1、PCR 基因擴增儀基礎(chǔ)知識分子生物學(xué)技術(shù)正以驚人的速度發(fā)展，特別是近20 年來已經(jīng)成為生命科學(xué)的一個主要 的生長點。1976 年 cDNA 克隆技術(shù)的建立，使分子生物學(xué)更加迅速廣泛地滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué) 科，發(fā)展了各學(xué)科的分子理論基礎(chǔ)。 1985 年 Mullis 首先描述的多聚酶鏈反應(yīng)( PCR， Polymerase Chain Reaction )，使一向昂貴、繁雜、嚴(yán)格的分子生物學(xué)試驗?zāi)軌蛟诒容^簡易、 經(jīng)濟的條件下有效的開展，是基因分析技術(shù)的一項重大突破。這一技術(shù)在很短的時間里即風(fēng) 行全球，不同學(xué)科的科學(xué)家都蜂擁而上，在近年形成了分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱潮，期望憑借這 一工具來提高研究水平，解決所

2、面臨的一些難題。早在四十年以前人們對遺傳基因的化學(xué)本質(zhì)并不清楚，后來發(fā)現(xiàn)脫氧核糖核酸0NA) 是遺傳信息的主要載體。DNA的基礎(chǔ)構(gòu)成單位是核苷，核苷的排列順序規(guī)定遺傳密碼并形 成了基因oDNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，以半保留的方式進行復(fù)制的(Warson, 1953), 1958年Meselson 證實了 DNA半保留復(fù)制模型。60年代對基因表達和調(diào)控研究又取得很大進展，從細(xì)胞中分 離目的基因并在體外克隆和表達受到人們的普遍關(guān)注。由于對DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶 的合理使用，DNA重組到質(zhì)?；蚴删w載體中，在細(xì)菌中表達成為70年代基因克隆的最常 用技術(shù)。Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性

3、，與適當(dāng)引物雜交，再用DNA聚合酶延 伸，克隆DNA的設(shè)想，由于當(dāng)時不能合成寡核苷酸及DNA測序等困難而受阻。直到1985 年，美國 Cetus 公司人類遺傳研究室的年輕科學(xué)家 Kary. B. Mullis 發(fā)明了 PCR 技術(shù)，使 Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。Saiki首次描述利用PCR方法擴增人珠蛋白DNA，并用于鐮刀狀 紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。Mullis最初建立的PCR方法使用三種溫度的水浴進行實驗，所用大腸桿菌DNA聚合酶 I 的 KLENOW 片段催化復(fù)性引物的延伸，由于該酶不能耐受使 DNA 變性的高溫，所以每 一輪反應(yīng)都需添加新的酶,產(chǎn)量不高且操作繁復(fù)，對實驗操作要求較高，無

4、法推廣使用。1988 年Saiki等將耐熱DNA聚合酶(Taq)引入了 PCR技術(shù)。由于Taq酶能夠耐受97.5加熱 5-10分鐘，因此使DNA變性的94C加熱不使其失活，整個反應(yīng)只加一次酶即可，并且高溫 反應(yīng)也增加了擴增的特異性和效率，易于自動化進行。Mullis因其杰出的貢獻，1993年獲 諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)能快速特異地在體外復(fù)制目的，理論上能將其量極微的(fg DNA)目的基因 在較短的時間內(nèi)(1-2小時)擴增到極易檢測的微克水平o PCR技術(shù)目前已經(jīng)成為人們獲得 目標(biāo)基因的最常用的方法之一。然而其基本原理并不復(fù)雜，主要包括模板DNA (目標(biāo)DNA) 加熱變性；降溫后反應(yīng)混合物中特

5、異性引物與單鏈DNA模板的復(fù)性；72C條件下，Taq酶 誘導(dǎo)引物借助模板信息由5端到3端延伸。每一輪反應(yīng)，模板拷貝數(shù)都增加一倍，理論 上n次循環(huán)后，擴增產(chǎn)物拷貝數(shù)為2E(n-1)。但在PCR反應(yīng)后期由于底物的消耗，Taq酶 活力的下降， PCR 抑制物的增加， PCR 反應(yīng)的指數(shù)形式逐漸轉(zhuǎn)化為線性形式進入擴增的平 臺期，實際上30-35個循環(huán)，擴增倍數(shù)一般可達百萬倍。如果想再提高擴增產(chǎn)物的量，可以 將產(chǎn)物DNA再稀釋1000倍作為新的模板進行第二輪的PCR擴增，一般二次擴增后的DNA 數(shù)量已達到所有分子生物學(xué)操作的要求。一、變性， DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的生物功能在于復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，加熱或在堿性條件下

6、可以使 DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為DNA變性。解除條件后，變形的單鏈DNA 可以重新結(jié)合起來，再形成雙鏈，稱之為DNA復(fù)性，又叫退火。DNA雙鏈離解一半時溫 度稱為解鏈溫度(Tm)o不同DNA的解鏈溫度不同，取決于DNA中G-C與A-T的含量的 區(qū)別。G-C間有三個氫鍵，A-T間有兩個氫鍵，因此G-C比例大的DNA片段解鏈溫度高， 一般，G-C含量每增加1%, PCR變性溫度增加0.4C。Tm范圍通常一般在85-95C之間， PCR變性溫度選擇94C，變性時間為30秒到2分鐘。二、退火，PCR反應(yīng)體系的退火其實是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互 補的一小段 DNA

7、片段。一般引物是人們根據(jù)目標(biāo) DNA 的序列人工合成的，其長度在 15-30 堿基之間，引物的設(shè)計有一定的原則，但完全達到理論要求的理想引物，幾乎不存在。通常 反應(yīng)體系中包含兩個引物所對應(yīng)的模板區(qū)間的DNA片段。由于引物的濃度大大地超出體系 中模板的濃度，所以變性后，系統(tǒng)溫度降低，首先是引物與單鏈模板DNA結(jié)合，形成局部 雙鏈，而不是原來的兩條單鏈模板DNA再結(jié)合形成的完整的雙鏈。三、延伸， PCR 中鏈的延伸是有方向的，以引物為起點，從5端到 3端延伸，這 是由DNA聚合酶（Taq酶）決定的。Taq酶具有DNA多聚酶的核心功能一以DNA為模板， 從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，將四種

8、脫氧核苷酸以Watson-Crick配對方式按 53的方向，沿著模板順序合成新的DNA鏈。Taq酶催化DNA合成的溫度以70C 80C為宜，此時該酶的Kcat值為150核苷/秒/酶分子，55C為24核苷/秒/酶分子，37C為 1.5核苷/秒/酶分子,22C為0.25核苷/秒/酶分子。高于90 C時DNA合成幾乎不進行。Taq DNA 多聚合酶具有依賴DNA合成的5端到3端外切酶活性。但不會影響PCR擴增。Taq酶 沒有 3端到 5端外切酶活性，所以如果發(fā)生脫氧核苷酸的錯誤摻入時，這種酶沒有校正 能力o Taq酶對Mg2+離子濃度較為敏感，1.5 2.0mM條件下酶活性最高，許多生物變性劑 對酶

9、活性有不同程度的影響。PCR擴增DNA特定區(qū)段，是由人工合成的兩條寡核苷酸引物 所決定的，這是PCR擴增的理論關(guān)鍵。PCR 技術(shù)以其自身巧妙的原理有與眾不同的特點，高特異性、高敏感性及簡便快捷使其成 為基因診斷首選的技術(shù)之一。一、高特異性，PCR擴增嚴(yán)格遵守堿基配對原則的半保留復(fù)制。半保留復(fù)制是世界上最 嚴(yán)格的復(fù)制方式之一，其新合成的子鏈與模板形成完全互補的鏡像結(jié)構(gòu)，從而充分保證了復(fù) 制的準(zhǔn)確性。另外，由于堿基互補原則，只有當(dāng)引物與目的基因完全互補時，反應(yīng)體系中的 引物才能與模板產(chǎn)生復(fù)性，引物的延伸才得以進行，因此引物與模板的互補是復(fù)制的最基本 條件，這從另一方面規(guī)定了 PCR反應(yīng)的高特異性。

10、在生物界中，某種基因總有它最保守的、 最具特征性的基因區(qū)段，它是某些生物，或某些型、亞型等功能分型所特有的。若能正確地 選擇這一區(qū)域作為擴增的目的基因，便可以充分地保障PCR檢測的高度特異性。二、高敏感性，在PCR反應(yīng)中模板DNA以指數(shù)級迅速增加，擴增反應(yīng)前期進入以指 數(shù)級迅速增加，擴增反應(yīng)后期進入平臺反應(yīng)期，一般經(jīng)過30個循環(huán)即12小時內(nèi)可以將靶 序列增加百萬倍以上，可以將微量的目標(biāo)物（fg DNA）檢測出來。過去采用的一些微量檢 測法，如酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）和放射免疫分析（RIA）其靈敏度分別為ng級和pg 級，而PCR可達fg級，理論上可以檢出病原體的單拷貝基因的存在。三、簡便

11、快捷，Taq酶的使用使PCR技術(shù)可以自動化完成，各種高效PCR儀相續(xù)問世 使PCR操作可以在基層單位的實驗室中順利完成。在PCR的實際應(yīng)用中，許多技術(shù)得到改 進，擴增反應(yīng)體積減少，多種成分預(yù)先混合減少加樣步驟，這些簡化步驟大多不影響 PCR 的擴增效果。特別是本公司率先研制的單管單人份的PCR試劑，使操作者節(jié)省時間精力， 而且又不易污染，充分滿足了臨床快速診斷的要求PCR技術(shù)對樣品要求低，不必嚴(yán)格純化 模板DNA，幾乎所有的臨床樣本都能用于PCR擴增，本公司設(shè)計的一步法提取模板使臨床 PCR檢測更加簡便易行。PCR局限性，由于Taq酶缺乏3端到5端外切酶活性，因而不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的 錯誤的核苷酸摻入，復(fù)制的新的DNA鏈中有一定程度的錯配堿基，估計錯配率為9000個 核苷有一個錯配，41000個核苷酸可能導(dǎo)致一次碼移位。然而錯配堿基有終止延伸傾向，這 使錯配的DNA片段不會進一步擴大。另外，PCR要求比較嚴(yán)格，容易出現(xiàn)實驗污染或操作 污染而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。同時如果擴增儀溫度不準(zhǔn)確，反應(yīng)液處理不好導(dǎo)致PCR抑制物進 入反應(yīng)體系又會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在開展PCR工作之前，有關(guān)人員最好能經(jīng)過系統(tǒng)的 學(xué)習(xí)及規(guī)范化的基本技能培訓(xùn)過程。PCR技術(shù)問世以來正以驚人的速度發(fā)展