microrna對人視網(wǎng)膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的影響

視障母親（rb）是兒童最常見的核電站視覺腫瘤。調(diào)查顯示5歲以下兒童RB發(fā)病率高達11.8/100萬,占同齡兒童惡性腫瘤的6.1%。在我國臺灣,RB的5年生存率為81%,其中雙眼RB5年生存率僅64.3%。流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),我國RB診斷滯后,化學(xué)減容治療效果不佳,很多患者最終不得不接受眼球摘除術(shù)來控制腫瘤的發(fā)展,這主要是由于部分RB表達多種耐藥相關(guān)蛋白如P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),多藥耐藥相關(guān)蛋白(multi-drugrelatedprotein,MRP)、肺耐藥蛋白(lungresistanceassociatedprotein,LRP)等,因而對化療不敏感。惡性腫瘤對化療的多藥耐藥性是大多數(shù)惡性腫瘤化療效果不佳最主要的原因?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明,microRNA不但廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,而且與腫瘤耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。這些研究都指出:microRNA與腫瘤干細胞的侵襲性和耐藥性密切相關(guān),調(diào)控microRNA可以抑制腫瘤干細胞的耐藥性,提高其對化療的敏感性。為探究MicroRNA調(diào)控人RB腫瘤干細胞多藥耐藥性的機制,本研究組做了相關(guān)研究,現(xiàn)報道如下:1材料和方法1.1抗菌藥物的檢測Y79細胞(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科實驗室提供),含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基、無血清化學(xué)限定培養(yǎng)基、10%FBS:1640培養(yǎng)基、抗-ABCG2抗體、IgG2a抗體、山羊抗鼠FITC二抗、MTT試劑盒、Signosisnorthernblot試劑盒、熒光素酶測試試劑Ⅱ。實驗用抗腫瘤藥物為長春新堿、依托泊苷和卡鉑。長春新堿濃度梯度為0.1、1.0、10μg/mL,依托泊苷濃度梯度為0、50、100μmol/L,卡鉑濃度梯度為0、50、150μmol/L。長春新堿、依托泊苷和卡鉑的血漿峰濃度(PPC)分別為5.0、2.0、1.0μg/mL。1.2實驗方法1.2.1運行各組abcg2+細胞的培養(yǎng)用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng),擴增Y79細胞至8×107個,打碎后重懸至濃度1×107個/mL,無菌條件下與抗-ABCG2抗體于4℃孵育20min,采用IgG2a抗體作為同型對照。PBS洗滌細胞,加入5μL山羊抗鼠FITC二抗,4℃,20min,3~5次洗滌后上流式細胞儀進行分選。分選后實驗組ABCG2(+)細胞用無血清化學(xué)限定培養(yǎng)基培養(yǎng),對照組ABCG2(-)細胞用10%FBS:1640培養(yǎng)基培養(yǎng),2~3d換液1次,定期傳代。流式細胞法,檢測分選后的ABCG2細胞表達率。1.2.2藥物處理及復(fù)孔首先委托ABI公設(shè)計合成具有莖環(huán)(stemloop)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和用miRNA熒光標記的特異分子探針。用Trizol抽提總RNA,將抽提的RNA進行反轉(zhuǎn)錄的cDNAz作為real-timePCR檢測的模板,加入引物及探針(表1),調(diào)整好總體積后加入96孔板,設(shè)3個重復(fù)板。將分選出的ABCG2(+)與ABCG2(-)細胞稀釋至1×105個/mL,接種于96孔板中,每孔105個細胞。加入不同濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑,每種藥物分三個濃度梯度(長春新堿濃度梯度為0.1、1.0、10μg/mL,依托泊苷濃度梯度為0、50、100μmol/L,卡鉑濃度梯度為0、50、150μmol/L)。每種藥物分設(shè)7個復(fù)孔,設(shè)置對照組和空白組(以營養(yǎng)液代替試劑),培養(yǎng)2d。向每孔分別加入20μLMTT,繼續(xù)培養(yǎng)12h,將各個孔中的營養(yǎng)液全部吸出,溶解,振蕩30min,選擇490nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值)。1.2.3卡鉑的加入將分選的ABCG2(+)與ABCG2(-)細胞稀釋至1×105個/mL,放入培養(yǎng)箱中進行48h的培養(yǎng),然后實驗組加入卡鉑(濃度為1.0μmol/L);對照組則不加卡鉑。培養(yǎng)24h后,收集待測細胞,并用3000r/min離心6min,棄上清液,乙醇固定18h后離心,PBS洗滌細胞,加入5μL山羊抗鼠FITC二抗,4℃,20min,3~5次洗滌后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。1.2.4電子標本定位病理科切片,行LRP、MRP1,P-gp免疫組化染色,收集高表達三種蛋白的RB標本6例作為高耐藥組,均低表達的RB標本6例作為低耐藥組;行LNA-原位雜交觀察候選microRNA在高耐藥組和低耐藥組的定位并半定量檢測;蠟塊組織提取RNA,通過realtimePCR觀察候選microRNA在兩組中表達差異。1.3分布計量資料采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0進行分析,正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差(ue0af±s)表示,兩組間計量資料采用t檢驗;計數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1abcg2+的評分流式細胞儀分選Y79細胞中ABCG2(+)及ABCG2(-),分選后ABCG2(+)為91.7%,顯著高于分選前(5.7%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。2.2堿、依托泊苷和卡鉑對abcg2+細胞的耐藥性MTT法檢測ABCG2(+)及ABCG2(-)細胞對長春新堿、依托泊苷和卡鉑的耐藥性。長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到0.1μg/mL時,可殺滅和抑制ABCG2(-)細胞;長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到1.0μg/mL時,ABCG2(+)表現(xiàn)出顯著抗藥,說明ABCG2(+)細胞在PPC1.0μg/mL長春新堿、依托泊苷和卡鉑的作用下,依然不受其抑制生長;長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到10.0μg/mL水平以上,對ABCG2(+)細胞才出現(xiàn)抑制作用。對比各個濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑對ABCG2細胞的作用顯示,ABCG2(+)細胞有顯著高于ABCG2(-)細胞的耐藥性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在3種化療藥物中,卡鉑抑制細胞生長的作用最為顯著,尤其對ABCG2(-)細胞的抑制最為明顯。見圖2。2.3abcg2+細胞的凋亡和死后量和卡鉑蓄積量測定應(yīng)用流式細胞儀,對ABCG2(+)和ABCG2(-)細胞在0、24、48h凋亡率的檢測結(jié)果顯示:ABCG2(-)細胞的凋亡率顯著大于ABCG2(+)細胞,且凋亡率與用藥時間有關(guān)。ABCG2(-)出現(xiàn)“亞G1峰”,且隨時間發(fā)展而累積,說明有越來越多的細胞凋亡和壞死;ABCG2(+)未出現(xiàn)“亞G1峰”,說明ABCG2(+)細胞未出現(xiàn)明顯凋亡和壞死。ABCG2(+)明顯低于ABCG2(-),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。應(yīng)用流式細胞儀,對ABCG2(+)及ABCG2(-)細胞4、24h時卡鉑熒光強度進行監(jiān)測(反映卡鉑在細胞內(nèi)蓄積水平)。峰值及熒光強度表現(xiàn)為:ABCG2(-)細胞峰值右移、平均熒光強度為9.78和15.35,表明細胞內(nèi)卡鉑蓄積量增加;ABCG2(+)細胞峰值左移、平均熒光強度為4.39和2.17,表明細胞內(nèi)卡鉑蓄積量減少。ABCG2(+)的藥物蓄積明顯低于ABCG2(-),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。2.4兩組患者的microrna表達率比較通過對RB病理切片中的高耐藥組的與低耐藥組的rt-PCR觀察,發(fā)現(xiàn)高耐藥組的microRNA表達率(39.3%)明顯高于低耐藥組的microRNA表達率低(5.2%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。3rab腫瘤干細胞調(diào)控多藥耐藥性的分子機制視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)是兒童最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤。臨床多表現(xiàn)為瞳孔區(qū)反射黃白色光,患兒視力減退,甚至造成斜視。腫瘤組織可通過視網(wǎng)膜進入玻璃體,甚至經(jīng)淋巴結(jié)及血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至全身,導(dǎo)致患兒死亡。由于RB的化學(xué)減容治療效果不佳,多數(shù)患者只能通過眼球摘除術(shù)控制腫瘤細胞的增生,造成患兒終身眼疾,嚴重影響了患者的身心健康。有關(guān)研究顯示,RB化療效果不佳主要是由于其表達多種耐藥相關(guān)的蛋白,包括P-糖蛋白P-gpMRP、LRP等。為提高化療對RB的治療效果,學(xué)者開始研究視網(wǎng)膜母細胞多藥耐藥性的機制。研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤對化療的耐藥性根據(jù)耐藥譜可分為原藥耐藥和多藥耐藥(multi-drugresistance,MDR),其中MDR是由一種藥物誘發(fā),但同時又對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機制迥異的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥,是大多數(shù)惡性腫瘤化療效果不佳最主要的原因。腫瘤干細胞(CSCs),具有自我更新和多向分化能力。腫瘤干細胞耐藥這一特征,被認為是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、多藥耐藥的根源。MicroRNA即小RNA,通過結(jié)合靶標mRNA抑制蛋白表達,從而構(gòu)成了一種新的蛋白表達調(diào)控機制。由于microRNA與腫瘤干細胞的侵襲性和耐藥性密切相關(guān),因此調(diào)控microRNA可以抑制腫瘤干細胞的耐藥性,提高其對化療的敏感性。為探究MicroRNA調(diào)控人視網(wǎng)膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的機制,本研究組通過ABCG2分選RB細胞系Y79中的腫瘤干細胞,結(jié)合臨床組織標本篩選RB耐藥相關(guān)microRNA并進一步研究其功能,探索RB腫瘤干細胞調(diào)控多藥耐藥性的分子機制。本研究結(jié)果顯示:(1)分選陽性率:分選前陽性率僅為5.7%,說明ABCG2(+)細胞只是Y79細胞中的含量極少的亞群,通過流式細胞儀分選后陽性率提升至91.7%,有效提高了ABCG2(+)純度,為下一步實驗提供了高純度細胞。(2)分選細胞對長春新堿、依托泊苷和卡鉑的藥物敏感性:長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到0.1μg/mL時,可殺滅和抑制ABCG2(-)細胞;長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到1.0μg/mL時,ABCG2(+)表現(xiàn)出顯著抗藥,說明ABCG2(+)細胞在PPC1.0μg/mL長春新堿、依托泊苷和卡鉑的作用下,依然不受其抑制;長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到10.0μg/mL水平以上,對ABCG2(+)細胞才出現(xiàn)抑制作用。對比各個濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑對ABCG2細胞的作用顯示,ABCG2(+)細胞有顯著高于ABCG2(-)細胞的耐藥性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明ABCG2(+)細胞對多種化療藥物均有耐藥性,即對化療藥物具有多藥耐藥性。有關(guān)研究指出ABCG2可促進細胞排出化學(xué)藥,是當(dāng)今最常用的耐藥標記蛋白之一。有學(xué)者利用ABCG2為標志物從RB細胞系和Y79細胞系中分選出了腫瘤干細胞(CSCs),并且發(fā)現(xiàn)這種CSCs的自我更新和體內(nèi)腫瘤形成能力受Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié),且對組織的耐藥性有一定影響。(3)流式細胞儀檢測分選細胞的凋亡率和細胞內(nèi)藥物蓄積(經(jīng)PPC1.0μg/mL卡鉑處理)應(yīng)用流式細胞儀,對ABCG2(+)和ABCG2(-)細胞在0、24、48h凋亡率的檢測:ABCG2(-)細胞的凋亡率顯著大于ABCG2(+)細胞,且凋亡率與用藥時間有關(guān)。ABCG2(-)組出現(xiàn)“亞G1峰”,且隨時間發(fā)展而累積,說明有越來越多的細胞凋亡和壞死;ABCG2(+)組未出現(xiàn)“亞G1峰”,說明ABCG2(+)細胞未出現(xiàn)明顯凋亡和壞死。兩組凋亡率比較,ABCG2(+)組明顯低于ABCG2(-)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);應(yīng)用流式細胞儀,對ABCG2(+)及ABCG2(-)細胞4、24h時卡鉑熒光強度進行監(jiān)測(反映卡鉑在細胞內(nèi)蓄積水平)。峰值及熒光強度表現(xiàn)為:ABCG2(-)細胞峰值右移、平均熒光強度為9.78和15.35,表明細胞內(nèi)卡鉑蓄積量增加;ABCG2(+)細胞峰值左移、平均熒光強度為4.39和2.17,表明細胞內(nèi)卡鉑蓄積量減少。ABCG2(+)組的藥物蓄積明顯低于ABCG2(-)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步說明ABCG2(+)細胞的抗藥性強勁且對化療藥物的蓄積量極低,這一特性提高了ABCG2(+)細胞對藥物的耐藥性。(4)候選microRNA在不同耐藥性RB切片中的表達:通過對RB病理切片中的高耐藥組與低耐藥組的rt-PCR觀察,發(fā)現(xiàn)高耐藥組的microRNA表達率(39.3%)明顯高于低耐藥組的microRNA表達率低(5.2%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有學(xué)者指出在視網(wǎng)膜前體細胞中RB基因,P53基因,microRNA-17~92同時表達下降時可以抑制RB的形成,從而抑制耐藥性。由此可以看出microRNA在調(diào)節(jié)腫瘤干細胞多藥耐藥性中起到了重要作用。綜上所述,microRNA是調(diào)控人視網(wǎng)膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的重要因素,可通過調(diào)控microRNA來抑制腫瘤干細胞的耐藥性,提高對化療的敏感性,有利于視網(wǎng)膜母細胞瘤患