實(shí)驗(yàn)四 植物RNA的提取及其電泳鑒定一、原理植物細(xì)胞內(nèi)含有細(xì)胞質(zhì)RNA、細(xì)胞核RNA和細(xì)胞器RNA。細(xì)胞質(zhì)RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。細(xì)胞核RNA主要有細(xì)胞質(zhì)RNA的前體及小分子細(xì)胞核RNA(snRNA)、染色質(zhì)RNA(chRNA)等。細(xì)胞器RNA主要指線(xiàn)粒體RNA及葉綠體RNA。這些RNA統(tǒng)稱(chēng)細(xì)胞總RNA,其中大量的是rRNA,占80%左右?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA在總RNA中只占1%?5%。不同的mRNA在分子大小、核甘酸序列，以及在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平等方面各不相同，但真核細(xì)胞mRNA3'末端都具有20?200個(gè)不等的多聚腺甘酸的尾，稱(chēng)為poly(A)結(jié)構(gòu)。利用poly(A)結(jié)構(gòu)可以把mRNA從總RNA中分離出來(lái)。對(duì)于用「眥皿雜交可以使用植物細(xì)胞總RNA,也可以使用由總RNA中分離出的mRNA。植物細(xì)胞RNA提取中的主要問(wèn)題是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一類(lèi)水解核糖核酸的內(nèi)切酶，它與一般作用于核酸的酶類(lèi)有著顯著的不同，不僅生物活性十分穩(wěn)定，耐熱、耐酸、耐堿，作用時(shí)不需要任何輔助因子，而且它的存在非常廣泛，除細(xì)胞內(nèi)含有豐富的RNA酶外，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，如各種器皿、試劑、人的皮膚、汗液、甚至灰塵中都有RNA酶的存在。因而，生物體內(nèi)源、外源RNA酶的降解作用是導(dǎo)^NA提取失敗的致命因素。內(nèi)源RNA酶來(lái)源于材料的組織細(xì)胞，提取自始至終都應(yīng)對(duì)RNase活性進(jìn)行有效抑制。RNA提取過(guò)程中將蛋白質(zhì)變性劑與RNase抑制劑聯(lián)合使用效果較理想。蛋白質(zhì)變性劑包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸鈉)、口06脫氧膽酸鈉)、鹽酸胍、異硫氰酸胍、4一氨基水楊酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉等；RNA酶抑制劑有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧釩核糖核昔復(fù)合物等。外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2Hs-O-CO-O-CO-O-CxH5),它能與RNase分子中的必需基團(tuán)組氨酸殘基上的咪唑環(huán)結(jié)合而抑制酶活性，用于水、試劑及器皿的RNase滅活。DEPC與肝素合用效果增強(qiáng)，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不穩(wěn)定，很快分解成CO2及C2H50H，因而不能用于Tirs溶液的RNase滅活。水及其它溶液的滅活一般使用0.05%?0.1%DEPC,37℃處理過(guò)夜，也有人采用磁攪0.5小時(shí)以上的做法。DEPC處理后的溶液還需高壓滅菌，以去除殘存的DEPC。若DEPC去除不凈，會(huì)破壞mRNA活性。不能高壓滅菌的試劑要使用經(jīng)過(guò)DEPC處理的滅菌蒸餾水配制，然后用0.22um濾膜過(guò)濾。含有Tris的試劑用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水配制，再經(jīng)高壓消毒。玻璃器皿可以在180℃烘烤8小時(shí)以上，不能烘烤的器皿用0.1%的DEPC水處理過(guò)夜后再高壓滅菌。提取全過(guò)程必須在清潔無(wú)塵的環(huán)境中進(jìn)行。操作人員要使用一次性的手套拿取物品，盡可能避免一切污染機(jī)會(huì)。提取時(shí)使用的器皿應(yīng)經(jīng)過(guò)硅烷化處理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成損失。RNA電泳使用的電泳槽需用去污劑洗滌，水沖洗，乙醇干燥。再浸入3%H202溶液中，室溫下放置10分鐘以上，再用DEPC溶液處理過(guò)的水沖洗干凈?？傊?，實(shí)驗(yàn)中所用的試劑、器皿都要經(jīng)過(guò)RNase滅活處理。盡管如此，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)在提取的后期RNA被降解的問(wèn)題。這是因?yàn)镽Nase活性的抑制只是一個(gè)暫時(shí)的現(xiàn)象，一旦抑制劑濃度下降RNase就有可能恢復(fù)活性。對(duì)于RNA提取來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)潛伏的危險(xiǎn)。在提取的前階段，提取液中無(wú)疑是有足夠的抑制劑，但到了提取后期，抑制成分逐漸減少，殘存的RNase就會(huì)復(fù)活而引起RNA降解。另外，提取后期發(fā)生的RNase污染，那怕是極輕微的，也會(huì)使到手的產(chǎn)品降解，因而提取后期要更加小心。影響植物RNA提取的另一個(gè)問(wèn)題是水溶性的細(xì)胞代謝物如酚、多糖等易與RNA結(jié)合成膠凍狀的不溶物或有色的復(fù)合物，它們能影響RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量。人們采用了多種處理方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，如對(duì)組織提取液進(jìn)行高速離心去除多糖；采用低pH值的提取緩沖液抑制酚的解離及氧化；或用B一巰基乙醇、PVP來(lái)抑制酚類(lèi)的干擾等。（一）總RNA的提取用于研究基因表達(dá)的總RNA提取時(shí)首先要考慮的問(wèn)題是材料的選取及預(yù)處理。由于基因表達(dá)與生理狀態(tài)密切相關(guān)，因而取材時(shí)必須考慮材料的生理狀態(tài)，必要時(shí)還要對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，即施加某種因素，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，如進(jìn)行光照、暗處理、或加入誘導(dǎo)物等。材料的破碎與植物細(xì)胞總DNA的提取相同，采用液氮冷凍及在液氮中研磨。預(yù)處理過(guò)的材料要盡早地投入到液氮中，投入前要盡可能保持材料完整及新鮮，不要讓材料壓碎及破損。因?yàn)橹参锊牧显谄茡p時(shí)會(huì)引起多酚類(lèi)物質(zhì)的積累及氧化，使組織變褐而影響RNA分離。細(xì)胞膜裂解也與DNA提取相同，主要使用SDS或Sakosyl、酚等。由于細(xì)胞內(nèi)RNA主要以核蛋白體形式存在，所以總RNA提取的路線(xiàn)是細(xì)胞破碎，使核蛋白體從細(xì)胞內(nèi)釋放；采用使蛋白質(zhì)變性的做法，令核蛋白體解析，RNA迅速與蛋白質(zhì)分離，大量地釋放到溶液中；然后用酚、氯仿有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，使核酸進(jìn)入水相；再選擇性沉淀RNA,使之與DNA分離；所得RNA再進(jìn)行必要的純化，最后用乙醇或異丙醇沉淀RNA。至于植物細(xì)胞總RNA的提取方法，同植物總DNA提取一樣，沒(méi)有一種固定的通用方法。文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的植物細(xì)胞總RNA的提取方法很多，但綜合起來(lái)看，分離的主要依據(jù)不外乎如下幾點(diǎn)：①用酚及去污劑SDS或Sakosyl破碎細(xì)胞膜并去除蛋白質(zhì)；②酚、氯仿反復(fù)抽提純化核酸；③LiCl選擇性沉淀去除DNA及其它不純物；④3mol/L乙酸鈉（pH6）沉淀RNA,DNA在上清液中；⑤CsCl密度梯度離心，去除多糖等雜質(zhì)，純化RNA。目前用于Northern雜交植物總RNA提取方法根據(jù)主要試劑可分為苯酚法、異硫氰酸胍（或CTAB）法及氯化鋰沉淀法：1、苯酚法：該法利用苯酚協(xié)助破碎細(xì)胞；酚/氯仿變性蛋白質(zhì)并反復(fù)抽提核酸；3mol/L乙酸鈉選擇沉淀RNA；提取液中使用4-氨基水楊酸及三異丙基萘磺酸鹽抑制RNase活性。該方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，可用于從植物葉、莖、根及萌發(fā)幼苗中提取，限NA或核RNA。2、異硫氰酸胍法：異硫氰酸根及胍離子都是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑。異硫氰酸胍與十二烷基肌氨酸鈉合用可使核蛋白體迅速解體；與還原劑B一巰基乙醇合用能強(qiáng)烈抑制RNase活力，因而是制備RNA的一種常用試劑。傳統(tǒng)的異硫氰酸胍法需利用CsCl離心分離RNA(沉到管底)。這種做法操作時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備要求高。經(jīng)改進(jìn)，目前使用的方法使操作大大地簡(jiǎn)化，并可同時(shí)提取多個(gè)樣品。做法是將異硫氰酸胍、B一巰基乙醇、十二烷基肌氨酸鈉三者合用，強(qiáng)有力抑制YRNA降解，增加了核蛋白體的解離，將大量的RNA釋放到溶液中，然后用酸性酚進(jìn)行抽提，既可保證RNA穩(wěn)定，又可抑制DNA解離，使DNA與蛋白質(zhì)一起沉淀，RNA被抽提進(jìn)入水相，用異丙醇沉淀RNA后，經(jīng)酚/氯仿再次抽提進(jìn)行純化。該方法提取的RNA用于Northern雜交可以得到滿(mǎn)意結(jié)果。3、氯化鋰沉淀法：該方法的主要原理是在一定的pH條件下，Li+使RNA發(fā)生特異性沉淀，通過(guò)多級(jí)沉淀可提高RNA的純凈度。利用氯化鋰選擇性沉淀時(shí)，因提取緩沖體系不同有多種不盡相同的氯化鋰法，有的使用硼酸緩沖液，加入還原劑二硫蘇糖醇抑制RNase活性，用SDS變性核蛋白；有的使用Tris—HCl緩沖體系，用苯酚及蛋白酶K處理蛋白；還有的使用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNase。氯化鋰沉淀法雖也有效，但沉淀過(guò)程較為繁瑣，并存在著Li+的污染問(wèn)題。(二)mRNA的分離從總RNA中分離mRNA主要是利用親和層析的原理。植物mRNA的3'一端具有poly(A)結(jié)構(gòu)，可用oligo(dT)—纖維素(寡聚(dT)—纖維素)或Poly(U)—Sepharse(多聚(U)—瓊脂糖)親和層析技術(shù)來(lái)純化mRNA?？俁NA在流經(jīng)寡聚(dT)—纖維素層析柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA3/一端多聚(A)殘基與連接在纖維素柱上的寡聚(dT)殘基間配對(duì)，形成氫鍵，使mRNA被吸附在柱上。不具poly(A)結(jié)構(gòu)的RNA,不能發(fā)生特異性結(jié)合而從柱中流出。結(jié)合在柱上的mRNA可以用低鹽緩沖液或蒸餾水洗脫。因?yàn)樵诟啕}溶液中堿基間的氫鍵穩(wěn)定，在低鹽狀態(tài)下易解離，水打破poly(A)與(dT)間的氫鍵，使mRNA洗脫。層析中涉及到的緩沖液有兩種，一是上樣緩沖液，也有人稱(chēng)結(jié)合緩沖液。各文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)合緩沖液都由Tris?C1、EDTA、氯化物鹽類(lèi)及去污劑組成。不同之處是有的使用0.5mol/L的NaCl、有的使用0.5mol/L的LiCl。不管使用哪種鹽，都為高濃度，以促進(jìn)poly(A)與寡聚(dT)結(jié)合。第二種是洗脫緩沖液，除Tris、去污劑的濃度減半外(也有Tris量不減半的)，最大的變化是不含氯化物或含低濃度的LiCl。其作用是解除Poly(A)與寡聚(dT)的結(jié)合，使mRNA洗脫下來(lái)。在沒(méi)有特制的層析柱時(shí)，可以用無(wú)菌硅化的巴斯德吸管或lml的注射器做層析柱，出口端用無(wú)菌硅烷化過(guò)的玻璃纖維填充。寡聚(dT)纖維素用上樣緩沖液懸浮后裝柱。柱體積在0.25ml左右。裝柱后用0.1mol/L的NaOH洗柱，上樣緩沖液平衡。RNA的樣品量一般在2?5mg,體積為lml左右。上樣前樣品要經(jīng)過(guò)變性處理，置沸水浴中加熱數(shù)分鐘后立即置冰浴中。上樣后就要立即收集流出液，這時(shí)流出液中可能含有一些未能與纖維素結(jié)合的mRNA。將流出液加熱至65℃維持6-7分鐘，然后快速冷卻再重新上樣，如此反復(fù)多次，以使mRNA充分被吸附在纖維素柱上，用5~10倍體積的結(jié)合緩沖液洗柱，這時(shí)rRNA、tRNA等逐漸被冼脫，而mRNA掛在柱上。洗脫至流出液的OD260值幾乎為零，換用低鹽的洗脫緩沖液洗脫mRNA，部分收集器收集，測(cè)定每管中的mRNA濃度，合并含mRNA的洗脫液，用乙醇沉淀mRNA，于-70℃保存。（三）RNA樣品質(zhì)量檢測(cè)用于Northern雜交的RNA樣品應(yīng)是純凈的，無(wú)明顯的DNA、蛋白質(zhì)污染，無(wú)小分子有機(jī)物復(fù)合，無(wú)提取試劑的污染。分子完整，無(wú)嚴(yán)重降解。同DNA樣品質(zhì)量檢測(cè)相同，主要有紫外吸收法及瓊脂糖凝膠電泳法兩種。1、紫外吸收法①純度檢測(cè)：在分光光度計(jì)上分別測(cè)定樣品在230nm、260nm、280nm的吸收值，計(jì)算A260/A280及A260/A230的比值。純凈的RNA樣品A260/A280的比值應(yīng)在1.7?2.0之間，若小于1.7則表明樣品中有蛋白質(zhì)或酚試劑污染。此時(shí)，可用等體積的酚/氯仿重新抽提去除蛋白質(zhì)；用氯仿、乙醚抽提去除殘酚。在抽提過(guò)程中RNA損失較大（約60%）。A260/A230的比值應(yīng)大于2.0,如小于2.0則表明RNA被異硫氰酸胍污染。這時(shí)可以通過(guò)乙醇或異丙醇重新沉淀（可反復(fù)幾次）來(lái)去除。關(guān)于DNA雜質(zhì)的存在與否紫外分光光度法不能予以明確說(shuō)明。②濃度測(cè)定：純凈的RNA樣品（無(wú)DNA及核甘酸雜質(zhì)）260nm的光吸收值等于1.0時(shí)，RNA的含量為37Rg/m1。根據(jù)此吸收值與濃度的關(guān)系可求出任一RNA樣品的濃度。RNA含量（ug/ml）=Ax稀釋倍數(shù)x37ug/ml當(dāng)對(duì)含量要求不十分精確時(shí)，可近似認(rèn)為A260=1.0時(shí)的RNA濃度為40Rg/m1。測(cè)定時(shí)如果按如下做法可使計(jì)算簡(jiǎn)化：取4glRNA樣品，加蒸餾水至lml,以蒸餾水或TE為空白測(cè)定A260值，該數(shù)值x10即為樣品RNA濃度（Ng/Rl）。2、瓊脂糖凝膠電泳法由于RNA分子結(jié)構(gòu)與DNA不同，因而RNA電泳時(shí)有著與DNA電泳的不同之處。因RNA為單鏈分子，鏈內(nèi)配對(duì)堿基很易通過(guò)氫鍵結(jié)合而形成二級(jí)以至三級(jí)結(jié)構(gòu)。不同的RNA分子空間結(jié)構(gòu)不同，因而RNA分子在未變性的條件下分子量與泳動(dòng)率無(wú)嚴(yán)格的相關(guān)性。在變性條件下電泳，破壞RNA的空間結(jié)構(gòu)，才能使RNA的泳動(dòng)距離與其分子量對(duì)數(shù)值成正比。變性后的RNA泳動(dòng)速度比天然RNA小1/2左右。在不需要測(cè)定RNA分子量時(shí)，使用濃度1.0%?1.4%的非變性瓊脂糖凝膠也可將不同的RNA分子分離。當(dāng)需要對(duì)所提取的RNA樣品進(jìn)行快速檢測(cè)時(shí)可使用非變性膠?？俁NA樣品中的主要成分是28S的rRNA、18S的rRNA及5SrRNA。電泳后在膠板上呈現(xiàn)三條明顯的條帶。在上樣量小時(shí)，5SrRNA的條帶有時(shí)顯示不清。若在變性膠上，這三條帶的遷移率分別與5.1kb、2.0kb及0.12kb的標(biāo)準(zhǔn)RNA的遷移率相近。從量上看，澳化乙錠染色后28SrRNA條帶的亮度應(yīng)為18SrRNA的兩倍。如果28SrRNA的亮度不如18SrRNA條帶，表明樣品中RNA有降解。發(fā)生降解的原因主要是RNase滅活不好，或操作中溫度過(guò)高。防止的方法是操作全過(guò)程在4c低溫條件下或冰上進(jìn)行。操作中一次性手套要經(jīng)常更換，盡量避免RNase污染。二、植物總RNA的提取方法（三）TRIZOL法小量提取RNA（InvitrogenCo.）1、于1.5ml離心管中加入1mlTRIZOL提取液；2、稱(chēng)取0.1g液氮研磨后的材料，轉(zhuǎn)移到提取液中，漩渦振蕩混勻，15-30℃靜置5min；3、4℃,12000g，離心10min；取上清；4、加0.2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)15sec,15-30℃放置2-3min,4℃,12,0008，離心15min；5、取水相，加0.25ml異丙醇，0.25ml高鹽溶液，顛倒混勻，15-30℃放置10min,4℃,12,000g離心10min,去上清；6、用1ml冰預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，漩渦振蕩，4℃,7500g離心5min；7、真空泵吸除乙醇，用DEPC-ddH2O溶解RNA,55-60℃溶解10min,迅速冰浴，稍離心8、-20℃短時(shí)間保存，-80℃保存長(zhǎng)期保存。高鹽溶液（100mL）：0.8M檸檬酸鈉23.528g；1.2MNaCl7.013g三、RNA電泳檢測(cè)在含有甲醛的凝膠上進(jìn)行的RNA電泳應(yīng)小心，甲醛蒸氣有毒，含有甲醛的溶液應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)配制，含甲醛溶液的電泳槽應(yīng)盡可能蓋嚴(yán)。操作步驟如下：1、配制5X甲醛凝膠電泳緩沖液：0.1MMOPS（pH7.0）；40mM乙酸鈉；5mMEDTA（pH8.0）將20.6g3-（N-瑪琳代）丙磺酸（MOPS）溶于800ml經(jīng)用DEPC處理的50mM乙酸鈉溶液。用2M氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)至7.0,力口10ml經(jīng)用DEPC處理的0.5MEDTA（pH8.0）,在加經(jīng)用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。上述溶液經(jīng)用0.2gm微孔濾膜過(guò)濾除菌，避光保存于室溫。光照或高壓后溶液逐漸變黃，淡黃色的緩沖液可正常使用，而深黃色緩沖液則不然。2.、制備凝膠將適量瓊脂糖溶于水（1%）,冷卻至60℃,加入5X甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為1X和2.2M（將12.3M甲醛貯存液、瓊脂糖水溶液和5X甲醛凝膠電泳緩沖液按1:3.5:1.1比例混合即可）。再化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，于室溫放置30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，使凝膠凝固。3、在一滅菌的1.5ml離心管內(nèi)混合下列液體，以制備樣品：RNA（30gg）4.5ul；5X甲醛凝膠電泳緩沖液2.0Pl；甲醛 3.5Pl；甲酰胺 10.0ul于65℃溫育15分鐘，冷浴冷卻，離心5秒鐘使管內(nèi)所有液體集中于管底。每一泳道至多可分析30ggRNA,通常用10-20ug細(xì)胞總RNA進(jìn)行Northern雜交，可以檢測(cè)高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1%以上）。許多批號(hào)的試劑級(jí)甲醛溶液已足夠純，不需經(jīng)過(guò)任何預(yù)處理即可直接使用。但如果甲醛溶液呈黃色，需在溶液中加入DowexXG8混合床樹(shù)脂置磁力攪拌器上攪拌1小時(shí)，再用Whatmanl號(hào)濾紙過(guò)濾2次，進(jìn)行去離子甲醛應(yīng)分裝成小份，充氮保存于-70℃。4、加2〃滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的甲醛凝膠加樣緩沖液。甲醛凝膠加樣緩沖液：50%甘油；1mMEDTA（pH8.0）；0.25%澳酚藍(lán)；0.25%二甲苯青FF；5、加樣前，將凝膠預(yù)電泳5分鐘，電壓降為5V/cm,隨后將樣品加至凝膠加樣孔?？捎靡阎笮〉腞NA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，如用18S和28SrRNA或者9S兔B-珠蛋白mRNA,這些RNA的長(zhǎng)度分別為6333、2366和710個(gè)核甘酸。也可以從BRL購(gòu)置已知大小的RNA的混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。通常分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的泳道位于凝膠邊緣，便于電泳后將其切去進(jìn)行澳化乙錠染色，可能的話(huà)在分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物以及欲轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留一個(gè)空白泳道。6、將凝膠浸入1X甲醛凝膠加樣緩沖液中，3-4V/cm電壓降進(jìn)行電泳。電泳緩沖液不需進(jìn)行持續(xù)循環(huán)，電泳1-2小時(shí)后，收集并混合兩個(gè)液槽的緩沖液，再加入電泳槽中，即可繼續(xù)電泳。7、電泳結(jié)束后（澳酚藍(lán)遷移出約8cm）,切下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的凝膠，浸入澳化乙錠溶液（0.5ug/ml,用0.1M乙酸銨配制）中染色30-45分鐘。在凝膠旁放置一透明尺，在紫外燈下照像。測(cè)量照片上每個(gè)RNA條帶至加樣孔的距離，以RNA片段大小的1g對(duì)數(shù)值對(duì)RNA條帶的遷移距離作圖，用所得曲線(xiàn)計(jì)算從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物后通過(guò)雜交所檢出的RNA分子的大小。小心：澳化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶劑時(shí)應(yīng)戴手套，用后應(yīng)進(jìn)行凈化處理。紫外線(xiàn)照射有危害，對(duì)眼睛尤甚。為盡量避免受到照射②RNA沉淀未完全溶解2、A260/A280<1.65?？赡艿脑蚴牵孩贆z測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒(méi)有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高②樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少③ 勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘④吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相⑤RNA沉淀未完全溶解3、RNA降解?？赡艿脑蚴牵孩俳M織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍② 待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃③細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過(guò)度④溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理⑤電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.54、DNA污染?？赡艿脑蚴牵孩贅悠穭驖{時(shí)加的試劑量太少②樣品中含有有機(jī)溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖液或堿性溶液五、植物RNA提取過(guò)程中難點(diǎn)的相應(yīng)對(duì)策（一）酚類(lèi)化合物的干擾及對(duì)策：許多植物組織特別是植物的果實(shí)（如蘋(píng)果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹(shù)木類(lèi)植物中富含酚類(lèi)化合物。酚類(lèi)物質(zhì)的含量會(huì)隨著植物的生長(zhǎng)而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類(lèi)植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時(shí)，酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)釋放出來(lái)，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚㈦S氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為褐化效應(yīng)（browningeffect）。被氧化的酚類(lèi)化合物（如醌類(lèi)）能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類(lèi)物質(zhì)的總量之間并無(wú)相關(guān)性，因此認(rèn)為不是所有的酚類(lèi)化合物都影響RNA的提取。但一般認(rèn)為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類(lèi)物質(zhì)（如原花色素類(lèi)物質(zhì)）是影響RNA提取的一類(lèi)化合物。目前去除酚類(lèi)化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開(kāi)。1、防止酚類(lèi)化合物被氧化的方法：①還原劑法：一般在提取緩沖液中加入（-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來(lái)防止酚類(lèi)物質(zhì)被氧化，有時(shí)提取液中（-巰基乙醇的濃度可高達(dá)2%。（-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認(rèn)為在過(guò)夜沉淀RNA時(shí)加入（-巰基乙醇（終濃度1%）可以防止在此過(guò)程中酚類(lèi)化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類(lèi)化合物可被還原成多酚化合物。②螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO—N=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)。原花色素類(lèi)物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使原花色素類(lèi)物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時(shí)pH值是一個(gè)重要的影響因素，在pH8.0以上時(shí)PVP結(jié)合多酚的能力會(huì)迅速降低〔11〕。當(dāng)原花色素類(lèi)物質(zhì)量較大時(shí)，單獨(dú)使用PVPP無(wú)法去除所有的這類(lèi)化合物，因而需要與其它方法結(jié)合使用。③Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（pH7.5）,其中的硼酸可以與酚類(lèi)化合物依*氫鍵形成復(fù)合物，從而抑制了酚類(lèi)物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合。這一方法十分有效，所以L(fǎng)6pez-G6mez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過(guò)高（＞0.2M）則會(huì)影響RNA的回收率。④牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類(lèi)物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類(lèi)似于抗原一抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類(lèi)物質(zhì)與RNA結(jié)合的機(jī)會(huì)，因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會(huì)更好。由于BSA中往往含有RNase,因而在使用時(shí)要加入肝素以抑制RNase的活性。⑤丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹(shù)、山毛櫸等富含酚類(lèi)化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。2、酚類(lèi)化合物的去除：通過(guò)Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類(lèi)化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚，可以直接通過(guò)離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時(shí)除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50%）來(lái)沉淀RNA,而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50%2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認(rèn)為即使多酚被氧化，其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無(wú)需再用NaBH4來(lái)處理。（二）多糖的干擾及對(duì)策：多糖的污染是提取植物RNA時(shí)常遇到的另一個(gè)棘手的問(wèn)題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開(kāi)。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了，造成RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀RNA時(shí)，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無(wú)法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中，通過(guò)SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過(guò)苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過(guò)LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過(guò)這些步驟仍會(huì)發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來(lái)解決植物RNA分離純化時(shí)多糖污染的問(wèn)題。用低濃度乙醇沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無(wú)水乙醇至終濃度10%?30%,可以使多糖沉淀下來(lái)，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時(shí)，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10%以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時(shí)，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30%乙醇來(lái)沉淀多糖的，進(jìn)一步純化YRNA樣品。另一個(gè)常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時(shí)在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時(shí)加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時(shí)是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)。在提取某些植物材料的RNA時(shí)，是將上述兩種方法結(jié)合使用。如L6pez-G6mez等在提取芒果中果皮的RNA時(shí)，是在勻漿液中加入0.25體積的無(wú)水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)。Su等在去除褐藻的多糖時(shí)，單獨(dú)使用乙醇或醋酸鉀都無(wú)效，只有兩者結(jié)合使用效果最佳。Fang等認(rèn)為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于