引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,Alignment軟件看看結(jié)果。

2.產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（自由能小于58.61KJ/mol）。

3.引物長(zhǎng)度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。

4.G+C含量在40%~60%之間，45-55％最佳。

5.堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻。

6.引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

7.引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

8.引物5′端可以修飾。

9.3′端不可修飾，而且要避開AT,GCrich的區(qū)域，避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個(gè)）。

10.引物3′端要避開密碼子的第3位。

11.引物整體設(shè)計(jì)自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。

可用oligo6軟件進(jìn)行比對(duì)看結(jié)果的情況。

12.做熒光定量產(chǎn)物長(zhǎng)度80-150bp最好，最長(zhǎng)是300bp.

13.引物設(shè)計(jì)避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。

14.引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于70％或者有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。

15.查看有無(wú)假基因的存在。假基因就是無(wú)功能的DNA序列，與需要擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度相似。

16.TM值在58-62度之間。

17.引物設(shè)計(jì)的軟件Primer5.0有專門針對(duì)熒光的。設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。引物分析軟件將試圖通過(guò)使用每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在這兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡。設(shè)計(jì)引用有一些需要注意的基本原理：①引物長(zhǎng)度

一般引物長(zhǎng)度為18~30堿基?？偟恼f(shuō)來(lái)，決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。有以下公式可以用于粗略計(jì)算引物的退火溫度。

在引物長(zhǎng)度小于20bp時(shí)：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長(zhǎng)度大于20bp時(shí)：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對(duì)退火溫度進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算原理會(huì)各有不同，因此有時(shí)計(jì)算出的數(shù)值可能會(huì)有少量差距。為了優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保退火溫度不低于54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。

總的說(shuō)來(lái)，每增加一個(gè)核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。引物長(zhǎng)度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于熵的原因，引物越長(zhǎng)，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。

②GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。

③退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，是DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差4℃～6℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。

④避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域

選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。

⑤與靶DNA的錯(cuò)配

當(dāng)被擴(kuò)增的靶DNA序列較大的時(shí)候，一個(gè)引物就有可能與靶DNA的多個(gè)地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個(gè)條帶出現(xiàn)。這個(gè)時(shí)候有必要先使用BLAST軟件進(jìn)行檢測(cè)，網(wǎng)址：/BLAST/。選擇Aligntwosequences(bl2seq)，如下圖。

添加酶切位點(diǎn)是將PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆使用得最多的手段。一般酶切位點(diǎn)是六個(gè)堿基，另外在酶切位點(diǎn)的5’端還需要加2～3個(gè)保護(hù)堿基。但是不同的酶需要的保護(hù)堿基數(shù)目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保護(hù)堿基，EcoRⅤ需要1個(gè)，NotⅠ需要2個(gè)，HindⅢ3個(gè)。其中，在原核表達(dá)設(shè)計(jì)引物時(shí)還有一些小技巧，大家可以參考：《原核表達(dá)之實(shí)驗(yàn)前的分析》。里面一些規(guī)則是所有表達(dá)都通用的。

有一種做法是在進(jìn)行PCR反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行酶切，這樣就需要注意一些內(nèi)切酶在PCR反應(yīng)中的酶切反應(yīng)率，見附錄。不過(guò)這種方法雖然方便但并不推薦。有時(shí)候，就是把PCR產(chǎn)物回收后酶切再與載體連接效果都不盡理想，同步進(jìn)行會(huì)使出現(xiàn)問(wèn)題的原因變得更加復(fù)雜。一旦出現(xiàn)問(wèn)題，分析起來(lái)更麻煩。

bLIC添加尾巴

LIC的全稱是Ligation-Independentcloning，它是Navogen公司專門為其部分的pET載體而發(fā)明的一種克隆方法。用LIC法制備的pET載體有不互補(bǔ)的12–15堿基單鏈粘端，與目的插入片段上相應(yīng)粘端互補(bǔ)。擴(kuò)增目的插入片段的引物5'序列要與LIC載體互補(bǔ)。T4DNA聚合酶的3'→5'外切活性經(jīng)短時(shí)間即可在插入片段上形成單鏈粘端。由于只能由制備好的插入片段和載體互相退火形成產(chǎn)物，這種方法非?？焖俑咝В覟槎ㄏ蚩寺?。

c定向TA克隆添加尾巴

在T載體剛出的時(shí)候大家都拍手稱贊，真是方便，哪個(gè)小子腦子這么聰明想出來(lái)的。但是后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)TA克隆無(wú)法將片段定向克隆到載體中，所以后來(lái)Invitrogen推出了可以定向克隆的載體，它的一端含有四個(gè)突出的堿基GTGG。因此在PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)也要相應(yīng)的加上與之互補(bǔ)的序列，這樣片段就可以“有方向”了。

dIn-Fusion克隆方法

這項(xiàng)技術(shù)是Clontech還屬于BD的時(shí)候推出的。此技術(shù)就其步驟來(lái)說(shuō)是及其方便的，不需連接酶，不需長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)。只要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候引入一段線性化載體兩端的序列，然后將PCR產(chǎn)物和線性化的載體加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室溫下放置半個(gè)小時(shí)就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化了。這種方法特別適合大批量的轉(zhuǎn)化。如果要加入額外的堿基總是或多或少會(huì)影響到整個(gè)PCR反應(yīng)，比如在加入NotⅠ的酶切位點(diǎn)后整個(gè)引物的退火溫度就會(huì)直線上升（它