高效液相色譜法測定大鼠血漿中總槲皮素濃度及其藥動學(xué)研究

黃酮類化合物，化學(xué)名稱為3、3'、4'、5-7-黃酮，具有多種生物學(xué)活性和高療效。槲皮素存在于多種植物的花、葉和果實(shí)中,具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降壓、免疫調(diào)節(jié)及心血管保護(hù)等作用有93.3%的槲皮素經(jīng)口服后,在被腸道吸收的同時(shí)即被代謝,代謝部位主要是小腸,生成甲基化、葡糖醛酸化、硫酸化等7種Ⅱ相代謝產(chǎn)物。研究表明,槲皮素被人體吸收代謝后,最終以槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸、異鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3’-O-硫酸鹽等結(jié)合形式而存在1材料表面1.1色譜線的測定島津LC-20ATProminence高效液相色譜儀(配備LC-20AT輸液泵,SPD-M20APDA檢測器,SIL-20A自動進(jìn)樣器,LGC-1025M柱溫箱,CBM-20Alite系統(tǒng)控制器及LC-solution色譜工作站);AUW-220D電子分析天平(日本島津公司);SORVALLLegendMICRO21R型高速低溫冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司);Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。1.2阿魏酸對照品槲皮素對照品(批號10081-201408,純度99.1%),中國食品藥品檢定研究院;阿魏酸對照品(批號110773-201313,純度99.6%),中國食品藥品檢定所;β-葡萄糖醛酸酶(批號SLBG9373V,來自羅曼蝸牛,H-3型,純度≥90000U·mL1.3實(shí)驗(yàn)動物中心SD大鼠,SPF級,雄性,體質(zhì)量200~220g,購自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號為SCXK(鄂)2010-0009。2方法和結(jié)果2.1溶液制備2.1.1內(nèi)標(biāo)溶液精密稱取阿魏酸對照品10.73mg,置于50mL量瓶中,乙腈溶解并定容至刻度,得213.74μg·mL2.1.2對照溶液精密稱取槲皮素對照品10.16mg,置于100mL量瓶中,乙腈溶解并定容至刻度,得100.69μg·mL2.1.3超純水溶液制備稱定乙酸銨3.854g,維生素C0.20g,用超純水溶液轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中定容,乙酸調(diào)至pH5.0,得0.5mol·L2.2%磷酸溶液色譜柱:InertsilODS-SP柱(150mm×4.6mm,5μm),GLSciences;流動相:乙腈-0.2%磷酸水溶液(30∶70);流速:1.0mL·min2.3酶工作液制備精密吸取血漿樣品100μL至1.5mLEP管中,加入酶工作液20μL,渦旋30s,于37℃水浴1h,加入2.5mol·L2.4理論與實(shí)踐的確認(rèn)2.4.1空白血漿色譜圖分別取來自6只未給予任何藥物的雄性SD大鼠的空白血漿100μL,用等體積乙腈替代內(nèi)標(biāo)工作液,按“2.3”項(xiàng)下操作,得空白血漿色譜圖(圖1A);并取以上6只大鼠的空白血漿90μL,加入1.05μg·mL2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限lloq2.4.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液精密吸取空白血漿90μL,加入10μL“2.1.2”項(xiàng)下的各質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成相當(dāng)于槲皮素濃度為0.157,1.259,8.056μg·mL2.4.4峰面積a的確定按“2.3”項(xiàng)下處理低、中、高3個(gè)濃度的QC血漿樣品,每個(gè)濃度5個(gè)樣品進(jìn)行分析,獲得相應(yīng)峰面積(A);另取空白血漿按“2.3”項(xiàng)下處理,再加入低、中、高3個(gè)濃度的QC溶液及內(nèi)標(biāo)溶液,進(jìn)樣分析,獲得相應(yīng)峰面積(B),以(A/B)計(jì)算血漿中槲皮素的提取回收率,結(jié)果見表2。2.4.5樣品的穩(wěn)定性研究按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制含槲皮素濃度為0.157,1.259,8.056μg·mL2.4.6溶液穩(wěn)定性配制質(zhì)量濃度為10mg·L2.5組藥前配合物及單次灌服槲皮素以下簡稱槲皮素8只SD雄性大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,給藥前禁食不禁水12h,于稱重后單次灌服槲皮素(50mg·kg3血漿樣本的提取槲皮素經(jīng)口服攝入后,在通過小腸的過程中或被結(jié)腸內(nèi)活性細(xì)菌迅速水解為槲皮素糖苷配基。接著這些糖苷配基在Ⅱ相代謝酶如UDP葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)和硫酸基轉(zhuǎn)移(sulfotransferases,SULTs)的作用下,被代謝為葡萄糖醛酸化和硫酸化衍生物本研究在血漿樣本的處理中,考察了蛋白沉淀和液液萃取兩種方法。蛋白沉淀法雖然操作簡便,但進(jìn)行處理時(shí)需要的全血樣品量較大,而同一只大鼠一天內(nèi)要采十幾個(gè)點(diǎn),為滿足蛋白沉淀法處理全血樣品所需的樣本量,大鼠很容易處于失血狀態(tài),從而影響藥動學(xué)結(jié)果;并且在操作過程中發(fā)現(xiàn),蛋白沉淀法的提取效率不高,故本研究選擇采用液液萃取法來處理血漿樣本,并分別考察了乙醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚作為提取溶劑,因乙酸乙酯提取效率高、干擾少、安全經(jīng)濟(jì),最終選擇乙酸乙酯。在內(nèi)標(biāo)的選擇上,先考察了測定槲皮素的常用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)山萘酚,結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)不穩(wěn)定,無法對槲皮素準(zhǔn)確定量。最后選定阿魏酸作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),發(fā)現(xiàn)兩者峰形、分離度均較好,并且重復(fù)性好,因此選擇阿魏酸作為測定槲皮素的內(nèi)標(biāo)。本研究對大鼠灌胃給藥后的藥動學(xué)結(jié)果顯示槲皮素在SD大鼠體內(nèi)的半衰期在6h左右,達(dá)峰時(shí)間在8h左右。在一篇用高效液相色譜法測定血漿中游離槲皮素的藥動學(xué)報(bào)告中,在給予同本研究相