

該病毒為病因，可同時采集多個皰疹作為一份標本。先用75%的酒精

對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽藕取

皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液

或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉

簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。

所采集標本4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達實驗室，一20℃以下低溫冷

凍保藏，需長期保存的標本存于一70℃冰箱。

（五）肛拭子標本。

采集病人發(fā)病3日內(nèi)的肛拭子標本，用于病原檢測。用專用采

樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出

后，迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清細胞維持液）

的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標

簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。

（六）尸檢標本。

采集腦、肺和腸淋巴結等重要組織標本，每一采集部位分別使用

單獨的消毒器械。每種組織應多部位取材，每部位應取2-3份約5-10g

的組織，淋巴結2個，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存

管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。

（七）腦脊液標本。

出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標本，進行病毒分離

或核酸檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為

1.0-2.0mlo采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即

（12h內(nèi)）送達實驗室，一20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本

存于一70℃冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)時，很難在腦脊液中檢測到

EV71病原。

臨床標本在運輸和貯存過程中要避免反復凍融。標本采集后要

全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內(nèi)送達實驗室。依照《人間傳

染的病原微生物名錄》，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標本按B類

包裝，置于冷藏保存盒內(nèi)運輸，盡量縮短運輸時間?？刹捎藐懧坊?/p>

航空等多種運輸方式，但在運輸過程中應采取保護措施，避免強烈

震動、重力擠壓等現(xiàn)象。在送到省、地、市級CDC實驗室時，包裝

盒內(nèi)應帶冰且包裝完整。在上送標本的同時，需附帶相關的《手足

口病病例臨床標本采樣登記表》。

二、標本采集注意事項

在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒

即可診斷該病毒為病因。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在標本保

存液中，如含5%牛血清維持液。用于分子生物學診斷的標本采集與

病毒分離標本的采集方法一樣。為了保證檢測結果的準確性和有效

性，標本應在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標

本應冷凍保存。對于血清學診斷，急性期血清應該在發(fā)病后盡早采

集，恢復期血清在發(fā)病兩周后采集。標本保存液的配置見下表:

保存液

Eagle's液（MEM）80.5ml

3%L-谷氨酰胺1.0ml

200mM

胎牛血清5.Omi

7.5%NaHC()3溶液3.5mI

青、鏈霉素10ml

(各10000U/ml)

三、實驗室檢測操作流程

(一)病毒分離。

1?試劑配置

(1)細胞的生長液、維持液的配制見下表：

生長液維持液

(GM)(MM)

Eagle's液(MEM)86.5ml92.5mI

3%L-谷氨酰胺1.0ml1.0ml

200mM

胎牛血清10.0ml2.0ml

7.5%NaHC03溶液2.5mI3.5ml

青、鏈霉素1.0ml1.0ml

(各10000U/ml)

(2)糞便標本和肛拭子的處理液

完全PBS液中加入P.S溶液，終濃度為青霉素100單位/ml,鏈

霉素為100ug/mlo

完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中

即為完全PBS工作液。

A液:

試劑品名加入量

NACL8.00g

KCL0.20g

NazHPOK無水）0.91g

KH2P040.12g

用600~800ml蒸儲水溶解以上鹽類，加蒸儲水補至1000ml,10psi

(70Kpa)15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液(不含鈣、鎂離

子)。

B液：_____________________________

試劑品名加入量

MgCI2.6H200.10g

溶解于100ml蒸儲水中，10psi(70Kpa)15分鐘高壓滅菌。

C液:_____________________________

試劑品名加入量

CaCI20.10g

溶解于100ml蒸儲水中，10psi(70Kpa)15分鐘高壓滅菌。

2.病毒分離細胞系

許多細胞系可支持人腸道病毒(如EV71、CVA16)生長。

對于檢測手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CVA16等

腸道病毒感染的標本均需接種到以下兩種細胞系：

>RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤細胞。

>HEp-2細胞，來源于人喉癌上皮細胞。

3.標本的處理

（1）糞便標本和肛拭子的處理

操作步驟：

1）在離心管上標記標本號；

2）每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

3）在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離

心管中（確保離心管上的標號與原始標本的標號一致）；肛拭子為2ml;

4）剩余的原始標本最好留在原容器中，凍存于一20℃;

5）確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min;

6）在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離

心機在1500g條件下離心20min；

7）在生物安全柜中將每1份標本的上清液分別吸入2個有外螺

旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應再用氯仿處理1次）；

8）1管糞便懸液凍存于一20℃作為備份，另1管存于4-8℃以

備接種。

（2）皰疹液標本的處理

皰疹液標本通常直接用于RNA提取或病毒分離。

（3）腦脊液標本的處理

腦脊液標本通常直接用于病毒分離。

（4）咽拭子標本的處理

咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少40下），以洗

下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍

融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條

件下，10000rpm離心20min,用上清接種到細胞上或直接提取RNA。

如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。

4.接種和觀察(病毒分離)

(1)通常使用8ml的斜面試管培養(yǎng)細胞，傳細胞時，每管加細

胞培養(yǎng)液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康、無污

染的。一個健康的單層細胞會在傳代后48小時左右形成；

(2)倒掉生長液(GM),換上的維持液(MM)：

(3)每一份標本需要同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，

正確標記每支細胞培養(yǎng)管(包括標本的編號、日期、傳代數(shù))；

(4)每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；

(5)每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養(yǎng)溫度要求36℃。

(或者使用吸附的方法接種病毒：接種標本前，倒掉生長液(GM),

每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養(yǎng)溫度為36℃;吸附1小時后，

換上1.5ml的維持液(MM)。同樣每份標本需同時接種2支RD細胞和

2支HEp-2細胞。

(6)使用倒置顯微鏡每天觀察細胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸

道病毒致細胞病變效應(CPE)的出現(xiàn)(如細胞變圓，折光增強并脫離

管壁等)；

(7)記錄接種管和對照管細胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE

(1—4+)、提示細胞受毒性反應、老化或污染的影響而發(fā)生的變化

(1+,<25%;2+,25%-50%;3+,50%-75%;4+,75%-100%);

(8)如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實記錄，并觀察直

到75%的細胞發(fā)生變化(3+CPE),然后儲藏在一20℃以備二次傳代；

(9)第一代培養(yǎng)見可疑細胞病變時應繼續(xù)傳代，待細胞病變穩(wěn)定

出現(xiàn)后一20℃或一70℃凍存；

(10)一代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將

病毒保存在一20℃冰箱(二代病毒)。因二代病毒滴度高于一代病毒，

所以選用二代病毒進行鑒定；

(11)如果7d之后沒有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7d。(注

意：同一病例標本的細胞培養(yǎng)物不能混在一起再傳代，例如：不同細

胞的培養(yǎng)物應單獨傳代)；

(12)盲傳兩代后，仍然沒有出現(xiàn)CPE的，則判定為陰性；

(13)注意：如果接種后24h內(nèi)出現(xiàn)CPE,很可能是標本中的非

特異性成分導致的毒性反應。取100UI陽性分離物傳二代，繼續(xù)觀察;

或者在接種標本吸咐1h后用維持液清洗細胞層，可能會降低毒性反

應；

(14)幾個概念：

A:毒性反應：如果在接種后1-2d內(nèi)細胞快速凋亡，這可能是

由于標本中含有毒性物質而導致的非特異性毒性反應。這些已接種標

本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細胞中(此

時是第二代)。如果又出現(xiàn)了毒性反應，那么應該取原始標本用PBS稀

釋10倍，再次接種到同種細胞中。這時應被認為是第一代。

B:微生物污染：由于細菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細胞死亡經(jīng)常

使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現(xiàn)。重新取原始標本，用氯

仿或抗生素處理，按上述步驟重新接種到新鮮細胞上。

C:盲傳：有時一周之后傳代細胞會老化，甚至細胞對照也出現(xiàn)了

病變。這時已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到

同一類型的新鮮單層細胞中，再觀察7-10d。如果盲傳兩代后仍然沒

有產(chǎn)生CPE,那么認為這個標本是陰性的。

5.病毒分離結果解釋

RD細胞支持HFMD的主要病原體——CVA16和EV71等多種腸道病

毒的復制，CVA16和EV71均能在RD細胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒

致細胞病變效應（CPE）,表現(xiàn)為細胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，

最后細胞自管壁脫落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD細胞中生長

的速度不同，EV71的生長速度要快于CVA16,表現(xiàn)為EV71感染RD細

胞后出現(xiàn)CPE的時間比CVA16早，EV71接種細胞后出現(xiàn)CPE很快，但

CVA16一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPEo

若在使用RD細胞分離的同時再增加HEp-2細胞，可提高腸道病毒

的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體,如一些柯薩奇B組病毒）。

但CVA16和EV71在HEp-2細胞中均不繁殖。

（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度。

比較患者急性期血清與恢復期血清中和抗體滴度，可作為腸道病

毒感染的血清學診斷方法，最常用的是中和實驗，即用微量板法測定

抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測的最常用方法，該方法精確且

具有型特異性。

作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測定血清中腸道病毒中

和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復期血清滴度進行比較，抗體

滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，腸道病毒隱性感染也

很常見，所以在評估檢測結果時就要小心一些。在中和實驗中，一般

要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CVA16

原型株為G-10株）或流行株，有時同時（或單獨）使用臨床分離株會

有助于得到更準確的檢測結果。

使用對腸道病毒敏感的細胞，如RD細胞。用病毒（血清）稀釋液

（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸

液，因為是用病毒來確定血清中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原

型株），但有時使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準

確的檢測結果，但分離株的滴度（100CCIDso/0.05ml）要事先測定。

中和實驗的檢測原理：病毒感染敏感靶細胞后，引起細胞形態(tài)學

變化，出現(xiàn)CPE,特異性中和抗體與病毒結合后，可使病毒顆粒失去

感染性，抑制CPE的出現(xiàn)。

1.液體配制

A液：血清處理液：（100ml中含下列試劑成份）

MEM85ml

3%L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氫鈉2ml

胎牛血清2ml

青、鏈霉素（各10000U/ml）10ml

B液：細胞營養(yǎng)液：（按生長液配方配制，100ml中含下列試劑成

份）

MEM85mI

3%L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氫鈉2ml

HEPES1ml

胎牛血清10ml

青、鏈霉素（各10000U/ml）1ml

C液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下

列液體）

MEM93ml

3%L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氫鈉2ml

HEPES1ml

胎牛血清2ml

青、鏈霉素(各10000U/ml)1ml

2.攻擊病毒CCID5。滴定和滴度梯度制備

(1)將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件

下離心10min,取上清液分裝于10支凍存管中，每管一般每

管應在一次試驗中用完，有剩余應高壓后廢棄；

(2)加Eagle液10倍系列稀釋為1(T至1。與病毒液，各加入細

胞板內(nèi)，每孔50ul,每稀釋度4孔細胞；

(3)每孔加細胞懸液50HI,同時設細胞對照(50uI稀釋液+50

Ul細胞懸液)，36℃培養(yǎng)7d,觀察細胞病變；

(4)按Behrens-KWrber公式計算出分離病毒株的CCID50;

logCCID5O=L-d(S-0.5),其中：

L=實驗中使用的最低稀釋度的對數(shù)值；

d=稀釋梯度的對數(shù)值；

S=終判時陽性部分的總和(即出現(xiàn)CPE的細胞孔所占的

比例之和)。

(5)正式試驗前應先滴定攻擊病毒2-3次，取其平均值，求出每

0.05ml中含100CCID50的病毒載量；

(6)按照計算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗所需的病毒

總量(即100CCIDso/O.05ml);

(7)取3支小試管，每只加病毒稀釋液(液體配制中的C液)0.9ml;

（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經(jīng)稀釋好的攻擊病

毒液（即100CCID5o/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖,

輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1

CCIDso/O.05mI和0?1CCID5o/O.05mI。

稀釋好的已知滴度的病毒01ml八八

（100CCID50/0.05ml）\

病毒稀釋液0.9ml―?

3.稀釋血清

（1）發(fā)病1-3d內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后2-4周采取恢復

期血清，分別凍存在-20℃?zhèn)錂z。

（2）取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每

管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml,加待測血清0.1ml,

蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過夜，即為1:4稀釋血清。次日56℃>

30min滅活。

（3）打開獨立無菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血

清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml,每份血清使用一排，每排

4孔。使用移液器吸取處理過的血清0.1ml加入第一孔（即為1:16）,

吹吸8T0次，吸0.1ml加入第二孔（即為1:64）,依次至1:1024,

血清稀釋的過程中不必更換吸尖。即每份血清標本進行4倍倍比稀釋,

即1:4、1:16、1:64、1:256、1:1024。

（4）每份血清標本的每個稀釋度都要平行做兩孔。

4.病毒中和抗體測定的操作步驟：

(1)取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份(4對)待測

血清，版面設計如下圖所示。A1-A2孔(B1-B2、C1-C2.D1-D2.E1-E2、

F1-F2、G1-G2、H1-H2)中每孔加入1:1024稀釋度的待測血清0.05ml,

不必更換吸尖，在A3-A4孔(B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、

G3-G4、H3-H4)中每孔加入1:256稀釋度的待測血清0.05ml,A5-A6

孑L(B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6)中每孑L加

入1：64稀釋度的待測血清0.05ml,A7-A8孔(B7-B8、C7-C8、D7-D8、

E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8)中每孔加入1:16稀釋度的待測血清

0.05mI,A9-A10孔.(B9-B10、C9-C10.D9-D10,E9-E10,F9-F10、G9-G10、

H9-H10)中每孔加入1:4稀釋度的待測血清0.05ml,A11-A12孔

(B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12.F11-F12、G11-G12、H11-H12)

為每份待測血清對照孔，每孔中補加稀釋液0.05ml;

(2)上述孔中分別加入病毒0.05ml(病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為

100CCIWO.OSml)；

(3)蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36°CCO2孵箱中孵育

2h;

1:10241:2561:64|1:161」嘶泊對1?

標本檢測8O

1號標本A

2號標本B

3號標本C

4號標本D

S號標本E

6號標木IF

■號標本G

8號標本H

(4)另取一塊96孔板縱向使用，做1OOCCID5o/O.O5ml病毒滴度

的核實（每次實驗都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C

液）0.05ml,然后從0.1CCIDso/0.05ml加起,每孔0.05ml,每個稀

釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100CCID5o/O.O5ml;同時留出4

孔做為細胞對照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱

中暫存；

（5）在孵育期間，用消化液消化細胞，準備細胞懸液，細胞懸液

的濃度為2X1（）5個/m，每塊96孔板至少需要準備10ml;

（6）孵育結束后每個待測血清孔、血清對照孔（待檢標本板）和

病毒回滴孔和細胞對照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細胞懸液，

然后用微量板混勻器混勻，放入36°CCO?蜉箱中孵育培養(yǎng)；

（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE,并記錄病毒滴定結果，以不

產(chǎn)生細胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點效價。當100

CCIDso/O.05ml的病毒對照孔出現(xiàn)完全病變時，判定最終結果（約

5~7d）；

（8）注意：如果病毒對照結果（病毒回滴）不在32~320

CCIDso/O.OSml的范圍內(nèi)，實驗無效，就要重復實驗。

5.結果判定

當最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細胞病變，另一孔不出現(xiàn)

細胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計即為該血清標本的中和抗體效價；當高

稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀

釋度的倒數(shù)即為該血清標本的中和抗體效價；當兩個相鄰稀釋度血清

均出現(xiàn)1孔細胞病變，另1孔不出現(xiàn)細胞病變，則兩者平均稀釋度的

倒數(shù)即為該血清標本的中和抗體效價。

對于HFMD的雙份血清中和實驗結果來說，如果恢復期血清較急性

期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診;

如果恢復期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或

4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關實驗證

實；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和

抗體滴度為1:128判定為可疑陽性。

(三)逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)。

1.RNA提取

可使用多種商業(yè)化試劑盒來提取RNA,針對臨床標本應選擇質量

較高的“用于臨床標本病毒RNA提取的試劑盒”，也可使用全自動RNA

提取儀進行提取。針對病毒分離物，核酸提取比較容易，大部分商業(yè)

化RNA提取試劑盒都可有效的提取到RNAoRNA提取依據(jù)使用的試劑不

同，嚴格按說明書進行操作。

2.逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

(1)引物序列合成

國家脊灰實驗室自行設計3對引物，分別為人腸道病毒通用引物、

EV71特異性引物和CVA16特異性引物。各省CDC依據(jù)引物序列在質量

有保證的公司合成，引物合成后，需要做預實驗，保證引物合成沒有質

量問題后，分發(fā)給地市級CDCo

1）人腸道病毒（包括EV71、CVA16）核酸檢測通用引物序列:

PE2（上游）：5、-TGCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3

PE1（下游）：5'-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC-3

—>Polioviius（Maliooney-V01149）nt742

?g5--UTRE|VP4E

■-------------------------------------1-------

—??一

PE2PEI

nt446.47）以536?562

PC吁物長116bp

2）EV71核酸檢測引物序列:

EV71-S（上游）：5'-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3'

EV71-A（下游”5、-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3'

nt2439EV-1（BrCr-U22521）nt3329

VP3區(qū)JVPIEj2AE

EV71-SEV71-A

nt2372-23?2nt2578-2598

1I

PCRF物長226bp

3）CVA16核酸檢測引物序列：

CVA16-S（上游）：5'-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3'

CVA16-A（下游）;5'-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3'

nt2446CA16（G-10-U05876）nt3336

VP3區(qū)JVP1區(qū)J2Ag

CA哉CA16-A

nt2335-2355nt2523-2543

PCR產(chǎn)物長208bp

（2）實驗設計

1）在PCR記錄紙（實驗記錄紙）上記錄本次實驗操作者姓名，實

驗日期，所鑒定標本的名稱以及標本的順序，與PCR儀排列的順序一

致。

2）標記好加標本和對照的PCR管（陽性對照，陰性對照和試劑對

照）。

A:陽性對照：參比RNA,省級CDC提供（只是在初次使用，常規(guī)

不建議使用，以防污染）。

B:陰性對照：使用正常細胞RNA或臨床標本腸道病毒陰性的RNA

（每次實驗要設立）。

C:試劑對照：用去離子水代替標本（試劑初次使用時必須做）。

（3）RT-PCR擴增反應和條件

1）從臨床標本或病毒中提取的RNA和各種RT-PCR試劑應該一直

放在冰浴盒上；

2）配下列試劑主溶液：

r10XPCR

Buffer..............................................................

................................................................5.OuI

（dNTPs（2.5mM

each）.........................................................??????

.............................................................2.0uI

上游引物（O.1ug/u

I）..........................................................................

.............................................................1.0HI

下游引物（O.1ug/u

I）..........................................................................

.............................................................1.0UI

RNA酶抑制劑（RNasin,4OU/u

I）..........................................................................

?0.5UI

TaqDNA聚合酶（5U/u

I）..........................................................................

......................................................0.5uI

AMV逆轉錄酶（10U/U

I）..........................................................................

.......................................................1.0|iI

模板

RNA........................................................................

........................................................................3.0

UI

RNaseFree

dH20.......................................................................

..........................................................36.0uI

0

0

3)在PCR儀上進行RT-PCR反應，反應步驟如下:

42°C...............45min

95℃.......................3min

95℃..........1............20s

45℃.......................25sX32個循環(huán)

72℃.......................30s

72℃........................10min

4℃.......................Soak

3.電泳分析

(1)將已經(jīng)聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上；

(2)在帕拉膜(Parafilm)上加上6X電泳載樣緩沖液(每個

反應需1|iI)。再加上5uI的PCR反應產(chǎn)物與之混合；

(3)將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液

的混合溶液加到孔中；

(4)蓋上蓋子，接通電源，以10V/cm電壓(恒定電壓)電泳，

大約35-40min,直到澳酚藍跑到凝膠的底部的時候，停止電泳；

(5)將膠取出，并注意保持凝膠的方向；

(6)在1ug/ml的澳化乙錠溶液中染色15min,

注意：淡化乙錠溶液是有毒、致畸、并且致腫瘤的物質，操作時

要加小心，并戴雙層手套。如果儲存在避光的容器中，淡化乙錠溶液

可以重復使用。澳化乙錠廢棄物按醫(yī)療廢棄物中化學品的有關規(guī)定處

理。

(7)在蒸憎水中涮一下凝膠；

(8)在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物電泳結果，并照相作記錄。

有條件的實驗室可以使用全自動電泳分析儀。

4.結果解釋

使用全自動電泳分析儀的實驗室可以通過儀器自動讀取PCR產(chǎn)物

大小，來判斷結果。通過瓊脂糖凝膠做PCR產(chǎn)物電泳的實驗室，需要

參照DNA分子量對照對照，比較標本的PCR產(chǎn)物與陽性對照的PCR產(chǎn)

物在凝膠上的位置以及大小來解釋結果。

RT-PCR實驗結果解釋表

待檢標本RT-PCR結果鑒定結果

HEV(-),EV71(-),CVA16(一)非腸道病毒(NEV)

HEV(+),EV71(-),CVA16(一)非EV71、CVA16的其它腸道病毒

HEV(+),EV71(+),CVA16(-)EV71

HEV(+),EV71(-),CVA16(+)CVA16

(四)ReaI-timeRT-PCR(rRT-PCR)

1.病毒核酸提取

參考常規(guī)RT-PCR病毒核酸提取步驟和注意事項。

2.Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）

依據(jù)不同廠家的試劑盒，嚴格按相應說明書操作和判斷結果。有5

種試劑盒，分別為OneStepReal-timePCR法檢測EV71病毒核酸（單

通道檢測）：OneStepReal-timePCR法檢測CVA16核酸（單通道檢

測）；OneStepReaI-timePCR法檢測腸道病毒核酸（單通道檢測）；

OneStepReal-timePCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢

測）；OneStepReal-timePCR法同時檢測EV71和腸道病毒核酸（雙

通道檢測）。下面舉2個例子來說明單通道檢測和雙通道檢測的操作規(guī)

程和注意事項。

（1）OneStepReal-timePCR法檢測EV71病毒核酸（單通道

檢測）

①反應體系配置：反應體系共25口I,模板量可根據(jù)樣本情況自行

決定（臨床標本通常使用5口1的RNA模板量），不夠部分以水補足。

如選用另外試劑盒，反應體系及條件隨之變化。

a.從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時離心，

按n+1配置反應體系（n=樣本數(shù)+1管陽性對照+1管陰性對照），每個

測量反應體系配置如下表：