1、酶切回收連接第1頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三質粒DNA的酶切第2頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三定義：識別dsDNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。限制性核酸內切酶第3頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三類內切酶作用特點能在特殊位點識別和切斷dsDNA，識別序列4-6bp，具有回文結構 （180度旋轉對稱結構）Hind 產生5粘性末端A AGCTTTTCGA AAAGCTTTTCGAA第4頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三Sst GAGCTCCTCGAG產生3粘性

2、末端GAGCT CC TCGAG粘端切口第5頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三GTCCAGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口第6頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現的先后次序。3、命名：Hind Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株的第三種酶 屬 系 株 序書寫方法：前3個字母斜體第7頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶活性單位指在限定條件下（溫度、Buff

3、er），1hr消化1ugDNA的酶量稱為一個酶單位（unit）。實際工作中，為保證消化完全，1ugDNA的消化需要3-5個單位的酶，反應時間也要適度延長，通常是反應過夜。第8頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶切反應系統(tǒng)的設計回收DNA通常酶切10g實際酶的用量應是理論用量的3-5倍。酶通常保存在50%的甘油中 ，使用時甘油濃度必須小于5%，故酶至少稀釋10倍。Buffer通常是10，使用時稀釋10倍?？偡磻w積20-50ul，不足用tdH2O補足。第9頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三DNA的量酶的用量（U/C）酶在50甘油中，甘油在總體積的濃

4、度要小于5反應的總體積Buffer的體積水的體積第10頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 質粒DNA 15l （10g）Hind III (20U/l) 1.5 l 10 緩沖液 E 3l 三蒸水 9l _總體積 30l XbaI（20U/l 1.5 l 加樣順序加樣后混勻，短暫離心，使之至管底。第11頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三DNA片段的分離純化第12頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三四、操作步驟： 關鍵操作：點樣在加樣孔正上方，不要進入孔中甚至戳穿孔底加樣器一旦按下，就一定保持按住直至加樣器離開加樣孔，否則會將

5、樣品又吸回到tip中，使加樣失敗第13頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三載體 DNA目的基因第14頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 第15頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酚抽提法切下含目的DNA的膠塊。加入酚，將膠塊沒過即可。振蕩后低溫凍結，視溫度而定時間。30水浴融化，若體積小，可補加TE。振蕩器上振蕩。12,000 rpm離心5 min。取上清200l。第16頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三用200l的氯仿：異戊醇抽提（

6、振蕩，離心12000 rpm，5 min，取上清）。加20 l NaAc，400 l無水乙醇沉淀DNA，冰凍約30 min甚至過夜。12,000 rpm離心10 min，棄上清。將DNA溶于約30l TE中。第17頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三DNA片段的連接反應第18頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 DNA 連接酶 ligase 催化DNA 5 磷酸基與 3 羥基之間形成磷酸二酯鍵(ATP)5533OHPOHPDNA連接酶DNA連接酶第19頁，共21頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三總體積20 l 載體 0.10.2g目的基因：載體mol數= 15：1H2O10buffer載體目的基因ligase總體積20l l l l l l 第20頁，共21頁，2022年，5月20日，2