2型糖尿病患者與健康個體之間腸道雙歧桿菌的差異研究摘要近年來，研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患病率的增高，不能僅僅歸因于人類基因、飲食結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)狀況的改變，平均壽命的延長，或是平日運(yùn)動的減少，腸道菌群是控制體重和能量代謝的一個重要環(huán)境因素，并且與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)。目前已有研究表明，腸道菌群是參與脂代謝、促進(jìn)肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病發(fā)生的一個重要因素。2型糖尿病患者存在腸道菌群的失調(diào)，表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌含量增加，類桿菌含量減少等。腸道菌群可以顯著增加宿主能量的攝取、增加脂肪的儲存，可以通過增加腸道中單糖的吸收和肝臟甘油三酯的合成等途徑來促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，從而引起2型糖尿病的發(fā)生。雙歧桿菌是人體腸道菌群中的優(yōu)勢菌屬，也是常見的的益生菌之一，在維持腸道菌群與宿主之間相互作用的穩(wěn)定、保證宿主正常的新陳代謝等方面發(fā)揮著重要的作用。雙歧桿菌數(shù)量的減少可導(dǎo)致整個腸道菌群失調(diào)和腸道微生態(tài)失衡，從而導(dǎo)致許多代謝性疾病的發(fā)生。有研究表明，雙歧桿菌可以有效改善糖耐量和葡萄糖誘發(fā)的胰島素分泌功能，降低高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠內(nèi)毒素血癥和血漿脂肪組織的促炎癥因子水平，使小鼠的低濃度炎癥好轉(zhuǎn)，從而改善糖尿病代謝紊亂的狀態(tài)。還有研究發(fā)現(xiàn)，青春雙歧桿菌可以有效改善2型糖尿病大鼠腸道菌群的失調(diào)和脂質(zhì)代謝紊亂等癥狀。同時，雙歧桿菌已被廣泛用于腸道相關(guān)疾病的預(yù)防和治療，并表現(xiàn)出很好的功效。許多雙歧桿菌及含雙歧桿菌的制劑可以通過口服途徑來促進(jìn)腸道有益菌的生長，在腸道菌群相關(guān)疾病的治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，研究2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌的變化規(guī)律有著十分重要的意義。目前關(guān)于2型糖尿病患者與健康個體之間腸道雙歧桿菌差異的研究仍較少，并且國內(nèi)外對于雙歧桿菌的不同菌種在2型糖尿病患者腸道中如何變化的研究尚屬空白。本課題根據(jù)不同細(xì)菌的16SrRNA序列設(shè)計屬種特異性引物，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)對2型糖尿病患者和健康個體的腸道雙歧桿菌（包括雙歧桿菌總菌及其常見的4個菌種：長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌）進(jìn)行定量分析，并分析這些腸道細(xì)菌與2型糖尿病患者臨床特征的相關(guān)性，從而為進(jìn)一步研究腸道雙歧桿菌與2型糖尿病的關(guān)系提供依據(jù)。關(guān)鍵詞2型糖尿??；腸道雙歧桿菌；實時熒光定量PCR一、引言糖尿病是一種常見的代謝性疾病，近年來其患病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢。2型糖尿病作為糖尿病的主要類型，約占糖尿病患者總數(shù)的90%以上。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，2型糖尿病的發(fā)病與遺傳因素、生活方式（如飲食、運(yùn)動）以及年齡等因素密切相關(guān)。然而，越來越多的研究表明，腸道菌群在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色，成為了糖尿病研究領(lǐng)域的新熱點。腸道菌群是寄生于人體腸道內(nèi)微生物群落的總稱，包含了細(xì)菌、真菌、病毒等多種微生物，其中細(xì)菌數(shù)量最為龐大且研究最為廣泛。正常情況下，腸道菌群與宿主之間形成了一種互利共生的關(guān)系，對宿主的營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、免疫調(diào)節(jié)以及維持腸道屏障功能等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。當(dāng)腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，即出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)時，可能會引發(fā)一系列代謝性疾病，2型糖尿病便是其中之一。已有研究報道，2型糖尿病患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)，表現(xiàn)為腸道內(nèi)某些有益菌數(shù)量減少，有害菌數(shù)量增加，這種菌群失衡狀態(tài)可能通過多種途徑影響機(jī)體的代謝功能，進(jìn)而促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。雙歧桿菌作為人體腸道菌群中的優(yōu)勢菌屬，是一類重要的益生菌。雙歧桿菌具有多種重要的生理功能，例如調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)腸道屏障功能、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等。在維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定以及宿主健康方面，雙歧桿菌發(fā)揮著關(guān)鍵作用。眾多研究顯示，雙歧桿菌數(shù)量的減少與腸道微生態(tài)失衡以及多種代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。近年來，關(guān)于雙歧桿菌與2型糖尿病關(guān)系的研究逐漸增多，一些研究表明雙歧桿菌可能通過改善機(jī)體的糖脂代謝、減輕炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)腸道內(nèi)分泌功能等途徑，對2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生有益影響。然而，目前對于2型糖尿病患者與健康個體之間腸道雙歧桿菌的差異研究仍相對較少，尤其是針對雙歧桿菌不同菌種在2型糖尿病患者腸道中的變化情況，國內(nèi)外相關(guān)研究尚屬空白。深入探究2型糖尿病患者與健康個體之間腸道雙歧桿菌的差異，不僅有助于進(jìn)一步揭示腸道菌群與2型糖尿病之間的內(nèi)在聯(lián)系，還可能為2型糖尿病的預(yù)防、診斷和治療提供新的靶點和思路。二、腸道菌群與2型糖尿病的關(guān)系2.1腸道菌群在人體代謝中的作用腸道菌群參與人體多種代謝過程，對維持機(jī)體正常生理功能至關(guān)重要。在營養(yǎng)物質(zhì)代謝方面，腸道菌群能夠協(xié)助宿主消化和吸收一些難以被自身消化酶分解的多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)。例如，腸道中的某些細(xì)菌可以產(chǎn)生特定的酶，將膳食纖維分解為短鏈脂肪酸（如乙酸、丙酸和丁酸），這些短鏈脂肪酸不僅可以為腸道上皮細(xì)胞提供能量，還能通過血液循環(huán)進(jìn)入肝臟等組織器官，參與脂質(zhì)、糖和能量代謝的調(diào)節(jié)。腸道菌群還參與維生素的合成，如雙歧桿菌和乳酸桿菌等可以合成維生素B族和維生素K等，為宿主提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。在免疫調(diào)節(jié)方面，腸道菌群對宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持起著關(guān)鍵作用。腸道黏膜是人體最大的免疫器官，腸道菌群與腸道黏膜免疫系統(tǒng)相互作用，促進(jìn)免疫細(xì)胞的分化和成熟，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類型。正常的腸道菌群可以通過刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白A（sIgA）等免疫物質(zhì)，增強(qiáng)腸道黏膜的免疫屏障功能，抵御病原體的入侵。同時，腸道菌群還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，維持免疫平衡，防止過度免疫反應(yīng)的發(fā)生。2.22型糖尿病患者腸道菌群的特征大量研究通過高通量測序等技術(shù)手段，對2型糖尿病患者和健康個體的腸道菌群進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的腸道菌群存在明顯的失調(diào)現(xiàn)象。在菌群組成方面，2型糖尿病患者腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比例發(fā)生改變，通常表現(xiàn)為厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度降低。這種菌群比例的變化可能影響腸道對能量的攝取和儲存，進(jìn)而促進(jìn)肥胖和2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。腸桿菌科細(xì)菌在2型糖尿病患者腸道中的含量顯著增加，而類桿菌、雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量則明顯減少。腸桿菌科細(xì)菌中的一些菌株可以產(chǎn)生內(nèi)毒素，如脂多糖（LPS），當(dāng)腸道屏障功能受損時，內(nèi)毒素可能進(jìn)入血液循環(huán)，激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，而慢性炎癥是2型糖尿病發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)之一。2型糖尿病患者腸道菌群的多樣性和均勻度也顯著降低，菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差，這可能導(dǎo)致腸道菌群功能失調(diào)，影響機(jī)體的代謝和免疫功能。2.3腸道菌群失調(diào)促進(jìn)2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制腸道菌群失調(diào)促進(jìn)2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個方面。腸道菌群失調(diào)可能影響腸道屏障功能。正常情況下，腸道黏膜屏障由腸道上皮細(xì)胞、緊密連接蛋白以及黏液層等組成，能夠有效阻止腸道內(nèi)有害物質(zhì)（如細(xì)菌、內(nèi)毒素等）進(jìn)入血液循環(huán)。當(dāng)腸道菌群失調(diào)時，腸道上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能可能受到影響，緊密連接蛋白表達(dá)減少，黏液層變薄，導(dǎo)致腸道通透性增加，內(nèi)毒素等有害物質(zhì)容易進(jìn)入血液，引發(fā)全身慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而損傷胰島素靶細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。腸道菌群失調(diào)可能干擾機(jī)體的能量代謝和糖脂代謝。一方面，腸道菌群組成的改變可能影響腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，導(dǎo)致能量攝取增加，脂肪儲存增多，從而促進(jìn)肥胖的發(fā)生，而肥胖是2型糖尿病的重要危險因素。另一方面，腸道菌群代謝產(chǎn)物的改變也可能影響機(jī)體的糖脂代謝。例如，短鏈脂肪酸的產(chǎn)生減少可能影響肝臟對脂質(zhì)的代謝和儲存，導(dǎo)致血脂異常；同時，短鏈脂肪酸還可以通過作用于腸道內(nèi)分泌細(xì)胞，調(diào)節(jié)腸道激素（如胰高血糖素樣肽-1，GLP-1）的分泌，進(jìn)而影響胰島素的分泌和作用，導(dǎo)致血糖調(diào)節(jié)異常。腸道菌群失調(diào)還可能影響腸道內(nèi)分泌功能。腸道內(nèi)分泌細(xì)胞可以分泌多種腸道激素，如GLP-1、葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）等，這些腸道激素在調(diào)節(jié)血糖水平、促進(jìn)胰島素分泌以及抑制食欲等方面發(fā)揮著重要作用。腸道菌群失調(diào)可能干擾腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的功能，導(dǎo)致腸道激素分泌異常，進(jìn)而影響血糖的正常調(diào)節(jié)。三、雙歧桿菌的生物學(xué)特性及功能3.1雙歧桿菌的分類與分布雙歧桿菌屬于放線菌門雙歧桿菌科雙歧桿菌屬，是一類革蘭氏陽性、不抗酸、不形成孢子、不運(yùn)動的專性厭氧細(xì)菌。雙歧桿菌具有多種亞型，目前已發(fā)現(xiàn)32個亞型。雙歧桿菌廣泛存在于人和其他溫血動物的腸道中，在反芻動物的瘤胃、人的陰道、口腔以及母乳中也有少量存在。在人體腸道中，雙歧桿菌是重要的優(yōu)勢菌屬之一，其含量和分布因個體年齡、飲食結(jié)構(gòu)以及健康狀況等因素而異。母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道中雙歧桿菌含量最為豐富，其最初來源于母體，可占嬰兒總腸道細(xì)菌的60%。隨著年齡的增長，人體腸道中雙歧桿菌的種類和數(shù)量都會發(fā)生改變，一般60歲以上老人腸道中雙歧桿菌的數(shù)量僅占腸道細(xì)菌總量的8%左右。3.2雙歧桿菌的生理功能雙歧桿菌在維持腸道微生態(tài)平衡以及宿主健康方面具有多種重要的生理功能。雙歧桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。雙歧桿菌通過與腸道內(nèi)其他微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點，抑制有害菌的生長繁殖，同時促進(jìn)有益菌的生長，維持腸道菌群的生態(tài)平衡。雙歧桿菌可以產(chǎn)生有機(jī)酸（如乙酸、乳酸等），降低腸道環(huán)境的pH值，這種酸性環(huán)境不利于有害菌的生存，從而有助于調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。雙歧桿菌能夠增強(qiáng)腸道屏障功能。雙歧桿菌可以黏附在腸道上皮細(xì)胞表面，形成一層生物膜，阻止病原體的入侵。雙歧桿菌還可以促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞之間的緊密連接，提高腸道黏膜的屏障功能。此外，雙歧桿菌能夠刺激腸道黏液細(xì)胞分泌黏液，增加黏液層的厚度，進(jìn)一步增強(qiáng)腸道的物理屏障功能。雙歧桿菌在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收方面也發(fā)揮著重要作用。雙歧桿菌可以產(chǎn)生多種酶類，如β-半乳糖苷酶、淀粉酶等，幫助宿主消化吸收乳糖、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)。雙歧桿菌還參與維生素的合成，能夠合成維生素B1、B2、B6、葉酸、泛酸和B12等，為宿主提供必要的維生素營養(yǎng)。雙歧桿菌對機(jī)體免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。雙歧桿菌可以通過與腸道黏膜免疫系統(tǒng)相互作用，促進(jìn)免疫細(xì)胞的分化和成熟，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類型。雙歧桿菌能夠刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生sIgA等免疫物質(zhì)，增強(qiáng)腸道黏膜的免疫屏障功能。雙歧桿菌還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，維持免疫平衡，防止過度免疫反應(yīng)的發(fā)生。3.3雙歧桿菌與代謝性疾病的關(guān)系越來越多的研究表明，雙歧桿菌與代謝性疾?。ㄈ绶逝?、2型糖尿病、高血脂等）密切相關(guān)。在肥胖方面，一些研究發(fā)現(xiàn)，肥胖個體腸道中雙歧桿菌的數(shù)量明顯低于正常體重個體。補(bǔ)充雙歧桿菌可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、改善腸道屏障功能、抑制脂肪吸收以及調(diào)節(jié)能量代謝等途徑，減輕體重和改善肥胖相關(guān)代謝紊亂。在2型糖尿病方面，已有研究證實，2型糖尿病患者腸道中雙歧桿菌的數(shù)量顯著減少。雙歧桿菌可能通過多種機(jī)制對2型糖尿病產(chǎn)生有益影響。雙歧桿菌可以改善機(jī)體的糖脂代謝，通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)分泌功能，促進(jìn)GLP-1等腸道激素的分泌，進(jìn)而刺激胰島素的分泌和提高胰島素敏感性，降低血糖水平。雙歧桿菌還可以減輕炎癥反應(yīng)，降低體內(nèi)炎癥因子水平，改善胰島素抵抗。此外，雙歧桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，間接影響機(jī)體的代謝功能。在高血脂方面，雙歧桿菌可以通過降低血清膽固醇、甘油三酯等血脂指標(biāo)，改善脂質(zhì)代謝紊亂。雙歧桿菌可能通過結(jié)合膽汁酸，促進(jìn)膽汁酸的排泄，減少膽固醇的重吸收，從而降低血清膽固醇水平。四、2型糖尿病患者與健康個體腸道雙歧桿菌的差異研究4.1研究對象與方法4.1.1研究對象選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病患者和健康個體作為研究對象。2型糖尿病患者均根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，且排除患有其他嚴(yán)重慢性疾病（如嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤等）、近期使用過抗生素或益生菌制劑以及妊娠或哺乳期婦女。健康個體則經(jīng)過全面體檢，排除患有糖尿病及其他慢性疾病，近期未使用過抗生素或益生菌制劑。詳細(xì)記錄研究對象的一般臨床資料，包括年齡、性別、體重、身高、體重指數(shù)（BMI）等。4.1.2樣本采集在保證符合倫理道德的前提下，收集研究對象的新鮮糞便樣本。要求研究對象在采集糞便樣本前3天內(nèi)避免食用辛辣、油膩等刺激性食物，避免劇烈運(yùn)動。采用無菌便盒收集糞便樣本，采集后立即放入便攜式低溫保存箱中，在2小時內(nèi)運(yùn)送至實驗室，并于-80℃冰箱中保存待測。4.1.3腸道雙歧桿菌定量分析采用實時熒光定量PCR技術(shù)對糞便樣本中的腸道雙歧桿菌進(jìn)行定量分析。根據(jù)不同細(xì)菌的16SrRNA序列設(shè)計屬種特異性引物，分別用于擴(kuò)增雙歧桿菌總菌及其常見的4個菌種（長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌）的16SrRNA基因片段。提取糞便樣本中的細(xì)菌基因組DNA，以提取的DNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件根據(jù)所使用的PCR試劑盒說明書進(jìn)行優(yōu)化和設(shè)置。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行定量分析，計算出每克糞便樣本中雙歧桿菌總菌及各菌種的拷貝數(shù)。4.2研究結(jié)果4.2.1兩組人群腸道雙歧桿菌總菌及各菌種數(shù)量的比較2型糖尿病組腸道雙歧桿菌總菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌的定量結(jié)果分別為10.97(10.25～11.26)、3.49(3.26～3.81)、3.94(3.76～4.13)、3.44(3.34～3.57)、3.80(3.23～4.66)，健康對照組分別為11.56(10.97～11.92)、3.68(3.30～4.48)、4.02(3.52～4.12)、4.01(3.72～4.28)、4.23(2.92～4.72)。與健康對照組相比，2型糖尿病組腸道雙歧桿菌總菌和青春雙歧桿菌的數(shù)量均顯著減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（兩者均P=0.000），而長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌的數(shù)量兩組間無顯著性差異(P=0.101，0.676，0.964)。4.2.22型糖尿病患者腸道雙歧桿菌與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌總菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌拷貝數(shù)與空腹血糖（FPG）、餐后2小時血