酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)在

抗生素殘留檢測中應用

酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第1頁

藥品殘留快速檢測試劑盒

試驗操作指導酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第2頁1、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）介紹1.1、基本概念：抗原、抗體、抗原抗體特征1.2、ELISA方法介紹：1.3、ELISA方法原理1.4、ELISA方法分類酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第3頁2、ELISA試劑組成2.1、ELISA試劑盒組成2.1.1、已包被抗原或抗體固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）；

2.1.2、酶標識抗原或抗體（酶標識物）；

2.1.3、酶底物；

2.1.4、參考標準品（定量測定）；

2.1.5、酶標識物及樣本稀釋液；

2.1.6、洗滌液；

2.1.7、酶反應終止液。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第4頁2.2、各ELISA組成試劑作用2.2.1、固相載體2.2.2、免疫吸附劑2.2.3、酶標識物2.2.4、酶底物2.2.5、洗滌液2.2.6、反應終止液

2.2.7、參考標準品酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第5頁3、ELISA試驗過程3.1、試劑準備

3.2、加樣

3.3、保溫

3.4、洗滌

3.5、顯色和比色酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第6頁4、ELISA試驗質量控制4.1、分析前質控

4.1.1、人員培訓

4.1.2、儀器質控4.1.3、標本采集及處理過程質控4.2、分析中質控酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第7頁4.3、幾個慣用質控方法

4.3.1、灰區(qū)概念

4.3.2、外添加回收率試驗方法4.3.3、確證陽性樣品質控4.3.4、室間質評方法：發(fā)質控物進行調查酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第8頁5、膠體金試紙5.1、免疫層析法介紹及特點5.2、免疫層析法結構及原理二、培訓內容（操作部分）6、操作過程演示7、計算軟件應用說明酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第9頁1、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）介紹1.1、基本概念：抗原：抗原是指進入人或動物機體后，可刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，從而引發(fā)動物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應物質?？贵w：是由抗原刺激動物免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌能和對應抗原發(fā)生特異性結合免疫球蛋白?？乖贵w基本特征：a、反應特異性；b、反應等百分比性1.2、ELISA方法介紹：ELISA屬于標識免疫學技術一個，1971年由荷蘭和瑞典學者提出，因為其操作過程簡單易行并能夠定量，從而使其在食品安全和衛(wèi)生檢測中得到了廣泛應用。當前市場上有各種基于ELISA方法開發(fā)用于食品中抗生素檢測試劑盒產(chǎn)品。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第10頁1.3、ELISA方法原理基于抗原抗體反應特異性和等百分比性，以96孔聚苯乙烯塑料微孔板（又稱酶標板）為載體，在適當技術條件下使抗原或抗體包被（吸附）在酶標板微孔內壁上成為所謂包被（固相）抗體或抗原，沒有被吸附（游離）抗原或抗體經(jīng)過洗滌除去，然后直接加入酶標識抗體或抗原（或先加入適當抗體或抗原與包被抗原或抗體反應后，再加入對應酶標識抗體或抗原），形成酶標識抗原—抗體復合物固定在微孔內，沒有吸附酶標識物洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物上酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色底物。在一定條件下，復合物上酶量（也反應了固定化抗原抗體復合物量）和酶產(chǎn)物展現(xiàn)色澤成正比，所以能夠用分光光度計進行測定，從而計算出參加反應抗原和抗體量。這就是ELISA原理。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第11頁1.4、ELISA方法分類ELISA能夠分為直接法、間接法和夾心法等幾個。直接法：直接法是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上抗體或抗原結合形成酶標抗原—抗體復合物，加入酶反應底物，測定產(chǎn)物吸光值，計算出包被在酶標上抗體或抗原量。見圖2-17（a）間接法：是將酶標識在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板抗原結合形成復合后，再以酶標二抗和復合物結合，經(jīng)過測定酶反應產(chǎn)物顏色能夠（間接）反應一抗和抗原結合情況，進而計算出抗原或抗體量。見圖2-17（b）夾心法：是先將未標識抗體包被在酶標板上，用于捕捉抗原，在用酶標抗體與抗原反應形成抗體-抗原-酶標抗體復合物；也能夠象間接法一樣應用酶標二抗和抗體-抗原-抗體復合物結合，形成抗體-抗原-抗體-酶標二抗復合物，見圖2-17（C）。前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第12頁ELISA原理及分類（圖2-17）酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第13頁上述三種方法又能夠分為競爭法和非競爭法。因為我企業(yè)試劑盒產(chǎn)品絕大部分屬于直接法中競爭法。下面對直接法中酶標抗原競爭法作重點說明。在進行測定時首先將包被了抗體酶標板微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入系列標準品溶液和酶標識物；在測定孔中同時加入酶標識物和非酶標抗原（通常來自于待測樣品），酶標識物和樣品相互競爭包被抗體結合點，經(jīng)過溫浴后，沒有結合到包被抗體上酶標識物和樣品經(jīng)過洗滌去除。拍干后加入底物溶液，經(jīng)溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。其反應原理如（圖2-18）

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第14頁競爭法ELISA原理（圖2-18）如圖所表示.在進行測定時首先將包被了抗體酶標板微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入已知濃度系列標準品溶液和酶標識物；在測定孔中同時加入酶標識物和待檢樣本（抗原），酶標識物和樣品相互競爭包被抗體結合點，形成酶標識抗原—抗體復合物固定在微孔內，沒有吸附酶標識物經(jīng)過洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物上酶催化底物使其水解、氧化還原成為有色產(chǎn)物。當測定孔內樣本不含抗原時，固相上抗體將和酶標識物結合加入底物后呈色較深，當樣本含有抗原時，樣本中抗原和酶標識物共同競爭抗體結合位點，酶標抗原百分比越高，結合在固相抗體上酶標抗原就越多，酶標抗原百分比越低，結合在固相上抗體就越少，而在一定條件下，復合物上酶量（也反應了固定化抗原抗體復合物量）和酶產(chǎn)物展現(xiàn)色澤成正比，所以能夠用分光光度計進行測定，從而計算出參加反應抗原和抗體量，從而深入得知樣本中抗原多少。這就是競爭法ELISA原理。測定孔EEEEE酶標識物底物溶液對照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶標識物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第15頁競爭法ELISA原理簡述如圖所表示.在進行測定時首先將包被了抗體酶標板微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入已知濃度系列標準品溶液和酶標識物；在測定孔中同時加入酶標識物和待檢樣本（抗原），酶標識物和樣品相互競爭包被抗體結合點，形成酶標識抗原—抗體復合物固定在微孔內，沒有吸附酶標識物經(jīng)過洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物上酶催化底物使其水解、氧化還原成為有色產(chǎn)物。當測定孔內樣本不含抗原時，固相上抗體將和酶標識物結合加入底物后呈色較深，當樣本含有抗原時，樣本中抗原和酶標識物共同競爭抗體結合位點，酶標抗原百分比越高，結合在固相抗體上酶標抗原就越多，酶標抗原百分比越低，結合在固相上抗體就越少，而在一定條件下，復合物上酶量（也反應了固定化抗原抗體復合物量）和酶產(chǎn)物展現(xiàn)色澤成正比，所以能夠用分光光度計進行測定，從而計算出參加反應抗原和抗體量，從而深入得知樣本中抗原多少。這就是競爭法ELISA原理。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第16頁樣本濃度計算所取得每個濃度標準溶液或樣本吸光度值平均值（B）除以第一個標準（O標準）吸光度值（B。）再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值（%)=(B/BO)/100%

公式中B為樣本溶液平均吸光度值，B0為0PPb標準溶液平均吸光度值。以克倫特羅濃度半對數(shù)值為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖，（標準曲線如圖一）相對應每一個樣品中殘留克倫特羅濃度能夠從標準曲線上讀出，在實際計算中只需用酶標測出標準品和樣品吸光值，其它過程可經(jīng)過專用計算軟件完成。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第17頁2、ELISA試劑組成

2.1、完整ELISA試劑盒應包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）；

（2）酶標識抗原或抗體（酶標識物）；

（3）酶底物；

（4）系列參考標準品（定量測定）；

（5）酶標識物及樣本稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）反應終止液。

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酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第18頁2.2、ELISA試劑作用2.2.1、固相載體：固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參加化學反應。可作ELISA中載體材料很多，最慣用是聚苯乙烯。ELISA載體形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為慣用，專用于EILSA產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標準微量滴定板為8×1296孔式。2.2、免疫吸附劑：已包被抗原或抗體固相載體，是ELISA方法中關鍵試劑。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第19頁2.3、酶標識物：即酶標識抗原或抗體，是ELISA中最關鍵試劑。良好酶標識物應該是既保有酶催化活性，也保持了抗體（或抗原）免疫活性。酶標識物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當分子百分比，在酶標識物中應盡可能不含有或少含有游離（未結合）酶或游離抗體（或抗原）。另外酶標識物還要有良好穩(wěn)定性。在ELISA中，慣用酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第20頁2.4、酶底物2.4.1、HRP底物

HRP催化過氧化物氧化反應，最具代表性過氧化物為H2O2，其反應式以下：

DH2+H2O2D+H2O

上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2普通為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色產(chǎn)物，方便作比色測定。慣用供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)

OPD氧化后產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度

高，比色方便，是HRP結合物最慣用底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底

物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2普通分成二組分，OPD可制成一定量粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保留濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑工作濃度為0.02%H2O2應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。

酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第21頁TMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有沒有致癌性等優(yōu)點，所以在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。2.4.2

AP底物

AP為磷酸酯酶，普通采取對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色對硝基酚，在405nm波優(yōu)點有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。

AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物比色法。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第22頁2.5、洗滌液

洗滌液多為含非離子型洗滌劑中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質結合是疏水性，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質疏水基團借疏水鍵結合，從而減弱蛋白質與固相載體結合，并借助于親水基團和水分子結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中非離子型洗滌劑普通是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上抗原或抗體解吸附而減低試驗靈敏度。返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第23頁2.6酶反應終止液

慣用HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液最終體積而異，在板式

ELISA中普通采取2mol/L。2.7參考標準品

定量測定ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用參考標準品，應包含覆蓋可檢測范圍4-5個濃度，普通均配入含蛋白保護劑及防腐劑緩沖液中。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第24頁3、ELISA試驗過程3.1試劑準備

按試劑盒說明書要求準備試驗中需用試劑。ELISA試驗中應用蒸餾水或去離子水，。自配緩沖液PH應用pH計進行較正。從冰箱中取出試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中此次試驗不需用部分應及時放回冰箱保留。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第25頁3.2加樣

在ELISA試驗中普通有5次加樣步聚，即加標準品、加樣本、加酶標識物、加底物、加反應終止液。加樣時應將所加物加在LEISA板孔底部，防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加樣時普通用微量加樣器，按要求量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)

生交叉污染。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程快速完成。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第26頁3.3保溫

在ELISA中普通加標本和加酶標識物后會有一次抗原抗體反應。抗原抗體反應完

成需要有一定溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體結合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中標本，其中抗原并不是都有均等和固相抗結合機會，只有最貼近孔壁一層溶液中抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡過程，所以需經(jīng)擴散才能到達反應終點。在其后加入酶標識抗體與固相抗原結合也一樣如此。這就是為何ELISA反應總是需要一定時間溫育。

溫育常采取溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。為了便于操作當前絕大部分試劑盒均采取室溫進行溫育反應，操作時室溫應嚴格限制在要求范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但詳細操作時可依聽說明書要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育溫度和時間應按要求力爭準確。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第27頁3.4洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著試驗成敗。ELSIA就是靠洗滌來到達分離游離和結合酶標識物目標。經(jīng)過洗滌以去除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質吸附是普遍性，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附干擾物

質洗滌下來。能夠說在ELISA操作中，洗滌是最主要關鍵技術，應引發(fā)操作者高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

洗滌方式除一些ELISA儀器配有特殊自動洗滌儀外，手工操作主要為浸泡式，過程以下：

a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明要求）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。

酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第28頁3.5顯色和比色3.5.1、顯色

顯色是ELISA中最終一步溫育反應，此時酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物。反應

溫度和時間仍是影響顯色原因。在定量測定中，加入底物后反應溫度和時間應按要求力爭準確。底物顯色普通在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將到達顯色頂峰，再延長反應時間，可使本底值增高。底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。產(chǎn)物用各類酸性終止液終止后會使藍色轉變成黃色，此時可用特定波長（450nm）測讀吸光值。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第29頁3.5.2比色

比色前應先用潔凈吸水紙拭干板底附著液體，然后將板正確放入酶標比色儀比

色架中。

比色結果表示以往通用光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按要求用吸光度（absorbence，A），二者含義相同。通常表示方法是，將吸收波長寫于A字母右下

角，如TMB吸收波長為450nm，表示方法為"A450nm"或"OD450nm"。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第30頁3.6.3酶標比色儀

酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA結果吸光度光度計。針對固相載

體形式不一樣，有特制適合用于板、珠和小試管設計。許多試劑企業(yè)配套供給酶標儀。酶標儀主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)準確性、重復性、準確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良酶標儀讀數(shù)普通可準確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得A值為1.083，則該孔相對于空氣真實A值應為1.083±0.01（1.073~1.093），重復測定數(shù)次，其A值均應1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標儀可測范圍視各酶標儀性能而不一樣。酶標儀檢測范圍普通在0.000—3.000之間，甚至更高。超出可測上限A值常以"*"或"over"或其它符號表示。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。

酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第31頁測讀A值時，要選取產(chǎn)物敏感吸收峰，用單波長進行測讀。也可用雙波長進行測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板位置。比如TMB用450nm為W1，625nm為W2，最終測得A值為二者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可降低由容器上劃痕或指印等造成光干擾。

各種酶標儀性能有所不一樣，使用中應詳細閱讀使用說明書。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第32頁4.ELISA試驗質量控制

4.1、分析前質控

4.1.1、人員培訓

試驗人員操作技巧及熟練程度直接影響到檢驗結果，所以檢驗人員需經(jīng)過培訓，熟練掌握相關技術知識和操作關鍵點：

◎檢驗項目標基本原理（ELISA原理）；

◎熟悉檢測技巧，了解試驗關鍵步驟及操作關鍵點；

◎熟悉檢測試劑性能（包含試劑盒組成，包被片段及其組成）；

酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第33頁4.1.2、儀器質控

為使儀器保持最正確工作狀態(tài)應建立維護和校正儀器標準操作程序（SOP），所要控制儀器包含移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。

◎移液器：ELISA加樣量?。?-100ｕl），其準確性直接影響試驗結果，利用稱重法檢驗：吸收刻度指示量水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，普通應在±2%以內；

◎水浴箱：經(jīng)常檢驗水浴箱溫度計所表示溫度和水中（或溫箱內）實測溫度是否一致，允許有±1℃誤差；

◎洗板機：每個廠家設置洗板后殘留液有各自要求普通不超出2ul，人工扣板時，墊紙不濕，定時檢驗管孔是否堵塞；

◎酶標儀：經(jīng)常維護其光學部分，預防濾光片霉變，定時檢測校正，使其保持良好工作性能。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第34頁4.1.3、標本采集及處理過程質控取樣：確保取樣有代表性，即要遵照一定取樣方法又要確保一定取樣百分比（如：隨機多點取樣、四分法等）樣品選取過程中需要防止產(chǎn)生交叉污染。如：處理不一樣批次樣品時應更換使用工器具或對使用工具進行徹底清洗。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第35頁4.2、分析中質控

◎ELISA試驗結果受操作影響很大，每個步驟包含加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數(shù)均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA高靈敏，強特異優(yōu)點。

◎所以,應建立試驗項目標標準操作程序(SOP)。加樣

◎加樣應用微量移液器（加樣槍)按要求量加入微孔板底部防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣槍槍頭不要觸及微孔內壁。

◎每次加樣應更換吸嘴，做到一樣一吸頭，以免發(fā)生交叉污染。溫育

◎大多數(shù)試劑盒抗原抗體反應需要在室溫度下，經(jīng)過一定時間才能到達反應平衡點

◎ELISA邊緣效應是由溫育形成。所以溫育普通采取能

使反應液溫度快速到達平衡水浴法。一個放在水浴箱隔板上，另一個是放在溫箱濕盒里。水要浸至板條1/3處，不可將板條疊加放置。

酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第36頁洗滌

◎ELISA是靠洗滌來到達分離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標識物目標，同時洗滌也可將非特異吸附蛋白質干擾以及血球、細菌中酶干擾去除掉。

◎手工洗滌普通采取浸泡方法：1）甩去孔內反應液；

2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）；

3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；

4）甩去孔內液體，拍板，用紙吸干。

重復以上操作最少5次。注意各種試劑盒洗滌液盡可能不要混用。

◎洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時要設置一定浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，防止堵孔。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第37頁顯色HRP催化底物是一步呈色反應，一樣需要一定時間和溫度，一定要按照說明書要求時間溫度（普通為室溫°C，15-20分鐘）。到達要求反應時間后需要馬上終止。酶標儀判讀結果

顯色反應終止后應立刻比色（普通在30分鐘內有效）。

常見顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止所以必須盡快比色以免影響結果。

TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，參比波長為630nm。

使用雙波長優(yōu)點能夠消除反應板條上劃痕手印干擾。同時要注意反應孔底部應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，不然吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片。

返回酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第38頁4.3、幾個慣用質控方法

4.3.1、灰區(qū)概念

把定量分析正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復試驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內則匯報+（陽性）。

灰區(qū)設置方法為：C.O×（1±CV）CV為該試劑批內CV

(普通為5—10%）；酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第39頁4.3.2、外添加回收率試驗方法A、什么是外添加回收率外添加回收率是指向陰性樣中加入一定濃度標準溶液，使之到達某一確定濃度（稱為加標樣），然后將其與該陰性樣同時測定，進行對照試驗，以觀察加入標準品量能否定量回收，以回收率表示。B、怎樣添加標準品標準上我們提議使用較高濃度標準溶液進行外添加，下面以我企業(yè)試劑盒為例進行說明：假設使用4.05ppb標準品進行添加，普通魚肉檢測下限為0.1ppb，提議將魚肉添加到0.1ppb作為回收樣品進行檢測。所以假設需要添加Xml4.05ppb標準品于1克魚肉中，得到0.1ppb魚肉樣本。按公式(1)計算X值（1+X）0.1=4.05X……(1)則X即為所添加4.05PPb標準溶液體積。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第40頁C、怎樣計算回收率添加前陰性魚肉設為樣品A，添加后魚肉設為樣品B，將A和B同時進行檢測，其檢測結果分別為CA、CB，按公式(2)進行計算回收率回收率=（CB—CA）/0.1×100%……(2)D、外添加回收率意義。外添加回收率意義在于，經(jīng)過外添加一定已知濃度標準品，從而驗證試驗方法穩(wěn)定性和有效性。酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在第41頁4.3.3、用確證樣品質控選取與被測樣本性質靠近經(jīng)過確證樣本為質控樣本，在每次進行檢測時將該樣本同時進行檢測，經(jīng)過判斷該樣品檢出值與確證值之間變異度來判斷檢驗結果有效性。4.3.4、室間質評方法：發(fā)質控物進行調查這是國內外室間質評慣用形式。相關管理部門或相關行業(yè)檢驗協(xié)會采取定時發(fā)放質控物至各試驗室，各試驗室在要求日期進行檢驗，并將檢驗結果報至部管理中心。由管理中心進行統(tǒng)計分析，將評價結果寄回各試驗室。經(jīng)過評價，各試驗室了解本室工作質量，發(fā)覺差距，并設法改進，以不停提升檢驗質量。