第四章

根本培養(yǎng)技術(shù)

第四章

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內(nèi)容第一節(jié)玻璃器皿及塑料制品的清洗與消毒第二節(jié)培養(yǎng)操作的根本要領(lǐng)和要求第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的根本技術(shù)

內(nèi)容2第一節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料

制品的清洗與消毒第一節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料

制品的清洗與消毒3一、清洗目的：在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長有害物質(zhì)包括：微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿、膠塞、塑料制品一、清洗目的：41、玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟清洗后的玻璃器皿要求：干凈透明無油跡不能殘留任何物質(zhì)1、玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟5清洗：自來水洗，烘干泡酸自來水洗去離子水洗三蒸水洗烘干新瓶子均按該程序清洗，培養(yǎng)材料染菌的瓶子經(jīng)高壓滅菌后也按該程序清洗。酸液〔洗液〕：濃硫酸+重鉻酸鉀清洗：自來水洗，烘干泡酸自來水洗去離6浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉。浸泡：7新的初次使用的玻璃器皿先用自來水簡單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)培養(yǎng)瓶浸泡后還需要裝滿蒸餾水后上高壓??！新的初次使用的玻璃器皿培養(yǎng)瓶浸泡后還需要裝滿蒸餾水后上高壓！8再次使用的玻璃器皿：用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。原因：常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉。再次使用的玻璃器皿：9刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿外表附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會損害器皿外表光澤度刷洗：10浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中的過程注意：浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時配制、浸泡時應(yīng)注意平安，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露局部。

浸酸：11沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡。浸泡后的沖洗過程：需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，蒸餾水浸泡過夜，自來水沖洗5遍，一蒸水5遍，二蒸水3遍，培養(yǎng)瓶要求二蒸水也用流水，烤干備用。沖洗需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，蒸餾水浸泡過夜122、膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理.常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘〔以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)〕，自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用。2、膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水133、塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，翻開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。培養(yǎng)板、塑料離心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在烤箱中枯燥??！3、塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝14二、包裝：目的：以便消毒及儲存，防止落人灰塵及消毒后再次被污染。包裝紙〔盒〕外表用油性記號筆標(biāo)明物品名稱、消毒日期等！！二、包裝：15各種用品的包裝器皿的包裝分為半包裝和全包裝培養(yǎng)瓶兩個一組全包，包裝前蓋上螺旋蓋子。吸管在與膠頭相接端塞上棉花裝入吸管筒。青霉素小瓶倒扣在飯盒中，全包。濾器上下口半包裝再用報紙包，最后用布包好。大的容器如錐形瓶，加上棉塞后半包裝。槍頭、EP管裝在相應(yīng)的盒子中，全包。手術(shù)器械放在飯盒中，全包。離心管加蓋子后全包各種用品的包裝器皿的包裝分為半包裝和全包裝16三、消毒、滅菌防止培養(yǎng)物污染可通過消毒滅菌〔將已存在的微生物去除〕滅菌sterilization：應(yīng)用理化方法殺死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。消毒disinfection：應(yīng)用理化方法殺死微生物，只要求到達(dá)無傳染性的目的，不要求全部殺死。三、消毒、滅菌17無菌germfree：沒有活菌。防腐antisepsis：應(yīng)用理化方法防止和抑制微生物生長繁殖。抑菌〔bacteriostasis〕：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌生長繁殖。常用的抑菌劑為抗生素?zé)o菌germfree：沒有活菌。181、消毒滅菌的方法★物理方法:濕熱〔高壓蒸汽〕、干熱、紫外線。射線、過濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物?！锘瘜W(xué)方法:使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。

1、消毒滅菌的方法★物理方法:濕熱〔高壓蒸汽〕、干熱、紫192、消毒滅菌的本卷須知

★干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)展，需加溫到160℃，保持90－120min方能殺死芽孢。注意??！消毒完畢后不可馬上將烤箱門翻開，以免冷空氣突然進(jìn)人，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。2、消毒滅菌的本卷須知★干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)展，需加溫20★濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)展消毒。注意：1、不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。2、在加熱升壓之前，翻開排氣閥門，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出??！關(guān)閉排氣閥門，開場升壓，待到達(dá)所需要的壓力時，開場記錄時間，并控制壓力恒定。

★濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)展消毒。213、一般物品：布類、金屬器械、玻璃器皿等消毒的要求是15磅20min；常規(guī)使用液體：消毒15磅15min。4、橡膠和塑料用品：如濾器、EP管、離心管等高壓10磅15min。

3、一般物品：布類、金屬器械、玻璃器皿等消毒的要求是15磅22★紫外線消毒：主要用于實驗室房間里的空氣、操作臺外表及桌椅等消毒。時間為30分鐘－2小時左右?！镞^濾除菌消毒：適用于組織細(xì)胞培養(yǎng)使用的液體如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等。★紫外線消毒：主要用于實驗室房間里的空氣、操作臺外表及桌椅等233、常用設(shè)施的消毒及滅菌培養(yǎng)室：紫外線照射、乳酸熏蒸臺面：紫外線照射、70%乙醇擦拭培養(yǎng)箱：新潔爾滅擦拭培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等：用報紙包好高壓蒸汽滅菌滴管、槍頭等：裝載相應(yīng)的容器中用報紙包好高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)板：紫外線照射12小時以上。培養(yǎng)基：過濾除菌、3、常用設(shè)施的消毒及滅菌培養(yǎng)室：紫外線照射、乳酸熏蒸、24第二節(jié)培養(yǎng)操作根本要領(lǐng)和要求防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的無菌。一、培養(yǎng)前準(zhǔn)備1、制定出分門別類的操作卡片。如“分裝血清〞、“組織塊貼壁初代培養(yǎng)〞、“傳代培養(yǎng)〞、等等。各卡片上記有需用器材和物品名稱、要求及數(shù)量等，好處是實驗者可按卡片收集所用物品，清點無誤后，把用品放置于操作場地，然后進(jìn)展消毒。第二節(jié)培養(yǎng)操作根本要領(lǐng)和要求防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的252、操作野消毒：現(xiàn)多用紫外線燈滅菌，效果很好。用30瓦紫外線管燈，操作箱消毒20一30分鐘即可；操作室空間大，需消毒30～50分鐘。在用紫外線燈照射期間，在操作臺面上勿置培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液等物，以免受射線影響(必要時可用紙張覆蓋)。紫外線只有直接殺菌作用，工作野用品過多或重疊放置，物品相互遮擋射線，會降低消毒效果2、操作野消毒：現(xiàn)多用紫外線燈滅菌，效果很好。用30瓦紫外263、洗手和著裝：原那么上和外科手術(shù)一樣。在利用無菌箱工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，洗刷時一定要清洗到肘部。75％酒精，進(jìn)展擦洗消毒；必要時亦可用0.2％的新潔爾滅洗滌消毒。進(jìn)展培養(yǎng)工作時，如利用凈化臺，僅戴口罩和工作帽，著一般工作服即可。在無菌室內(nèi)工作需著消毒衣帽。3、洗手和著裝：原那么上和外科手術(shù)一樣。在利用無菌箱工作時，27二、火焰消毒：在無菌環(huán)境進(jìn)展培養(yǎng)或做其它無菌操作時，首先要點燃酒精燈或煤氣燈。以后操作，如安裝吸管帽、啟開或封閉瓶口等，都需經(jīng)過火焰燒灼進(jìn)展。已吸取過營養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼！因吸管頭中殘留營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入培養(yǎng)液中。消毒火焰要求無色或微藍(lán)色，而紅黃色或發(fā)黑的火苗，表示燃燒不完全或含有雜質(zhì)，有害物能混入培養(yǎng)液內(nèi)。因此酒精燈需用96％的不含雜質(zhì)的酒精，絕不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。二、火焰消毒：28三、培養(yǎng)操作本卷須知1、進(jìn)展培養(yǎng)操作時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染時機(jī)。2、不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部，如不便消毒時，應(yīng)取備品更換。3、布局：原那么上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央(圖4-1)。工作由始至終要保持一定順序性。三、培養(yǎng)操作本卷須知29《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件304、組織或細(xì)胞在末做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在使用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。5、培養(yǎng)用瓶開瓶以后，皆應(yīng)保持45度斜位或平放，吸取營養(yǎng)液BSS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞穿插污染。6、工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。4、組織或細(xì)胞在末做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)31

第三節(jié)根本培養(yǎng)操作技術(shù)

第三節(jié)根本培養(yǎng)操作技術(shù)32一、傳代培養(yǎng)法當(dāng)初代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長增殖形成單層細(xì)胞后，進(jìn)而擴(kuò)展集合，占滿一切空間，此時需要進(jìn)展別離培養(yǎng)。這一操作稱傳代或再培養(yǎng)。80%集合或剛集合細(xì)胞是理想傳代階段。為什么要進(jìn)展傳代？一、傳代培養(yǎng)法當(dāng)初代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長增殖形成單層細(xì)胞后，進(jìn)331、貼壁細(xì)胞傳代1、貼壁細(xì)胞傳代34貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞35貼附生長型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板貼附生長型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板36++++++++++++細(xì)胞的貼附過程貼附物質(zhì)帶正電荷細(xì)胞帶負(fù)電荷+++++++++37成纖維細(xì)胞：梭形、三角形、2-3個突起上皮細(xì)胞：扁平、多角形、園核可連成單層成纖維細(xì)胞：梭形、三角形、2-3個突起上皮細(xì)胞：扁平、多角形38材料和試劑★Hela細(xì)胞★RPMI1640生長液、碳酸氫鈉、雙抗EDTA消化液〔0.02%〕★培養(yǎng)瓶、無菌吸液管〔5ml、1ml〕、彎頭毛細(xì)滴管、廢液缸材料和試劑39圖5-6消化法傳代培養(yǎng)步驟圖5-6消化法傳代培養(yǎng)步驟40【程序】(1)吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；(2)向瓶內(nèi)參加EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限；(3)置溫箱中2～5分鐘(或在室溫中，把培養(yǎng)瓶放在倒立顯微鏡臺上鏡下觀察)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化；(4)吸除消化液【程序】41(5)用吸管吸取營養(yǎng)液〔已經(jīng)參加雙抗并調(diào)好pH值〕參加培養(yǎng)瓶，輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液；吹打勿用力過猛，以免傷害細(xì)胞；(6)計數(shù)板計數(shù)后(如非實驗用，不計數(shù)亦可)，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。(5)用吸管吸取營養(yǎng)液〔已經(jīng)參加雙抗并調(diào)好pH值〕參加培養(yǎng)瓶422、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

2、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

43懸浮生長型細(xì)胞懸浮生長型細(xì)胞44《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件45材料和試劑★HL-60細(xì)胞★RPMI1640生長液、碳酸氫鈉、雙抗★培養(yǎng)瓶、無菌吸液管〔5ml、1ml〕、彎頭毛細(xì)滴管、廢液缸材料和試劑46二、操作步驟l、選生長良好的HL-60細(xì)胞一瓶輕輕參加等量的生長液。2、用無菌吸液管輕輕吹打，使HL-60細(xì)胞均勻懸浮然后吸出一半的細(xì)胞懸液加人另一個培養(yǎng)瓶中。3、如果細(xì)胞比較濃，可按1:3分配傳代培養(yǎng)。二、操作步驟47二、初代培養(yǎng)法

意義：初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng)，是從供體獲取組織后的首次培養(yǎng)。其最大優(yōu)點是：組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大的變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下(年齡、性別)，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。初代培養(yǎng)細(xì)胞是研究基因表達(dá)的理想系統(tǒng)。采用初代培養(yǎng)細(xì)胞做實驗，如藥物測試等效果也很好；初代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系(株)必須經(jīng)過的階段。二、初代培養(yǎng)法

意義：48

1、原那么：幼體組織尤其是胚胎組織比年老個體的組織容易培養(yǎng)；分化程度低的組織比分化程度高的容易生長；腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。一般在無特定要求時，取易培養(yǎng)的組織進(jìn)展培養(yǎng)，成功率高。〔一〕取材

1、原那么：〔一〕取材49本卷須知：取材之后，最好立即培養(yǎng)，如因故不能培養(yǎng)時，應(yīng)把組織切成1立方厘米左右的小塊，置于培養(yǎng)液中，4℃貯存；存放時間不宜超過24小時。從體內(nèi)取材時，應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，取腫瘤和其它病理組織時容易帶菌，為減少污染，可用含500~1000單位／毫升的青、鏈霉素BSS液，漂洗5~10分鐘后再做培養(yǎng)處理。本卷須知：501、鼠組織取材各種組織取材1、鼠組織取材各種組織取材512．取皮膚：人皮膚是常用的培養(yǎng)材料，對供體無特定要求時，可利用手術(shù)時取材：請術(shù)者手術(shù)時切取l~2cm2皮膚，即滿足培養(yǎng)要求。取皮膚時可在上臂和大腿內(nèi)側(cè)等處，先用肥皂洗凈取材部位皮膚，用75％酒精擦拭消毒2~3次(勿用碘酒)。取材方法可按如下兩種方法：一是用注射器針尖輕輕斜刺入表皮內(nèi)2毫米左右，向上挑起一個小的皮丘，然后用手術(shù)刀緊貼針尖下方，切下直徑2~3毫米小片，深度以創(chuàng)面微見血跡為度；二是用拇指和食指把取皮部皮膚緊捏起，在繃起的皮膚外表，用手術(shù)刀輕輕片取一小片表皮，大小和深度同前。2．取皮膚：人皮膚是常用的培養(yǎng)材料，對供體無特定要求時，可523．取體液：血液白細(xì)胞是常用的培養(yǎng)材料，一般多用靜脈取血法。亦可從耳垂或指尖取血。從無名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢復(fù)很快不易感染。從手指取2~3滴血即夠一次培養(yǎng)，血用量多時需從靜脈采取。為防止凝血，常用肝素等抗凝劑；吸出血后拔掉針，立即把血注入無菌容器中備用。取骨髓組織、羊水、胸水和腹水可委托臨床有關(guān)科室，按不同手術(shù)規(guī)程取材。3．取體液：53〔二〕組織的別離目的：為獲取多量生長良好的細(xì)胞，必須把組織細(xì)胞分散開，使細(xì)胞解離出來；能到達(dá)單細(xì)胞水平更好，同時并不使細(xì)胞受傷害，細(xì)胞能很好生長。分散組織的方法有離心法、機(jī)械法和化學(xué)法三種；〔二〕組織的別離目的：為獲取多量生長良好的細(xì)胞，必須把組織細(xì)541．離心別離法培養(yǎng)物為血液、羊水、腹水和胸水等細(xì)胞懸液時，可采用離心法別離。一般用低速500~1000轉(zhuǎn)／分速度，離心5~10分鐘即可。如懸液量大，離心時間可適當(dāng)延長，但如離心速度過大和時間太長，易壓擠細(xì)胞使之受損或死亡。1．離心別離法培養(yǎng)物為血液、羊水、腹水和胸水等細(xì)胞懸液時，可55淋巴細(xì)胞別離法原理：淋巴細(xì)胞分層液(LyphocyteSeparationMedium)效果很好。分層液是根據(jù)細(xì)胞比重不同，使各類細(xì)胞相互分開的。紅細(xì)胞比重1.092，淋巴細(xì)胞和大單核等白細(xì)胞比重為1.070；分層液適用于別離血中淋巴細(xì)胞。(1)取抗凝血假設(shè)干毫升；(2)按1:1參加無菌分層液(濾過除菌)后，800~1000轉(zhuǎn)離心；(3)無菌別離出白細(xì)胞(白細(xì)胞位于紅細(xì)胞上層，呈微白色)；(4)BSS漂洗1~2次，可用于培養(yǎng)或其它實驗。注意：如用動物血(如小鼠)，白細(xì)胞的比重與人不同；小鼠白細(xì)胞比重為l.080左右，需用相應(yīng)比重的分層液。淋巴細(xì)胞別離法原理：淋巴細(xì)胞分層液(LyphocyteSe562．機(jī)械分散法：切割別離法：在進(jìn)展組織塊培養(yǎng)時，可采用剪切法，一般多剪切成1mm3大小的塊。具體操作如下：2．機(jī)械分散法：57無菌切取1cm3組織一塊，置入青霉素瓶或小燒杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或彎剪(剪柄較長為好)伸入容器中，反復(fù)剪切組織至1mm3大小為止(成糊狀)。然后用吸管吸取Hanks液把附著在剪刀上的組織小塊沖下，并再補(bǔ)加3~5毫升Hanks液后，用吸管反復(fù)輕輕吸吹沖打片刻，低速離心、去上清、余下組織塊即可用于培養(yǎng)。剪刀剪切法可能對組織有一定損傷，但操作比較方便。無菌切取1cm3組織一塊，置入青霉素瓶或小燒杯中，左手斜58壓擠法壓擠法59《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件603．消化別離法：組織消化法是在把組織剪切成較小體積的根底上，應(yīng)用生化和化學(xué)手段進(jìn)一步分散組織的方法。最后成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，然后參加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)容器中后，細(xì)胞容易生長增殖。各種消化劑的作用機(jī)制各不一樣，根據(jù)組織的不同，可選用特定的消化手段。3．消化別離法：611．消化培養(yǎng)法(單細(xì)胞培養(yǎng)〕(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)類型(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)類型62(1)準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘；注意：組織塊、胰蛋白酶、培養(yǎng)液等易受紫外線傷害的物品，最好在培養(yǎng)時再攜入操作野；如預(yù)先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響；(2)處理組織：把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2～3次，去除血污；如疑心組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30～60分鐘；(3)剪切：用眼科剪把組織塊切成2～3毫米大小的塊(用手術(shù)刀切割亦可)，以便于消化；(1)準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒263(4)消化：參加比組織塊總量多30～50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞；或用恒溫水浴，或置)37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。(4)消化：參加比組織塊總量多30～50倍的胰蛋白酶液，然64(5)別離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊(必要時可繼續(xù)進(jìn)展消化)；低速(500～1000轉(zhuǎn)／分)離心消化液5分鐘，吸出上清，參加適量含有血清的培養(yǎng)液(如用其它酶或EDTA等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再參加培養(yǎng)液)；《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件65(7)計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對大多數(shù)細(xì)胞來說，pH要求在7.2～7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；(8)培養(yǎng)：置入36.5度溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需更換新塞。(7)計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)66《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件672、組織塊培養(yǎng)法:

2、組織塊培養(yǎng)法:

68《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件69【程序】(1)剪切：把組織小塊(1cm3)置入小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗2～3次以去掉外表血污，吸凈Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切成lmm3塊為止；(2)擺布：用彎頭吸管吸取假設(shè)干小塊，置入培養(yǎng)瓶中；用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底上，小塊相互距離為0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20～30塊；(3)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底向上；注意翻瓶時勿令組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱2小時左右(勿超過4小時)，使小塊微干涸；【程序】70(4)培養(yǎng)：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊(組織小塊附著尚不牢，注意不要把組織塊沖走)；置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后，再補(bǔ)加培養(yǎng)液。(4)培養(yǎng)：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶(瓶71三、細(xì)胞計數(shù)一、原理

細(xì)胞計數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/毫升表示。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)一樣。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力。

用臺酚蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反響，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。

三、細(xì)胞計數(shù)72二、儀器、用品與試劑1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數(shù)板、試管、吸管

2、試劑：0.4％臺酚蘭(臺酚蘭0.4克加雙蒸水至100ml)3、材料：細(xì)胞懸液(細(xì)胞懸液的制備：用毛吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一小試管中，參加1滴臺盼藍(lán)染液〔0.4％〕或苯胺黑，混勻，靜置2－3min,活細(xì)胞不會被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣參加染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。)二、儀器、用品與試劑73三、操作步驟

1、將血球計數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：〔細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)〕/ml＝〔四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104/ml三、操作步驟

74說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以2于染液是1：1稀釋。公式中乘以104因為計數(shù)板每一個大格的體積為：1.0mm〔長〕×1.0mm〔寬〕×0.1mm〔高〕＝0.1mm3而1ml＝1000mm3。四、細(xì)胞計數(shù)要點1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)展離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否那么影響計數(shù)準(zhǔn)確性。

說明：753.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時屢次取樣計數(shù)時更意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確；4.數(shù)細(xì)胞的原那么是只數(shù)完整的細(xì)胞，假設(shè)細(xì)胞聚集成團(tuán)時只按照一個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞壓在格線上時，那么只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。5.操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否那么要重新計數(shù)。

3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時屢次取樣計76五、初學(xué)者易犯的錯誤：

1.計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。2.滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。3.滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。五、初學(xué)者易犯的錯誤：77細(xì)胞計數(shù)原理細(xì)胞計數(shù)原理78《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件79四、細(xì)胞凍存1．原理：在不附加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會結(jié)成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但如向細(xì)胞培養(yǎng)液中參加保護(hù)劑甘油或二甲基亞礬(DMSO)，可使冰點降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，可防止上述現(xiàn)象的發(fā)生。當(dāng)前最常用的保護(hù)劑仍為甘油和DMSO，它們對細(xì)胞無毒、分子量小、溶解度大、易穿透細(xì)胞，使用范圍在5％~15％之間，常用10％。四、細(xì)胞凍存802．要點:為保持細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍快融的方法?！都?xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件81各種細(xì)胞對凍存速度的要求也不一樣；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，另外用什么防護(hù)劑適宜和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO較好，一般細(xì)胞可用甘油；用量以較小為好。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20％~30％甘油中很好。原那么上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應(yīng)再復(fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。各種細(xì)胞對凍存速度的要求也不一樣；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性82《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件83[程序](1)細(xì)胞處理：選對數(shù)生長期細(xì)胞；收集細(xì)胞24小時前換液一次；(2)凍存液：先用培養(yǎng)液9分+DMSO1分(或甘油)配成10％的DMSO凍存液；按按常規(guī)法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計數(shù)、令細(xì)胞密度達(dá)107／ml(一般用4瓶細(xì)胞)，(4)分裝：分裝入無菌凍存管中，每管加1.5毫升細(xì)胞懸液；(5)封口：擰緊凍存管蓋，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán)，必要時可浸入藍(lán)色液中觀察；[程序]84〔6〕入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發(fā)生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細(xì)胞名稱，凍存日期，以便日后查找；(7)凍存：當(dāng)前已有專用細(xì)胞凍存器；在無凍存器的情況下，可用手工方法：4℃1h、-20℃2h、85℃1h、從把凍存物懸在液氮罐口開場算起，按-1℃~-12℃／分鐘速度，在30~40分鐘內(nèi)，下降到液氮面，再停30分鐘后，直投入液氮中。注意：①操作時應(yīng)帶保護(hù)眼鏡和手套，以免液氮傷人；②細(xì)胞注入安瓶中后一定封嚴(yán)，最好使用塑料制螺口安額，但一定要擰緊螺帽?！?〕入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發(fā)生爆炸傷人85五、冷凍細(xì)胞復(fù)蘇方法

五、冷凍細(xì)胞復(fù)蘇方法

86[程序](1)從液氮罐中取出凍存管；有時凍存管因末封嚴(yán)，浸入了液氮，取出后因安額內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸(力量有限)，因此應(yīng)帶防護(hù)眼鏡和手套；(2)迅速放入盛有36~37℃水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時搖動，盡快解凍，要在一分鐘內(nèi)溶解；(3)用70％酒精擦試消毒后，凈化臺上翻開蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管中，再補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸浮；[程序]87(4)低速離心(500~1000轉(zhuǎn)／分)5分鐘。(5)去上清，參加培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。注意：凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，在融解后能允許做1：10倍或1：20倍的稀釋(細(xì)胞數(shù)／毫升)；一般每瓶細(xì)胞接種濃度為5×105／m1，因此凍存密度應(yīng)到達(dá)107／ml，在稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數(shù)量。(4)低速離心(500~1000轉(zhuǎn)／分)5分鐘。88六、細(xì)胞運(yùn)送一是用液氮或干冰保存，效果較好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸發(fā)均較快，適于空運(yùn)，比較麻煩；六、細(xì)胞運(yùn)送89二為充液法：(1)選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待達(dá)80％或90％集合時，去掉舊培養(yǎng)液換入新培養(yǎng)液，量要到達(dá)培養(yǎng)瓶的頸部(過滿易污染)，保存少許空間，塞緊瓶塞；空氣過多運(yùn)輸中氣泡運(yùn)動易使細(xì)胞脫落；(2)妥善包裝和運(yùn)送；一般在不超過四五天到達(dá)目的地的情況下，對細(xì)胞活力無嚴(yán)重影響；(3)到達(dá)后，倒出大局部培養(yǎng)液，保存正常量，置37℃培養(yǎng)，次日傳代。二為充液法：90七、收到細(xì)胞的處理方式1.收到細(xì)胞株包裹時，請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，假設(shè)有請立即通知。細(xì)胞株請盡速開場培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。2.冷凍細(xì)胞解凍程序:1〕依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之根底培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。2〕FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,馬血清)，對細(xì)胞而言差異極大，請務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。

七、收到細(xì)胞的處理方式1.收到細(xì)胞株包裹時，請檢查細(xì)胞株913〕將培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。4〕依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩參加T25或T75flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3〕將培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，輕搖冷凍管使其在1925〕對絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會對細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。對極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO者，那么可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5-10ml培養(yǎng)基中，離心(約1000rpm)，5分鐘，小心移去上清液，參加適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5〕對絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不93收到T25flask細(xì)胞時，處理方式為︰

1.于寄送過程中，為防止起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25flask均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，假設(shè)有任何問題，不要翻開蓋子，請立即通知細(xì)胞實驗室。

2.將原封之T25flask靜置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37℃，并讓運(yùn)送過程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，僅留約5-10ml培養(yǎng)基于flask內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長滿盤，那么將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。收到T25flask細(xì)胞時，處理方式為︰

1.于寄94八、加支持物培養(yǎng)法

加支持物培養(yǎng)法是預(yù)先向培養(yǎng)容器中參加各種可使細(xì)胞貼附的支持物，進(jìn)展培養(yǎng)的方法。待細(xì)胞貼附于支持物生長增殖后，可進(jìn)展各種實驗和觀察。觀察時可把支持物從瓶中抽出，能做各種技術(shù)處理，是研究工作中常用的方法之一。各種對細(xì)胞無毒性的如玻璃、塑料、雞卵殼膜、膠原、硅橡膠、袋泡茶包裝紙等，均可做支持物用。八、加支持物培養(yǎng)法

加支持物培養(yǎng)法是預(yù)先向培養(yǎng)容器中參加各951．支持物制備特制有機(jī)玻璃、特氟隆薄膜、玻璃等：其中以玻璃片和特氟隆薄膜最為多用。前者便于做各種固定、染色處理和觀察；后者最適做電鏡技術(shù)，允許做包埋和切片。加支持物培養(yǎng)法程序與一般培養(yǎng)法一樣，只是在培養(yǎng)前需在培養(yǎng)瓶中參加已消毒的支持物。特氟隆薄膜為定型無菌包裝產(chǎn)品，用時無菌條件下啟封，用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊，于培養(yǎng)接種細(xì)胞前，先置入培養(yǎng)容器中即可。1．支持物制備96通常多用蓋玻片做支持物，用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài)，以便裝入培養(yǎng)瓶中，按如下順序處理：自來水浸泡24小時→96％酒精30～60分鐘→蒸餾水浸泡30～60分鐘→用干凈軟布擦拭干凈(擦?xí)r應(yīng)戴白手套工作)→裝入培養(yǎng)器皿中→高壓或干熱滅菌備用。通常多用蓋玻片做支持物，用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài)，97第四章

根本培養(yǎng)技術(shù)

第四章

98

內(nèi)容第一節(jié)玻璃器皿及塑料制品的清洗與消毒第二節(jié)培養(yǎng)操作的根本要領(lǐng)和要求第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的根本技術(shù)

內(nèi)容99第一節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料

制品的清洗與消毒第一節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料

制品的清洗與消毒100一、清洗目的：在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長有害物質(zhì)包括：微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿、膠塞、塑料制品一、清洗目的：1011、玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟清洗后的玻璃器皿要求：干凈透明無油跡不能殘留任何物質(zhì)1、玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟102清洗：自來水洗，烘干泡酸自來水洗去離子水洗三蒸水洗烘干新瓶子均按該程序清洗，培養(yǎng)材料染菌的瓶子經(jīng)高壓滅菌后也按該程序清洗。酸液〔洗液〕：濃硫酸+重鉻酸鉀清洗：自來水洗，烘干泡酸自來水洗去離103浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉。浸泡：104新的初次使用的玻璃器皿先用自來水簡單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)培養(yǎng)瓶浸泡后還需要裝滿蒸餾水后上高壓?。⌒碌某醮问褂玫牟Ａ髅笈囵B(yǎng)瓶浸泡后還需要裝滿蒸餾水后上高壓！105再次使用的玻璃器皿：用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。原因：常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉。再次使用的玻璃器皿：106刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿外表附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會損害器皿外表光澤度刷洗：107浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中的過程注意：浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時配制、浸泡時應(yīng)注意平安，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露局部。

浸酸：108沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡。浸泡后的沖洗過程：需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，蒸餾水浸泡過夜，自來水沖洗5遍，一蒸水5遍，二蒸水3遍，培養(yǎng)瓶要求二蒸水也用流水，烤干備用。沖洗需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，蒸餾水浸泡過夜1092、膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理.常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘〔以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)〕，自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用。2、膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水1103、塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，翻開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。培養(yǎng)板、塑料離心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在烤箱中枯燥??！3、塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝111二、包裝：目的：以便消毒及儲存，防止落人灰塵及消毒后再次被污染。包裝紙〔盒〕外表用油性記號筆標(biāo)明物品名稱、消毒日期等??！二、包裝：112各種用品的包裝器皿的包裝分為半包裝和全包裝培養(yǎng)瓶兩個一組全包，包裝前蓋上螺旋蓋子。吸管在與膠頭相接端塞上棉花裝入吸管筒。青霉素小瓶倒扣在飯盒中，全包。濾器上下口半包裝再用報紙包，最后用布包好。大的容器如錐形瓶，加上棉塞后半包裝。槍頭、EP管裝在相應(yīng)的盒子中，全包。手術(shù)器械放在飯盒中，全包。離心管加蓋子后全包各種用品的包裝器皿的包裝分為半包裝和全包裝113三、消毒、滅菌防止培養(yǎng)物污染可通過消毒滅菌〔將已存在的微生物去除〕滅菌sterilization：應(yīng)用理化方法殺死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。消毒disinfection：應(yīng)用理化方法殺死微生物，只要求到達(dá)無傳染性的目的，不要求全部殺死。三、消毒、滅菌114無菌germfree：沒有活菌。防腐antisepsis：應(yīng)用理化方法防止和抑制微生物生長繁殖。抑菌〔bacteriostasis〕：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌生長繁殖。常用的抑菌劑為抗生素?zé)o菌germfree：沒有活菌。1151、消毒滅菌的方法★物理方法:濕熱〔高壓蒸汽〕、干熱、紫外線。射線、過濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物?！锘瘜W(xué)方法:使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。

1、消毒滅菌的方法★物理方法:濕熱〔高壓蒸汽〕、干熱、紫1162、消毒滅菌的本卷須知

★干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)展，需加溫到160℃，保持90－120min方能殺死芽孢。注意??！消毒完畢后不可馬上將烤箱門翻開，以免冷空氣突然進(jìn)人，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。2、消毒滅菌的本卷須知★干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)展，需加溫117★濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)展消毒。注意：1、不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。2、在加熱升壓之前，翻開排氣閥門，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出！！關(guān)閉排氣閥門，開場升壓，待到達(dá)所需要的壓力時，開場記錄時間，并控制壓力恒定。

★濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)展消毒。1183、一般物品：布類、金屬器械、玻璃器皿等消毒的要求是15磅20min；常規(guī)使用液體：消毒15磅15min。4、橡膠和塑料用品：如濾器、EP管、離心管等高壓10磅15min。

3、一般物品：布類、金屬器械、玻璃器皿等消毒的要求是15磅119★紫外線消毒：主要用于實驗室房間里的空氣、操作臺外表及桌椅等消毒。時間為30分鐘－2小時左右?！镞^濾除菌消毒：適用于組織細(xì)胞培養(yǎng)使用的液體如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等?！镒贤饩€消毒：主要用于實驗室房間里的空氣、操作臺外表及桌椅等1203、常用設(shè)施的消毒及滅菌培養(yǎng)室：紫外線照射、乳酸熏蒸臺面：紫外線照射、70%乙醇擦拭培養(yǎng)箱：新潔爾滅擦拭培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等：用報紙包好高壓蒸汽滅菌滴管、槍頭等：裝載相應(yīng)的容器中用報紙包好高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)板：紫外線照射12小時以上。培養(yǎng)基：過濾除菌、3、常用設(shè)施的消毒及滅菌培養(yǎng)室：紫外線照射、乳酸熏蒸、121第二節(jié)培養(yǎng)操作根本要領(lǐng)和要求防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的無菌。一、培養(yǎng)前準(zhǔn)備1、制定出分門別類的操作卡片。如“分裝血清〞、“組織塊貼壁初代培養(yǎng)〞、“傳代培養(yǎng)〞、等等。各卡片上記有需用器材和物品名稱、要求及數(shù)量等，好處是實驗者可按卡片收集所用物品，清點無誤后，把用品放置于操作場地，然后進(jìn)展消毒。第二節(jié)培養(yǎng)操作根本要領(lǐng)和要求防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的1222、操作野消毒：現(xiàn)多用紫外線燈滅菌，效果很好。用30瓦紫外線管燈，操作箱消毒20一30分鐘即可；操作室空間大，需消毒30～50分鐘。在用紫外線燈照射期間，在操作臺面上勿置培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液等物，以免受射線影響(必要時可用紙張覆蓋)。紫外線只有直接殺菌作用，工作野用品過多或重疊放置，物品相互遮擋射線，會降低消毒效果2、操作野消毒：現(xiàn)多用紫外線燈滅菌，效果很好。用30瓦紫外1233、洗手和著裝：原那么上和外科手術(shù)一樣。在利用無菌箱工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，洗刷時一定要清洗到肘部。75％酒精，進(jìn)展擦洗消毒；必要時亦可用0.2％的新潔爾滅洗滌消毒。進(jìn)展培養(yǎng)工作時，如利用凈化臺，僅戴口罩和工作帽，著一般工作服即可。在無菌室內(nèi)工作需著消毒衣帽。3、洗手和著裝：原那么上和外科手術(shù)一樣。在利用無菌箱工作時，124二、火焰消毒：在無菌環(huán)境進(jìn)展培養(yǎng)或做其它無菌操作時，首先要點燃酒精燈或煤氣燈。以后操作，如安裝吸管帽、啟開或封閉瓶口等，都需經(jīng)過火焰燒灼進(jìn)展。已吸取過營養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼！因吸管頭中殘留營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入培養(yǎng)液中。消毒火焰要求無色或微藍(lán)色，而紅黃色或發(fā)黑的火苗，表示燃燒不完全或含有雜質(zhì)，有害物能混入培養(yǎng)液內(nèi)。因此酒精燈需用96％的不含雜質(zhì)的酒精，絕不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。二、火焰消毒：125三、培養(yǎng)操作本卷須知1、進(jìn)展培養(yǎng)操作時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染時機(jī)。2、不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部，如不便消毒時，應(yīng)取備品更換。3、布局：原那么上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央(圖4-1)。工作由始至終要保持一定順序性。三、培養(yǎng)操作本卷須知126《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件1274、組織或細(xì)胞在末做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在使用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。5、培養(yǎng)用瓶開瓶以后，皆應(yīng)保持45度斜位或平放，吸取營養(yǎng)液BSS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞穿插污染。6、工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。4、組織或細(xì)胞在末做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)128

第三節(jié)根本培養(yǎng)操作技術(shù)

第三節(jié)根本培養(yǎng)操作技術(shù)129一、傳代培養(yǎng)法當(dāng)初代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長增殖形成單層細(xì)胞后，進(jìn)而擴(kuò)展集合，占滿一切空間，此時需要進(jìn)展別離培養(yǎng)。這一操作稱傳代或再培養(yǎng)。80%集合或剛集合細(xì)胞是理想傳代階段。為什么要進(jìn)展傳代？一、傳代培養(yǎng)法當(dāng)初代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長增殖形成單層細(xì)胞后，進(jìn)1301、貼壁細(xì)胞傳代1、貼壁細(xì)胞傳代131貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞132貼附生長型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板貼附生長型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板133++++++++++++細(xì)胞的貼附過程貼附物質(zhì)帶正電荷細(xì)胞帶負(fù)電荷+++++++++134成纖維細(xì)胞：梭形、三角形、2-3個突起上皮細(xì)胞：扁平、多角形、園核可連成單層成纖維細(xì)胞：梭形、三角形、2-3個突起上皮細(xì)胞：扁平、多角形135材料和試劑★Hela細(xì)胞★RPMI1640生長液、碳酸氫鈉、雙抗EDTA消化液〔0.02%〕★培養(yǎng)瓶、無菌吸液管〔5ml、1ml〕、彎頭毛細(xì)滴管、廢液缸材料和試劑136圖5-6消化法傳代培養(yǎng)步驟圖5-6消化法傳代培養(yǎng)步驟137【程序】(1)吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；(2)向瓶內(nèi)參加EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限；(3)置溫箱中2～5分鐘(或在室溫中，把培養(yǎng)瓶放在倒立顯微鏡臺上鏡下觀察)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化；(4)吸除消化液【程序】138(5)用吸管吸取營養(yǎng)液〔已經(jīng)參加雙抗并調(diào)好pH值〕參加培養(yǎng)瓶，輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液；吹打勿用力過猛，以免傷害細(xì)胞；(6)計數(shù)板計數(shù)后(如非實驗用，不計數(shù)亦可)，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。(5)用吸管吸取營養(yǎng)液〔已經(jīng)參加雙抗并調(diào)好pH值〕參加培養(yǎng)瓶1392、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

2、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

140懸浮生長型細(xì)胞懸浮生長型細(xì)胞141《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件142材料和試劑★HL-60細(xì)胞★RPMI1640生長液、碳酸氫鈉、雙抗★培養(yǎng)瓶、無菌吸液管〔5ml、1ml〕、彎頭毛細(xì)滴管、廢液缸材料和試劑143二、操作步驟l、選生長良好的HL-60細(xì)胞一瓶輕輕參加等量的生長液。2、用無菌吸液管輕輕吹打，使HL-60細(xì)胞均勻懸浮然后吸出一半的細(xì)胞懸液加人另一個培養(yǎng)瓶中。3、如果細(xì)胞比較濃，可按1:3分配傳代培養(yǎng)。二、操作步驟144二、初代培養(yǎng)法

意義：初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng)，是從供體獲取組織后的首次培養(yǎng)。其最大優(yōu)點是：組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大的變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下(年齡、性別)，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。初代培養(yǎng)細(xì)胞是研究基因表達(dá)的理想系統(tǒng)。采用初代培養(yǎng)細(xì)胞做實驗，如藥物測試等效果也很好；初代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系(株)必須經(jīng)過的階段。二、初代培養(yǎng)法

意義：145

1、原那么：幼體組織尤其是胚胎組織比年老個體的組織容易培養(yǎng)；分化程度低的組織比分化程度高的容易生長；腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。一般在無特定要求時，取易培養(yǎng)的組織進(jìn)展培養(yǎng)，成功率高?！惨弧橙〔?/p>

1、原那么：〔一〕取材146本卷須知：取材之后，最好立即培養(yǎng)，如因故不能培養(yǎng)時，應(yīng)把組織切成1立方厘米左右的小塊，置于培養(yǎng)液中，4℃貯存；存放時間不宜超過24小時。從體內(nèi)取材時，應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，取腫瘤和其它病理組織時容易帶菌，為減少污染，可用含500~1000單位／毫升的青、鏈霉素BSS液，漂洗5~10分鐘后再做培養(yǎng)處理。本卷須知：1471、鼠組織取材各種組織取材1、鼠組織取材各種組織取材1482．取皮膚：人皮膚是常用的培養(yǎng)材料，對供體無特定要求時，可利用手術(shù)時取材：請術(shù)者手術(shù)時切取l~2cm2皮膚，即滿足培養(yǎng)要求。取皮膚時可在上臂和大腿內(nèi)側(cè)等處，先用肥皂洗凈取材部位皮膚，用75％酒精擦拭消毒2~3次(勿用碘酒)。取材方法可按如下兩種方法：一是用注射器針尖輕輕斜刺入表皮內(nèi)2毫米左右，向上挑起一個小的皮丘，然后用手術(shù)刀緊貼針尖下方，切下直徑2~3毫米小片，深度以創(chuàng)面微見血跡為度；二是用拇指和食指把取皮部皮膚緊捏起，在繃起的皮膚外表，用手術(shù)刀輕輕片取一小片表皮，大小和深度同前。2．取皮膚：人皮膚是常用的培養(yǎng)材料，對供體無特定要求時，可1493．取體液：血液白細(xì)胞是常用的培養(yǎng)材料，一般多用靜脈取血法。亦可從耳垂或指尖取血。從無名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢復(fù)很快不易感染。從手指取2~3滴血即夠一次培養(yǎng)，血用量多時需從靜脈采取。為防止凝血，常用肝素等抗凝劑；吸出血后拔掉針，立即把血注入無菌容器中備用。取骨髓組織、羊水、胸水和腹水可委托臨床有關(guān)科室，按不同手術(shù)規(guī)程取材。3．取體液：150〔二〕組織的別離目的：為獲取多量生長良好的細(xì)胞，必須把組織細(xì)胞分散開，使細(xì)胞解離出來；能到達(dá)單細(xì)胞水平更好，同時并不使細(xì)胞受傷害，細(xì)胞能很好生長。分散組織的方法有離心法、機(jī)械法和化學(xué)法三種；〔二〕組織的別離目的：為獲取多量生長良好的細(xì)胞，必須把組織細(xì)1511．離心別離法培養(yǎng)物為血液、羊水、腹水和胸水等細(xì)胞懸液時，可采用離心法別離。一般用低速500~1000轉(zhuǎn)／分速度，離心5~10分鐘即可。如懸液量大，離心時間可適當(dāng)延長，但如離心速度過大和時間太長，易壓擠細(xì)胞使之受損或死亡。1．離心別離法培養(yǎng)物為血液、羊水、腹水和胸水等細(xì)胞懸液時，可152淋巴細(xì)胞別離法原理：淋巴細(xì)胞分層液(LyphocyteSeparationMedium)效果很好。分層液是根據(jù)細(xì)胞比重不同，使各類細(xì)胞相互分開的。紅細(xì)胞比重1.092，淋巴細(xì)胞和大單核等白細(xì)胞比重為1.070；分層液適用于別離血中淋巴細(xì)胞。(1)取抗凝血假設(shè)干毫升；(2)按1:1參加無菌分層液(濾過除菌)后，800~1000轉(zhuǎn)離心；(3)無菌別離出白細(xì)胞(白細(xì)胞位于紅細(xì)胞上層，呈微白色)；(4)BSS漂洗1~2次，可用于培養(yǎng)或其它實驗。注意：如用動物血(如小鼠)，白細(xì)胞的比重與人不同；小鼠白細(xì)胞比重為l.080左右，需用相應(yīng)比重的分層液。淋巴細(xì)胞別離法原理：淋巴細(xì)胞分層液(LyphocyteSe1532．機(jī)械分散法：切割別離法：在進(jìn)展組織塊培養(yǎng)時，可采用剪切法，一般多剪切成1mm3大小的塊。具體操作如下：2．機(jī)械分散法：154無菌切取1cm3組織一塊，置入青霉素瓶或小燒杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或彎剪(剪柄較長為好)伸入容器中，反復(fù)剪切組織至1mm3大小為止(成糊狀)。然后用吸管吸取Hanks液把附著在剪刀上的組織小塊沖下，并再補(bǔ)加3~5毫升Hanks液后，用吸管反復(fù)輕輕吸吹沖打片刻，低速離心、去上清、余下組織塊即可用于培養(yǎng)。剪刀剪切法可能對組織有一定損傷，但操作比較方便。無菌切取1cm3組織一塊，置入青霉素瓶或小燒杯中，左手斜155壓擠法壓擠法156《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件1573．消化別離法：組織消化法是在把組織剪切成較小體積的根底上，應(yīng)用生化和化學(xué)手段進(jìn)一步分散組織的方法。最后成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，然后參加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)容器中后，細(xì)胞容易生長增殖。各種消化劑的作用機(jī)制各不一樣，根據(jù)組織的不同，可選用特定的消化手段。3．消化別離法：1581．消化培養(yǎng)法(單細(xì)胞培養(yǎng)〕(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)類型(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)類型159(1)準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘；注意：組織塊、胰蛋白酶、培養(yǎng)液等易受紫外線傷害的物品，最好在培養(yǎng)時再攜入操作野；如預(yù)先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響；(2)處理組織：把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2～3次，去除血污；如疑心組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30～60分鐘；(3)剪切：用眼科剪把組織塊切成2～3毫米大小的塊(用手術(shù)刀切割亦可)，以便于消化；(1)準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒2160(4)消化：參加比組織塊總量多30～50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞；或用恒溫水浴，或置)37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。(4)消化：參加比組織塊總量多30～50倍的胰蛋白酶液，然161(5)別離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊(必要時可繼續(xù)進(jìn)展消化)；低速(500～1000轉(zhuǎn)／分)離心消化液5分鐘，吸出上清，參加適量含有血清的培養(yǎng)液(如用其它酶或EDTA等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再參加培養(yǎng)液)；《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件162(7)計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對大多數(shù)細(xì)胞來說，pH要求在7.2～7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；(8)培養(yǎng)：置入36.5度溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需更換新塞。(7)計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)163《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件1642、組織塊培養(yǎng)法:

2、組織塊培養(yǎng)法:

165《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件166【程序】(1)剪切：把組織小塊(1cm3)置入小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗2～3次以去掉外表血污，吸凈Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切成lmm3塊為止；(2)擺布：用彎頭吸管吸取假設(shè)干小塊，置入培養(yǎng)瓶中；用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底上，小塊相互距離為0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20～30塊；(3)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底向上；注意翻瓶時勿令組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱2小時左右(勿超過4小時)，使小塊微干涸；【程序】167(4)培養(yǎng)：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊(組織小塊附著尚不牢，注意不要把組織塊沖走)；置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后，再補(bǔ)加培養(yǎng)液。(4)培養(yǎng)：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶(瓶168三、細(xì)胞計數(shù)一、原理

細(xì)胞計數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/毫升表示。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)一樣。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力。

用臺酚蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反響，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。

三、細(xì)胞計數(shù)169二、儀器、用品與試劑1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數(shù)板、試管、吸管

2、試劑：0.4％臺酚蘭(臺酚蘭0.4克加雙蒸水至100ml)3、材料：細(xì)胞懸液(細(xì)胞懸液的制備：用毛吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一小試管中，參加1滴臺盼藍(lán)染液〔0.4％〕或苯胺黑，混勻，靜置2－3min,活細(xì)胞不會被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣參加染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。)二、儀器、用品與試劑170三、操作步驟

1、將血球計數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：〔細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)〕/ml＝〔四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104/ml三、操作步驟

171說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以2于染液是1：1稀釋。公式中乘以104因為計數(shù)板每一個大格的體積為：1.0mm〔長〕×1.0mm〔寬〕×0.1mm〔高〕＝0.1mm3而1ml＝1000mm3。四、細(xì)胞計數(shù)要點1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)展離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否那么影響計數(shù)準(zhǔn)確性。

說明：1723.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時屢次取樣計數(shù)時更意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確；4.數(shù)細(xì)胞的原那么是只數(shù)完整的細(xì)胞，假設(shè)細(xì)胞聚集成團(tuán)時只按照一個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞壓在格線上時，那么只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。5.操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否那么要重新計數(shù)。

3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時屢次取樣計173五、初學(xué)者易犯的錯誤：

1.計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。2.滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。3.滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。五、初學(xué)者易犯的錯誤：174細(xì)胞計數(shù)原理細(xì)胞計數(shù)原理175《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件176四、細(xì)胞凍存1．原理：在不附加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會結(jié)成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但如向細(xì)胞培養(yǎng)液中參加保護(hù)劑甘油或二甲基亞礬(DMSO)，可使冰點降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，可防止上述現(xiàn)象的發(fā)生。當(dāng)前最常用的保護(hù)劑仍為甘油和DMSO，它們對細(xì)胞無毒、分子量小、溶解度大、易穿透細(xì)胞，使用范圍在5％~15％之間，常用10％。四、細(xì)胞凍存1772．要點:為保持細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍快融的方法?！都?xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件178各種細(xì)胞對凍存速度的要求也不一樣；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，另外用什么防護(hù)劑適宜和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO較好，一般細(xì)胞可用甘油；用量以較小為好。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20％~30％甘油中很好。原那么上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應(yīng)再復(fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。各種細(xì)胞對凍存速度的要求也不一樣；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性179《細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)》教學(xué)課件180[程序](1)細(xì)胞處理：選對數(shù)生長期細(xì)胞；收集細(xì)胞24小時前換液一次；(2)凍存液：先用培養(yǎng)液9分+DMSO1分(或甘油)配成10％的DMSO凍存液；按按常規(guī)法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計數(shù)、令細(xì)胞密度達(dá)107／ml(一般用4瓶細(xì)胞)，(4)分裝：分裝入無菌凍存管中，每管加1.5毫升細(xì)胞懸液；(5)封口：擰緊凍存管蓋，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán)，必要時可浸入藍(lán)色液中觀察；[程序]181〔6〕入紗