培養(yǎng)基質(zhì)量保證與質(zhì)量控制培養(yǎng)基制備指南(SN/T1538)簡介李衛(wèi)華山西出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心第一頁，共四十一頁。微生物檢測的定義在特定的環(huán)境下（無菌），采用適當(dāng)?shù)姆椒▽悠分心繕?biāo)微生物進(jìn)行增殖和培養(yǎng)，并對經(jīng)放大后的目標(biāo)微生物進(jìn)行感官、生理、生化等方面的特性分析和判定，以確定樣品中目標(biāo)微生物的量和/或質(zhì)的特性的過程。第二頁，共四十一頁。微生物檢測涉及的要素檢測人員檢測經(jīng)驗和判斷能力檢測設(shè)備保證目標(biāo)菌種的生長的外部環(huán)境菌種試劑保證目標(biāo)菌種生長的內(nèi)部環(huán)境檢測方法選擇適宜目標(biāo)菌種檢測的方法測試環(huán)境保證操作過程不受外界干擾（保護(hù)樣品和人員）第三頁，共四十一頁。培養(yǎng)基的質(zhì)量保證與質(zhì)量控制質(zhì)量保證qualityassurance為使人們能確信某個產(chǎn)品(這里只培養(yǎng)基)能滿足規(guī)定的質(zhì)量要求所必須執(zhí)行的有計劃的和系統(tǒng)的活動提出質(zhì)量要求并制定系統(tǒng)的質(zhì)量控制計劃質(zhì)量控制qualitycontrol

為達(dá)到質(zhì)量要求所采取的操作技術(shù)和活動為達(dá)到質(zhì)量要求所采取的具體的技術(shù)操作第四頁，共四十一頁。培養(yǎng)基制備指南：SN/T1538SN/T1538.1-2005(2005年7月1日實施)第1部分:實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則提出要求并制定系統(tǒng)的控制計劃屬于質(zhì)量保證的范圍SN/T1538.2-2007(待發(fā)布)第2部分:培養(yǎng)基性能測試實用指南為保證提出的質(zhì)量要求所需要采取的技術(shù)操作屬于質(zhì)量控制的內(nèi)容第五頁，共四十一頁。標(biāo)準(zhǔn)制定情況簡介SN/T1538.1修改采用了ISO/TS11133-1：2000（E）(2000年6月1日發(fā)布)SN/T1538.1修改采用了ISO/TS11133-2：2003（E）(2003年12月25日發(fā)布)第六頁，共四十一頁。本標(biāo)準(zhǔn)的作用SN/T1538為培養(yǎng)基質(zhì)量保證和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系，有利于對培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)化管理，提高實驗室檢測質(zhì)量：第1部分為質(zhì)量保證和培養(yǎng)基質(zhì)量基本要求第2部分為質(zhì)量控制技術(shù)為CNAS合格評定的微生物實驗室認(rèn)證工作提供參考依據(jù)第七頁，共四十一頁。重點講解內(nèi)容相關(guān)術(shù)語主要質(zhì)量保證要求質(zhì)量控制方法質(zhì)控菌株第八頁，共四十一頁。培養(yǎng)基液體、半固體或固體形式的，含天然或合成成分，用于保證微生物繁殖或保持其活力的物質(zhì)第九頁，共四十一頁。培養(yǎng)基類型各別成分培養(yǎng)基

Culturemediumpreparedfromindividualcomponents實驗室用不同的化學(xué)和/或生物試劑按照一定的配方、比例配置而成的培養(yǎng)基即用型培養(yǎng)基

ready-to-usemedium以即用形式置于容器中(例如：平皿、試管或其它容器)供應(yīng)的培養(yǎng)基。

脫水合成培養(yǎng)基

culturemediumpreparedfromcommerciallydehydratedformulation.不立即使用的干粉形式的(如：粉末、小顆粒、凍干等形式)培養(yǎng)基。第十頁，共四十一頁。標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容購置驗收要求(CNAS-CL01：4.6.2)生產(chǎn)企業(yè)提供資料實驗室外觀檢查記錄儲存、使用、棄置要求（CL11：5.9)成品的質(zhì)量控制(概述第2部分.重點為菌株)物理指標(biāo):培養(yǎng)基外觀微生物指標(biāo):重點提到對測試菌株的要求SN/T1538.1常規(guī)質(zhì)量控制要求物理指標(biāo):外觀控制微生物指標(biāo):污染;生長率;選擇性;特異性(CNAS-CL01:4.6.2;CNAS/CL11：5.9)性能測試方法舉例對質(zhì)量控制要求的補充說明和詳細(xì)實例SN/T1538.2第十一頁，共四十一頁。購置驗收要求生產(chǎn)企業(yè)提供材料：產(chǎn)品標(biāo)簽：產(chǎn)品名稱、編號批號使用前的pH必要的安全/危害數(shù)據(jù)有效期技術(shù)數(shù)據(jù)清單質(zhì)控證書性能評價所用測試菌株實驗室驗收：產(chǎn)品標(biāo)簽：名稱和批號有效期接收日期包裝及其完整性SN/T1538.1-2005中4.1;對應(yīng)CNAS/CL014.6.2內(nèi)容,通常要記錄(采購服務(wù)和供給)第十二頁，共四十一頁。儲存要求例行常規(guī)檢查內(nèi)容:容器密閉性復(fù)查首次開封日期內(nèi)容物的感官檢查

使用前檢查(即用型培養(yǎng)基):顏色是否發(fā)生變化?是否蒸發(fā)/脫水?是否有微生物生長?注:SN/T1538.1:2005中4.2;對應(yīng)CNAS/CL01:4.6.2內(nèi)容,可不做記錄第十三頁，共四十一頁。實驗室自制和使用要求培養(yǎng)基用水稱量和復(fù)水溶解和分裝pH測定滅菌監(jiān)測瓊脂培養(yǎng)基融化培養(yǎng)基脫氣添加成分制備和加入平板的制備和儲存培養(yǎng)注:SN/T1538.1-2005中4.3-4.4內(nèi)容,對應(yīng)CNAS/CL11:5.9部分內(nèi)容,紅色部分通常需做記錄第十四頁，共四十一頁。培養(yǎng)基的棄置要求所有污染和未使用的培養(yǎng)基的棄置必需采用安全的方式，并且要符合相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定。注:SN/T1538.1-2005中4.5內(nèi)容,應(yīng)符合CNAS/CL01:5.3.5(廢棄物處理程序)要求第十五頁，共四十一頁。質(zhì)量控制基本要求對培養(yǎng)基的要求分裝數(shù)量外觀、色澤和均一性瓊脂凝膠的硬度水份含量pH緩沖能力微生物污染(即用培養(yǎng)基)對基礎(chǔ)成分的要求對不穩(wěn)定的生物成分，使用時可根據(jù)情況調(diào)整用量。注:SN/T1538.2中對制造商的要求第十六頁，共四十一頁。微生物學(xué)要求微生物污染生長特性生長率選擇性生理生化特性選擇性和特異性抗菌實驗特性

紅色部分為對培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量控制的主要內(nèi)容第十七頁，共四十一頁。生長率(定量測試方法)PR=NS/NONS：待測培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)。N0：參考培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù)，應(yīng)≥100cfu要求：非選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長率最低應(yīng)為0.7，該類培養(yǎng)基應(yīng)易于目標(biāo)菌生長；選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長率最低應(yīng)為0.1

第十八頁，共四十一頁。選擇性(定量測試方法)SF=DO

–

DSD0：能在參考培養(yǎng)基上生長至少10個菌落的最高稀釋度DS：能在測試培養(yǎng)基上顯示生長的最高稀釋度

非目標(biāo)菌在選擇性培養(yǎng)基上的SF至少為2半定量和定量法中，非目標(biāo)菌應(yīng)部分或全部被抑制

第十九頁，共四十一頁。培養(yǎng)基測試方法定量測試方法半定量測試方法定性測試方法第二十頁，共四十一頁。幾種方法的使用原則通常使用半定量或定性測試方法就能滿足實驗室對培養(yǎng)基性能測試的要求評價新的培養(yǎng)基或新的供應(yīng)商的產(chǎn)品時，應(yīng)采用定量測試方法采用定量方法時，必須使用參考培養(yǎng)基進(jìn)行對照；采用半定量和定性方法時，使用參考有助于結(jié)果解釋。參考培養(yǎng)基必須是從近期批次中選出的已知質(zhì)量良好的培養(yǎng)基。第二十一頁，共四十一頁。介紹幾種常用的質(zhì)控方法Miles-Misra法(定量方法)改進(jìn)的平板劃線法(半定量方法)平板接種觀察法(定性方法)上述均為固體培養(yǎng)基測試方法,液體培養(yǎng)基定量和半定量測試方法也要通過固體培養(yǎng)基菌落計數(shù)技術(shù)才能得到結(jié)果。第二十二頁，共四十一頁。改良Miles-Misra法第二十三頁，共四十一頁。操作方法測試菌株過夜培養(yǎng)物10倍稀釋測試平板和參照平板劃分為4個區(qū)域并標(biāo)記從最高稀釋度開始

，分別滴一滴稀釋液于試驗平板和對照平板標(biāo)記好的區(qū)域?qū)⑾♂屢和繚M整個1/4區(qū)域，37°C培養(yǎng)18hr。對易計數(shù)的區(qū)域計數(shù)，按公式計算結(jié)果第二十四頁，共四十一頁。方法舉例測試培養(yǎng)基在10-5稀釋度上有30個菌落參照培養(yǎng)基在10-5稀釋度上有40個菌落通過公式計算：

PR=10-5×30/10-5×40=0.75注：在幾種固體計數(shù)方法中，Miles-misra方法和螺旋平板涂布法效果較好。第二十五頁，共四十一頁。改進(jìn)的劃線法接種法模式圖第二十六頁，共四十一頁。計算計算生長指數(shù)G：每條有菌落生長的劃線記作1分，每個僅一半的線有菌落生長記作0.5分沒有菌落生長或生長量少于劃線的一半，則記作0如：菌落在A區(qū)和B區(qū)全部生長，而在C區(qū)有一半線生長則G

為10第二十七頁，共四十一頁。目標(biāo)菌在培養(yǎng)基上應(yīng)呈現(xiàn)典型的生長，而非目標(biāo)菌的生長應(yīng)部分或完全被抑制

目標(biāo)菌的生長指標(biāo)G大于6時，培養(yǎng)基可接受結(jié)果解釋第二十八頁，共四十一頁。定性測試方法

用3mm接種環(huán)取測試菌培養(yǎng)物，在測試培養(yǎng)基表面劃平行直線?？赏瑫r在一個平板上接種多個菌株，但劃線不能交叉按標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的培養(yǎng)時間和溫度對接種后的平板進(jìn)行培養(yǎng)

第二十九頁，共四十一頁。結(jié)果解釋培養(yǎng)后按以下方法計分：0表示無生長1表示微弱生長2表示生長良好目標(biāo)菌得分應(yīng)為2，并有典型的菌落外觀、大小和形態(tài)非目標(biāo)菌的生長應(yīng)部分或全部被抑制

第三十頁，共四十一頁。質(zhì)控菌株要求標(biāo)準(zhǔn)菌株：來自國際/國家菌種保藏中心(本標(biāo)準(zhǔn)要求為ATCC菌株)或經(jīng)ISO9002認(rèn)證的經(jīng)銷商提供的菌株(有資質(zhì))制備儲備菌株和工作菌株時一次制備多份，每株菌原則上不能重復(fù)使用通常工作菌株不能再傳代，但處理得當(dāng)可再次使用第三十一頁，共四十一頁。標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株(Referencestock)標(biāo)準(zhǔn)菌株在實驗室經(jīng)過一次傳代獲得的一組完全相同的菌株傳代菌株應(yīng)當(dāng)完全具備標(biāo)準(zhǔn)菌株的所有性狀傳代時要保證一定的量(減少傳代次數(shù))每株菌株盡量避免多次使用采用不同的保存方法保存期限不同如凍干法,液氮法,穿刺法,液體石蠟法,斜面保存法等(見后)第三十二頁，共四十一頁。菌種保藏方法液氮保存法低溫保存法液體石蠟保存法第三十三頁，共四十一頁。液氮保存法保存制備細(xì)胞懸液，甘油或二甲亞砜作保護(hù)劑分裝無菌安瓿瓶，每管0.2ml預(yù)凍至-40℃（控制溫度下降速率為1℃／min）放入液氮生物貯存罐中氣相保存恢復(fù)直接浸入38℃水浴中解凍5～10min轉(zhuǎn)接于適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)注意：大多數(shù)屬種適于慢速凍結(jié)和快速解凍第三十四頁，共四十一頁。適用菌種病毒支原體各類細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌藍(lán)藻動物細(xì)胞

第三十五頁，共四十一頁。液體石蠟覆蓋保存法傳代保存的變相方法能夠適當(dāng)?shù)匮娱L保存時間優(yōu)質(zhì)石蠟121℃高壓滅菌2小時，160℃干燥箱中滅菌1—2小時，放冷備用液體石蠟的深度以1cm左右保存期通常6個月至一年第三十六頁，共四十一頁。適用菌種霉菌、酵母菌、放線菌、部分細(xì)菌。如：大腸桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌等需氧性細(xì)菌不能用于低溫冷凍保存的微生物（如孢子形成能力極差的絲狀菌）不適于用菌種：固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、沙門氏菌，絲狀菌中的毛霉、根霉菌等第三十七頁，共四十一頁。甘油低溫保藏法保藏方法：菌種懸浮在10％(體積分?jǐn)?shù))甘油蒸餾水中。置于低溫(-70)保藏。注意事項：所要保藏的菌種，最好先培養(yǎng)至對數(shù)期；使用液體培養(yǎng)基時，可直接加到已滅過菌的甘油中，并使甘油的終濃度在l0％～30％左右。為避免反復(fù)凍溶，可分裝于小離心管中，置低溫保藏。適用菌種：基因工程、絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌第三十八頁，共四十一頁。方法舉例SN/T1538.1-2005SN/T1538.2-2007第三十九頁，共四十一頁。謝謝大家李衛(wèi)華山西出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心太原市漪汾街8號郵編030024Email:電話(傳真):手機(jī):第四十頁，共四十一頁。內(nèi)容總結(jié)培養(yǎng)基質(zhì)量保證與質(zhì)量控制。SN/T1538.1-2005(2005年7月1日實施)。SN/T1538.