擴(kuò)心方對(duì)nn2a突變斑馬魚心臟保護(hù)作用的研究

擴(kuò)張性心肌病是慢性心力衰竭最常見的原因之一。到目前為止，沒有特定的治療方法，預(yù)后非常差，五年生存率不到50%。中國(guó)擴(kuò)張性心肌病的發(fā)病率為13.10萬到84萬。1材料和方法1.1材料表面1.1.1斑馬魚的養(yǎng)殖和飼養(yǎng)方案正常野生型斑馬魚(cmlc2)、轉(zhuǎn)基因斑馬魚(tnnt2a+/-)由復(fù)旦大學(xué)代謝與分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室斑馬魚實(shí)驗(yàn)平臺(tái)提供。斑馬魚的喂養(yǎng)和產(chǎn)卵方案按照ZebrafishBook進(jìn)行。斑馬魚發(fā)育成熟后進(jìn)行交配產(chǎn)卵,供本研究使用。1.1.2藥渣的提取和測(cè)定擴(kuò)心方由生黃芪30g、黃精30g、丹參15g、桂枝3g、瓜蔞皮30g、黃荊子9g等組成,飲片由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供。藥材加水浸泡后煮沸提取1h,濾出藥渣。藥渣再加水煮沸提取1h。合并兩次提取液,于真空干燥箱內(nèi)80℃干燥至固體,得總提取物?？偺崛∥镔|(zhì)量與擴(kuò)心方原藥質(zhì)量的比值為1∶11,配成1mg/ml儲(chǔ)存液,-20℃分裝保存,用時(shí)稀釋至所需濃度。甲基纖維素、TRIzol,美國(guó)Sigma公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、鹽酸乙醇快速分化液、4%多聚甲醛固定液(PFA),上海碧云天生物技術(shù)公司;ATP含量測(cè)定試劑盒(比色法),南京建成生物技術(shù)公司;PCR反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)試劑盒,日本TaKaRa株式會(huì)社;引物由上海生工生物工程有限公司合成(見表1)。1.1.3pcr檢測(cè)設(shè)備冰凍切片機(jī)(CM1950),德國(guó)Leica公司;解剖顯微鏡(SZX12)、數(shù)碼相機(jī)(DP-70),日本Olympus株式會(huì)社;StepOnePlus定量PCR儀,美國(guó)AppliedBiosystems公司;分光光度計(jì)(ND2000),美國(guó)ThermoFisher公司;酶標(biāo)分析儀,美國(guó)BioTekSynergy公司。1.2tnnt2a基因突變斑馬魚的鑒定用已經(jīng)鑒定的雜合子轉(zhuǎn)基因斑馬魚(tnnt2a+/-)進(jìn)行內(nèi)交,可以得到實(shí)驗(yàn)用的純合子(tnnt2a-/-)即tnnt2a基因突變斑馬魚。(tnnt2a-/-)純合突變斑馬魚表現(xiàn)為心臟停搏、房室增大,進(jìn)行性加重的腹部水腫1.3指標(biāo)和方法的檢測(cè)1.3.1報(bào)告期內(nèi)內(nèi)斗魚的生存率將斑馬魚置于6孔板中,每孔10條,每組30條,每24h更換胚胎水1次。每隔24h統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚生存和死亡的數(shù)目。1.3.2sv-ba距離觀察將斑馬魚放于3%的甲基纖維素中,擺放于側(cè)臥位,于解剖顯微鏡下觀察并拍照記錄,根據(jù)標(biāo)尺的實(shí)際大小,于ImageJ中換算成實(shí)際的SV-BA距離。1.3.3液氮罐+包埋將斑馬魚用4%的PFA進(jìn)行固定,4℃低溫?fù)u床上過夜,然后梯度到蔗糖溶液中。并用OCT包埋劑進(jìn)行包埋,置于液氮罐中急速降溫,轉(zhuǎn)移到-80℃中長(zhǎng)期保存。切片前預(yù)冷冰凍切片機(jī),待溫度降至-20℃,用切片機(jī)進(jìn)行切片,切片后貼于防脫載玻片上,染蘇木素6～8min,洗滌3次,分化液進(jìn)行分化,洗滌2次,伊紅染色半分鐘,75%乙醇洗滌3次,封片,用顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。1.3.4雙蒸法提取在受精后5天(5dpf)時(shí),將斑馬魚先置于冰上,然后每組取30條,加入沸雙蒸水,置于沸水浴煮10min,混勻抽提2min,離心取上清。測(cè)蛋白濃度,根據(jù)試劑盒操作說明,通過酶標(biāo)儀檢測(cè)636nm下的OD值,計(jì)算ATP含量。1.3.5bax的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)斑馬魚凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax的表達(dá),并計(jì)算比值。采用TRIzol法提取各組斑馬魚的總RNA,并測(cè)定其濃度,按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進(jìn)行RT-PCR,應(yīng)用21.4統(tǒng)計(jì)方法采用graphpadPrism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以2結(jié)果2.1各組患者的生存率對(duì)照組斑馬魚在1～7天內(nèi)沒有死亡。模型組和擴(kuò)心方組的斑馬魚從第4天開始出現(xiàn)死亡,隨著時(shí)間的推移死亡率明顯增加。模型組第4、5、6、7天生存率依次為96.67%、86.67%、73.33%、50.00%,擴(kuò)心方組第4、5、6、7天生存率依次為96.67%、93.33%、90.00%、76.67%。與對(duì)照組比較,模型組斑馬魚的生存率明顯降低(P<0.01)。與模型組比較,擴(kuò)心方組斑馬魚的生存率升高(P<0.05)。見圖1。2.2斑馬魚sv-ba的距離對(duì)照組斑馬魚無心包水腫,活動(dòng)力強(qiáng)。模型組斑馬魚心臟停搏,心房、心室變大,心包嚴(yán)重水腫,活動(dòng)力明顯受到影響,與臨床擴(kuò)張性心肌病患者具有一定的相似性。見圖2A。斑馬魚的靜脈竇-動(dòng)脈球(SV-BA)之間的距離,是反映斑馬魚心臟損傷的一個(gè)重要指標(biāo)。結(jié)果顯示,對(duì)照組斑馬魚SV-BA為(151.02±12.26)μm,模型組和擴(kuò)心方組SV-BA分別為(288.31±23.83)μm和(287.80±25.11)μm,與對(duì)照組比較,模型組斑馬魚的SV-BA明顯變大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,擴(kuò)心方組斑馬魚的SV-BA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明擴(kuò)心方并不能改善心臟擴(kuò)大。見圖2B。2.3斑馬魚組織形態(tài)特征HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組斑馬魚心臟大小正常,無心包水腫,心肌細(xì)胞排列緊密;模型組斑馬魚表現(xiàn)為心包水腫,心臟變大,心肌細(xì)胞排列比較稀疏;擴(kuò)心方組斑馬魚仍有心包水腫,心臟變大,心肌細(xì)胞排列稀疏,但比模型組排列緊密。見圖3。2.4型組與對(duì)照組斑馬魚atp含量的比較模型組斑馬魚ATP的含量明顯下降,與對(duì)照組比較,模型組斑馬魚的ATP含量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,擴(kuò)心方組斑馬魚的ATP含量有所上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。2.5bax的基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較,模型組bcl-2的基因相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,擴(kuò)心方組bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.01)。與對(duì)照組比較,模型組bax的基因相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,擴(kuò)心方組bax的基因相對(duì)表達(dá)量沒有明顯變化(P>0.05)。與對(duì)照組比較,模型組bcl-2/bax的基因相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,擴(kuò)心方組bcl-2/bax的基因相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.01)。表明模型組的細(xì)胞凋亡增加,而擴(kuò)心方可以減少模型組其凋亡。見圖5。3保乳手術(shù)治療擴(kuò)心方擴(kuò)張型心肌病的模型以往多是藥物造模,如阿霉素、呋喃唑酮等,但不足以反映其全部病因遺傳因素所導(dǎo)致的擴(kuò)張性心肌病,常用的是轉(zhuǎn)基因大小鼠模型,但是其價(jià)格相對(duì)較高,給藥時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng);而建立轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系的方法已經(jīng)成熟,可以短時(shí)間內(nèi)大量傳代,可用于藥物快速篩選和機(jī)制研究,且由于斑馬魚模型心血管系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物有相似之處,近年來在心血管系統(tǒng)的藥物篩選中得到了廣泛的應(yīng)用課題組周端教授認(rèn)為擴(kuò)張型心肌病的病因病機(jī)為“正虛(氣陰虛損)邪阻(瘀痰水阻留)”,治以益氣養(yǎng)陰、溫通陽氣、活血化痰利水,設(shè)擴(kuò)心方治療。本方由生黃芪、黃精、丹參、桂枝、瓜蔞皮等組成。黃芪、黃精補(bǔ)益心氣、滋腎補(bǔ)陰,桂枝溫陽利水,丹參、瓜蔞皮活血化瘀。本課題組前期的臨床研究表明,擴(kuò)心方對(duì)擴(kuò)張型心肌病患者的癥狀及心功能改善均有較好的作用(包括心功能分級(jí)、BNP),優(yōu)于單純西藥治療,可明顯提高患者的生活質(zhì)量,降低部分患者的再入院率,提示遠(yuǎn)期療效較好能量代謝是心臟收縮功能和內(nèi)環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)心功能受到損傷時(shí),心肌細(xì)胞葡萄糖、脂肪酸等物質(zhì)代謝紊亂,從而引起心臟能量代謝途徑改變,導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常程序性細(xì)胞死亡(PCD)是一種由基因控制的,在多種細(xì)胞和生