感冒清熱顆粒揮發(fā)油包合物的制備工藝研究

感冒清熱由陳皮、桂枝和甘草組成。具有清熱、去粘液、止咳、哮喘等功效。臨床應(yīng)用多年，療效顯著。陳皮、桂枝含揮發(fā)性成分，并與功能主治相關(guān)。陳皮來源于蕓香科植物橘（CitrusreticulateBlanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮。陳皮揮發(fā)油具有抑制平滑肌運動功能1材料和方法1.1克氏原螯蝦的顯微研究DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪儀器廠）；DZF-6050真空干燥箱（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；紫外可見分光光度計（日本島津公司）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯）；揮發(fā)油測定器（鄭州玻璃儀器廠）；LRH-250-Y培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）。感冒清熱顆粒揮發(fā)油（批號20140401）由我院制劑室提供，主要含有芳香族化合物和萜類化合物，如桂皮醛，檸檬烯等，該類化合物具有揮發(fā)性，對空氣、光、熱比較敏感，難溶于水，能完全溶解于無水乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油中；β-環(huán)糊精（批號20140906，廣東郁南糊精有限公司）；硅膠G薄層板（批號20130702，青島海洋化工有限公司）；自制蒸餾水；其余試劑均為市售分析純。1.2方法1.2.1揮發(fā)油的提取按處方比例稱取陳皮、桂枝，加水10倍量，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油4h，收集揮發(fā)油。結(jié)果藥材含揮發(fā)油0.7%。加大藥材量提取揮發(fā)油，備用。1.2.2研磨法和超聲法1）飽和溶液法按正交表精密稱取β-環(huán)糊精，置具塞三角瓶中，加入蒸餾水100ml，加熱至溶解，降至正交表需要溫度，恒溫攪拌；按正交試驗表各因素水平實驗，吸取揮發(fā)油溶液3ml，加等量無水乙醇稀釋至6ml，然后緩緩滴加入β-環(huán)糊精溶液中，分別攪拌30、60、90min。2）研磨法按正交表精密稱取β-環(huán)糊精，置燒杯中，按正交試驗表需要量加入蒸餾水，加入β-環(huán)糊精，混勻，置膠體磨開始研磨，按正交試驗表吸取揮發(fā)油溶液3ml，加等量無水乙醇稀釋至6ml，研磨時緩緩滴加入β-環(huán)糊精溶液中，分別研磨10、20、30min，用適量水沖洗膠體磨，沖洗液加入研磨液中；3）超聲法按正交表精密稱取β-環(huán)糊精，置具塞三角瓶中，按正交試驗表需要量加入蒸餾水，混勻，吸取揮發(fā)油溶液3ml，加等量無水乙醇稀釋至6ml，加入β-環(huán)糊精溶液中，分別超聲（350W、50kHz)30、45、60min。上述各個正交試驗樣品置冰箱中（10℃以下）放置72h，過濾，用乙醚適量洗去包合物表面黏附的揮發(fā)油，60℃干燥12h，得揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，稱重，計算收得率。1.2.3去水分/干制備揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥（用裝有無水硫酸鈉的小柱濾過，除去水分）。精密吸取2ml，測定重量，求得揮發(fā)油密度。揮發(fā)油密度=（油和容器重量-容器重量）÷2.0×100%=950.2mg/ml,RSD為0.36%。1.2.4揮發(fā)油包合率收得率收得率收得率收得率收得率收得率計算取干燥的揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，加蒸餾水200ml，照《中國藥典》2015年版揮發(fā)油包合率(%)=包合物中揮發(fā)油的含量/揮發(fā)油加入量×空白回收率×100%收得率(%)=包合物量(g)/(環(huán)糊精量+揮發(fā)油加入量×揮發(fā)油密度)×100%1.2.5包合率的確定揮發(fā)油包合率是評判包合效果的主要指標(biāo)，包合率越高，包合效果越好，因而作為揮發(fā)油包合工藝篩選的重要指標(biāo)，根據(jù)實際情況，包合率權(quán)重系數(shù)定為0.8綜合評分=包合率×80%+收得率×20%1.2.6空白回收率試驗空白回收率（%）的測定：精密吸取揮發(fā)油1.0ml，共3份，分別置于燒瓶中，加水200ml，照《中國藥典》2015年版測定揮發(fā)油的提出量（ml），計算空白回收率（%），本研究測得的空白回收率平均值為95%。1.2.7測定空白包合物溶液1）顯微成像法取飽和溶液法、研磨法、超聲法制備的揮發(fā)油包合物、空白包合物（按包合工藝制備），置于顯微鏡下觀察。2）薄層色譜法取上述按照不同工藝制備的揮發(fā)油b-環(huán)糊精包合物各0.5g，加無水乙醇10ml，超聲處理20min，濾過，濾液作為供試品溶液；同法制備空白包合物供試品溶液；另取揮發(fā)油各0.1ml，加無水乙醇10ml使溶解，作為對照品溶液。分別吸取上述溶液各5ml，點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（10∶1）為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰3）紫外分光光度法取上述按照不同工藝制備的包合物及空白β-環(huán)糊精各1g，加無水乙醇10ml，振搖后靜置1h，過濾，取濾液作為供試品溶液，取2.4.2項下的對照品溶液，作為對照品溶液。將上述溶液分別置紫外可見分光光度計上于200～400nm波長范圍內(nèi)掃描2結(jié)果2.1研磨法和超聲法飽和溶液法影響包合結(jié)果的主要因素為β-環(huán)糊精的用量和揮發(fā)油的比例、包結(jié)溫度和包結(jié)時間；研磨法的主要影響因素有β-環(huán)糊精的用量和揮發(fā)油的比例、加水量（為揮發(fā)油的倍數(shù)）和研磨時間；超聲法影響包結(jié)效果的主要因素為β-環(huán)糊精的用量和揮發(fā)油的比例、加水量（為揮發(fā)油的倍數(shù)）和超聲時間。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，影響揮發(fā)油包結(jié)的因素見表1。2.2超聲法和其他溶劑法包合工藝的收得率根據(jù)正交試驗表的各因素、水平值進行實驗，飽和溶液法、研磨法和超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%和74.3%；收得率分別為78.8%、73.3%和72.9%。飽和溶液法和研磨法的包合作用較好（表2和表3）；方差分析結(jié)果見表4。2.2.1影響揮發(fā)油包合效果的因素1）直觀分析根據(jù)極差大小，以包結(jié)率、收得率綜合評分為考察指標(biāo)，選擇A3B2C3（表3）。2）方差分析由直觀分析可知，影響揮發(fā)油包合效果的因素為包結(jié)溫度>b-環(huán)糊精和油的比例>包結(jié)時間。經(jīng)方差分析，b-環(huán)糊精和油的比例、包結(jié)溫度和包結(jié)時間均無顯著性影響。但b-環(huán)糊精和油的比例對包結(jié)率具有一定的影響，即：包結(jié)率隨著b-環(huán)糊精的量的增加而增大。因此選擇A3B3C3，即：環(huán)糊精與油的比例為9∶1,50℃，攪拌包結(jié)1.5h。2.2.2正交試驗結(jié)果分析1）直觀分析根據(jù)極差大小，選擇A3B3C1。2）方差分析由直觀分析可知，影響揮發(fā)油包結(jié)效果的因素為b-環(huán)糊精和油的比例>加水量>包結(jié)時間。經(jīng)方差分析，b-環(huán)糊精和油的比例具極顯著影響；加水量和包結(jié)時間均無顯著性影響。但加水量具有一定的趨勢。因此選擇A3B3C1，即：環(huán)糊精與油的比例為9∶1，加水100倍（揮發(fā)油量），研磨包結(jié)10min。2.2.3揮發(fā)油包結(jié)因素1)直觀分析根據(jù)極差大小，選擇A3B2C1。2)方差分析經(jīng)方差分析，超聲法包結(jié)揮發(fā)油，影響揮發(fā)油包結(jié)效果的因素為b-環(huán)糊精和油的比例對包合效果有顯著性影響，加水量和包結(jié)時間均無顯著性影響。因此選擇A3B2C3，即：環(huán)糊精與油的比例為9∶1，加水200倍（揮發(fā)油量），超聲包結(jié)45min。2.3不同收得率按照上述正交試驗結(jié)果，進行揮發(fā)油包合的驗證試驗，取三次實驗的平均值，結(jié)果飽和溶液法、研磨法、超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%、74.3%；收得率分別為78.8%、73.3%、72.9%。飽和溶液法、研磨法、超聲法的綜合評分結(jié)果分別為87.76(RSD=0.75）、87.54(RSD=1.05）、74.02(RSD=1.22），與正交試驗結(jié)果一致，表明上述揮發(fā)油包合工藝穩(wěn)定、可行，可以作為感冒清熱顆粒中揮發(fā)油包合的參考。2.4柴油：環(huán)糊精包劑的識別2.4.1白包合物的觀察取飽和溶液法、研磨法、超聲法制備的揮發(fā)油包合物、空白包合物（按包合工藝制備），置于顯微鏡下觀察，不同工藝的包合物為不透明塊狀，空白包合物呈規(guī)則的半透明狀。結(jié)果表明揮發(fā)油與β-環(huán)糊精確已形成了包合物（圖1）。2.4.2色度法樣品溶液1、2、3和對照品溶液4在相應(yīng)的位置出現(xiàn)了黃色斑點，且R2.4.3揮發(fā)油最大吸收波長將供試品溶液和對照品溶液分別置紫外可見分光光度計上于200～400nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果揮發(fā)油在290nm有最大吸收。而上述揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物及空白β-環(huán)糊精在此處無吸收峰。表明揮發(fā)油全部與β-環(huán)糊精形成了包合物（圖3）。2.5工藝收得率飽和溶液法、研磨法、超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%、74.3%，收得率分別為78.8%、73.3%、72.9%。飽和溶液法和研磨法的包合率和收得率均大于超聲法，所以兩種方法均適合于揮發(fā)油包合物的制備，但研磨法的制備時間較短，因此研磨法優(yōu)于飽和溶液法。2.6油擠出包組分的穩(wěn)定性研究2.6.1物理混合物的穩(wěn)定性分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發(fā)油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于4500lx光照下照射10d，分別于第0、5和10天取樣測定，結(jié)果表明，物理混合物在第5天和第10天的揮發(fā)油相對含量下降明顯，包合物的揮發(fā)油相對含量下降較少，后者具有較好的光穩(wěn)定性，在強光照射下不易分解。2.6.2合物及其密封液的制備分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發(fā)油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于60℃高溫下放置10d，分別于第0、5和10天取樣測定，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，包合物的揮發(fā)油相對含量呈下降的趨勢，但與物理混合物相比，后者的揮發(fā)油相對含量下降更為明顯，可見，揮發(fā)油包合物的熱穩(wěn)定性優(yōu)于物理混合物，在高溫條件下分解較緩慢。2.6.3高濕條件對包合物穩(wěn)定性的影響分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發(fā)油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于75%高濕條件下放置10d，分別于第0、5和10天取樣測定，結(jié)果表明，包合物受高濕條件的影響比較小，表現(xiàn)為揮發(fā)油的相對含量下降少，而物理混合物的揮發(fā)油相對含量明顯下降，說明了包合物在高濕條件下的穩(wěn)定性高于混合物（表5）。3膠體磨研磨法與超聲法包合揮發(fā)油本實驗采用的飽和溶液方法，首先在一定的溫度情況下環(huán)糊精形成飽和溶液后冷卻至50℃再滴入揮發(fā)油的乙醇溶液，使環(huán)糊精分子的中空結(jié)構(gòu)與揮發(fā)油充分接觸，因此包合時間短，所選擇的溫度較低也能減少揮發(fā)油的損失，包合率和收得率高于文獻(xiàn)報道對于研磨法制備包合揮發(fā)油，由于研磨過程中產(chǎn)生熱量容易使包合體溫度升高，從而加大揮發(fā)油易逸失的速度，因此利用膠體磨研磨包合時，利用水冷卻膠體磨，使包合體的溫度保持在較低水平，與文獻(xiàn)比較研磨時間較短并且具有較高的包合率超聲法包合實驗時，若用飽和溶液超聲，待冷卻后容易形成環(huán)糊精結(jié)晶析出，同時溶液表面有明顯的油滴，說明沒有包結(jié)完全，因此選用常溫包結(jié)。超聲包合時間與超聲儀的功率有關(guān)，功率越大，揮發(fā)油吸收能量分散成小微粒的時間越短。超聲法包合揮發(fā)