1、細(xì)胞工程復(fù)習(xí)資料、細(xì)胞工程概述.生物工程：也稱生物工藝學(xué)， 一般稱之為生物技術(shù)。是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體系和工程學(xué)原理生產(chǎn)生物制品或創(chuàng)造新物種的一門綜合技術(shù)。.細(xì)胞工程（Cell engineering ）:是指主要以細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助 工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的的利用或改造生物遺傳性狀，以獲得特定的細(xì)胞、組織、產(chǎn) 品或新型物種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。.廣義的細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)。.狹義的細(xì)胞工程 則是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。.干細(xì)胞（stem cell）:是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。.細(xì)胞工程的研究內(nèi)容（研究生物類型，實(shí)驗(yàn)操

2、作對象）（1）根據(jù)研究生物類型不同， 細(xì)胞工程可分為動物細(xì)胞工程、 植物細(xì)胞工程、微生物細(xì) 胞工程。動物細(xì)胞工程包括：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)）；細(xì)胞融合技 術(shù)；胚胎工程技術(shù)（核移植、胚胎分割等）；克隆技術(shù)（單細(xì)胞系克隆、器官克隆、個體克?。?。植物細(xì)胞工程包括： 植物組織、器官培養(yǎng)技術(shù)；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；原生質(zhì)體融合 與培養(yǎng)技術(shù)；亞細(xì)胞水平的操作技術(shù)等。（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作對象不同，細(xì)胞工程可分為細(xì)胞與組織培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞核移植、染色體操作、轉(zhuǎn)基因生物等.組織工程（tissue engineering ）:是一門以細(xì)胞生物學(xué)和材料科學(xué)相結(jié)合，進(jìn)行體外或 體內(nèi)構(gòu)建組織或器官的新興學(xué)科。

3、.動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)： 從體內(nèi)取出組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境， 在無菌、適當(dāng)溫度和一定 營養(yǎng)條件下，使之生存和生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。習(xí)慣上又泛指所有體外培養(yǎng)，即：器官培養(yǎng)，組織培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)。.植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)： 在無菌條件下，利用人工培養(yǎng)基對植物組織及細(xì)胞的培養(yǎng)，一般包括原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)等培養(yǎng)技術(shù)。是植物細(xì)胞工程的最基本技術(shù)。.細(xì)胞融合：又稱為細(xì)胞雜交，是指用自然或人工方法，使兩個或兩個以上的細(xì)胞融合形成一個細(xì)胞的過程。融合分類：化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細(xì)胞融合。物理法：電融合生物法：仙臺病毒法.單克隆抗體（McAb）:將能夠產(chǎn)生抗體的 B淋巴細(xì)胞和具有無

4、限增殖力的骨髓瘤細(xì)胞 融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子就是單克隆抗 體。.細(xì)胞重組：又叫細(xì)胞拆合，是指從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組份，然后在體外一定條件下將不同細(xì)胞來源的細(xì)胞器及其組分進(jìn)行重組，使其重新裝配成為具有生活生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞器的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。.克隆(clone):是指遺傳上完全相同的分子、細(xì)胞或來自同一祖先的生物個體的無性 繁殖群體，也指通過克隆方式生產(chǎn)克隆群體的過程或手段。.動物生物反應(yīng)器：一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物叫動物生物反應(yīng)器。幾乎任何有生命的器官

5、、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器，從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得。例如，乳腺、膀胱、血液等。.酶促褐變(enzyme browning ):是在有氧的條件下，酚酶催化分類物質(zhì)形成醍及其聚 合物的反應(yīng)過程。.細(xì)胞工程的重要應(yīng)用(植物、動物)(1)植物細(xì)胞工程的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)植物脫毒和快速繁殖細(xì)胞工程育種：利用培養(yǎng)變異，篩選優(yōu)良突變體利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng)，獲得雜種植株，克服其雜交不親和性利用細(xì)胞融合技術(shù)，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性倍性育種離體種質(zhì)保存珍稀植物資源的保存與保護(hù)利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)此生代謝物(2)動物細(xì)胞工程的應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品(單克隆抗體)新

6、品種培育試管動物與嬰兒組織工程珍稀動物資源的保存與保護(hù)利用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物、細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生.植物組織培養(yǎng)：從有機(jī)體內(nèi)取出植物的組織或細(xì)胞，在無菌條件下模擬有機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，并使之生存或長成新的完整植株的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。.植物細(xì)胞培養(yǎng)：指植物細(xì)胞在體外條件下的存活或生長，此時細(xì)胞不在形成組織。主要以生產(chǎn)次生代謝物為目的的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。.植物組織與器官培養(yǎng)： 是指在無菌條件下， 將離體的植物器官、 組織等在人工配制的培 養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件， 誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、 潛伏芽或者長成新的完整植株的一 種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。.細(xì)胞全能性(totipotency ):簡單地講

7、，一個生活細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的潛 在能力稱之為細(xì)胞的全能性。.植物細(xì)胞全能性：指植物體的每個細(xì)胞攜帶著一個完整基因組，并具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。.全能細(xì)胞：是指能夠表達(dá)生物體基因組的任何一種基因，并能分化出該生物體內(nèi)任何一種類型的細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)育成一個完全相同的生物體。. 愈傷組織(callus):是由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的、無組織結(jié)構(gòu)的疏散排列的薄壁細(xì)胞。.外植體（explant）:由活體植物上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細(xì)胞、組織、 器官等，是植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體無菌培養(yǎng)的離體材料。.植物連續(xù)的器官分化是由頂端分生組織細(xì)胞發(fā)育完成的。莖尖、根尖及形成

8、層細(xì)胞,周期中細(xì)胞 JI這類細(xì)胞始終保持分裂能力，從一個周期進(jìn)入另一個周期篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞植物細(xì)胞 終端分化細(xì)胞-JL為永久失去分裂能力的細(xì)胞c表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞G0細(xì)胞4在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂.植物細(xì)胞或組織的離體培養(yǎng)技術(shù)就是細(xì)胞脫分化與再分化的控制過程。（細(xì)胞脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細(xì)胞全能性表現(xiàn)的基本過程。）.脫分化（dedifferentiation ）:是一個已分化的細(xì)胞恢復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞 狀態(tài)的過程。.細(xì)胞分化（differentiation ）:指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，并引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。形

9、成愈傷組織.脫分化后1I形成胚性組織一體細(xì)胞胚.在離體培養(yǎng)條件下，植物細(xì)胞經(jīng)過再分化形成完整個體可以通過兩種途徑：一是器官發(fā)生，二是體細(xì)胞胚胎發(fā)生。.器官發(fā)生途徑：是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。經(jīng)過愈傷組織：愈傷組織 一生長中心形成 一器官原基及器官形成.器官發(fā)生過程 廠莖尖培養(yǎng)中芽的形成、不經(jīng)過愈傷組織I外植體直接發(fā)生芽.體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑：植物離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)歷了類似于胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物，稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。.直接發(fā)生途徑： 體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生間接發(fā)生途徑：由愈傷組織形成.在植物組織培養(yǎng)過程中，生長素與細(xì)胞

10、分裂素的比例低則產(chǎn)生苗，比例高則生根，比例大致相等則產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的愈傷組織。.植物組織培養(yǎng)的研究意義：繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高。占用空間小，不受季節(jié)限制，便于工廠化育苗。保持植物種性。繁殖各種珍稀、瀕危、名貴、突變物種。.植物組織培養(yǎng)的基本步驟：(1)培養(yǎng)材料(外植體)的選擇(2)培養(yǎng)材料(外植體)處理(消毒等)(3)制備外植體、接種、培養(yǎng)(4)愈傷組織的誘導(dǎo)、分化(5)培育苗的煉苗移栽。.試管苗玻璃化(vitrification ):是指組織培養(yǎng)過程中的特有的一種生理失調(diào)或生理 病變，試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。玻璃化苗絕大多數(shù)為來自莖尖或莖段培養(yǎng)物的不定芽。.控制和克服玻璃化苗的措施：

11、針對以上玻璃化苗的產(chǎn)生原因，可采取以下措施來減輕玻璃化現(xiàn)象發(fā)生(1)降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度，添加低濃度多效睫、矮壯素等生長抑制 物質(zhì)。(2)控制適宜的培養(yǎng)溫度，避免溫度過高，變溫培養(yǎng)時注意溫差不宜過大。(3)使用透氣性好封口材料，改善培養(yǎng)容器的痛風(fēng)換氣條件，降低容器內(nèi)濕度。(4)適當(dāng)增加培養(yǎng)基瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基的水勢。(5)減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量，選用低NH4球平的B5培養(yǎng)基。(6)增加自然光照，光照強(qiáng)度較弱時，可通過延長時間進(jìn)行補(bǔ)償。(7)控制繼代次數(shù)。三、離體培養(yǎng)下的遺傳與變異.離體培養(yǎng)下的遺傳與變異的特點(diǎn)：離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性；變異的普遍性、局限性、嵌合性。.看家基

12、因(house keeping gene):是維持細(xì)胞最低限度功能所不可少的基因。. 組織特異性基因/奢侈基因(tissue-specific gene):這類基因與各類細(xì)胞的特殊性有直 接的關(guān)系，是在各種組織中進(jìn)行不同的選擇性表達(dá)的基因。.細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱稱為發(fā)育潛能。.細(xì)胞發(fā)育成完整個體的潛能稱為 細(xì)胞的全能性。.在發(fā)育過程中，細(xì)胞的發(fā)育潛能逐漸變窄，細(xì)胞逐漸失去發(fā)育成完整個體的潛能，只能分化出多種組織、細(xì)胞的這種發(fā)育潛能叫做多能性。.去分化：在某些條件下，分化細(xì)胞也不穩(wěn)定，其基因活動模式會發(fā)生可逆的變化，又回到未分化狀態(tài)，這一過程稱為去分化。.轉(zhuǎn)基因技術(shù)基本步驟：(切、接、轉(zhuǎn)、增、檢)

13、(1)目的基因的獲得構(gòu)建重組DNA(3)重組DNA分子引入受體細(xì)胞(4)表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞的篩選.植物組織： 永生組織：植物發(fā)育早期，細(xì)胞是有分裂能力的，在生長發(fā)育過程中，細(xì)胞陸續(xù)分化失去分裂能力，成為具有特定功能的細(xì)胞組織。分生組織.真核細(xì)胞的體積一般是原核細(xì)胞的1000倍，真核細(xì)胞如何解決細(xì)胞內(nèi)重要分子的濃度問題？答：出現(xiàn)了特化的內(nèi)膜系統(tǒng)，這樣，雖然體積增大了，表面積也大大增加，并使細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)區(qū)室化，一些重要分子的濃度并沒有被稀釋。.由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株統(tǒng)稱為體細(xì)胞無性系(somaclons)。而把這些植株所表現(xiàn)出來的變異稱之為 體細(xì)胞無性系變異(somaclonal v

14、ariation )。.離體培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)：細(xì)胞分裂(有絲分裂)。.體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)：堿基突變 DNA序列的選擇性擴(kuò)增與丟失轉(zhuǎn)座子活化 DNA甲基化.愈傷組織也稱無性細(xì)胞系，是非嚴(yán)格意義上的克隆。.影響離體培養(yǎng)遺傳和變異的主要因素：外植體的來源。外源激素。繼代培養(yǎng)時間。再生植株的方式。 外植體細(xì)胞中已有變異。.植物體細(xì)胞變異的應(yīng)用：改良作物品種，拓寬種質(zhì)資源。加強(qiáng)外源基因向栽培種的漸滲。 遺傳學(xué)研究：突變體直接用于基因功能的鑒定。發(fā)育生物學(xué)研究：利用體細(xì)胞突變策略對植物發(fā)育的基因調(diào)控研究。代謝研究。四、植物脫毒與快速繁殖.愈傷組織培養(yǎng)的基本過程：(1)愈傷組織的形成 啟動期(或誘導(dǎo)

15、期)：主要是指細(xì)胞或原生質(zhì)體準(zhǔn)備分裂的時期，需要采用合適的 誘導(dǎo)劑，如IAA、NAA、2, 4-D等。分裂期：開始分裂并不斷增生子細(xì)胞的過程，細(xì)胞持續(xù)分裂后形成大量細(xì)胞團(tuán)和愈傷組織。分化期：愈傷組織的細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生一系列形態(tài)和生理的變化，分化出形態(tài)和功能不同的細(xì)胞。(2)愈傷組織的生長(3)愈傷組織的分化和形態(tài)發(fā)生eg:離體的植物組織、細(xì)胞傷組織 根芽植株切開胡蘿卜，在中間取一塊組織形成層開始形成愈傷組織3-4周后完全形成愈傷組織狀態(tài)(組織塊失去色素)把脫分化后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上兩周后開始長出幼苗將幼苗移栽到外部條件下培養(yǎng)(馴化).如何在一個已經(jīng)受感染的群體中獲得無病植株？種子繁殖消除

16、病原國.消除病原菌的方法又是什么？熱處理：熱水或熱空氣莖尖處理愈傷組織培養(yǎng).當(dāng)前脫除植物病毒的方法有：莖尖培養(yǎng)脫毒法熱處理脫毒法微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法珠心組織脫毒法愈傷組織脫毒法.脫除植物病毒的原理及方法(1)莖尖培養(yǎng)脫毒法：病毒在植物體內(nèi)分布是不均一的，越接近生長點(diǎn)，病毒濃度越稀。因此有可能利用莖尖離體培養(yǎng)脫除植物病毒。(2)熱處理脫毒法：熱處理雖然不能殺死病毒，但能鈍化病毒的活性，使其增殖減緩或停止從而失去浸染能力。 在分裂細(xì)胞中，正常核蛋白合成占優(yōu)勢， 而在細(xì)胞生長期間是病毒核蛋白的合成占 優(yōu)勢。熱處理可以加速植物細(xì)胞的分裂，抑制病毒繁殖。.無病毒植株脫毒程序(莖尖培養(yǎng)為例)材料準(zhǔn)備-生

17、長點(diǎn)的分離和培養(yǎng)-無病毒植株的鑒定(血清鑒定法、生物鑒定法)-無毒原 種苗的繁殖五、植物特殊倍性創(chuàng)制.染色體組：遺傳學(xué)上把二倍體生物一個正常配子中所含的全部染色體稱為一個染色體 組。.整倍體(多倍體、單倍體)：體細(xì)胞含有完整染色體的類型。.非整倍體(超倍體、亞倍體)：染色體組內(nèi)個別染色體數(shù)目有所增減，使細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的完整倍數(shù)。.多倍體(polyploid ):指每個體細(xì)胞中含有三個或更多染色體組的個體。(1)同源多倍體：是指增加的染色體組來自同一物種，一般是由二倍體的染色體直接加倍得到的。(2)異源多倍體：是指增加的染色體組來自不同物種，一般是由不同種屬間的雜交種染色體加倍形成的

18、。.多倍體的產(chǎn)生途徑：(1)自發(fā)形成。(2)人工誘發(fā)體細(xì)胞染色體數(shù)加倍。(3)秋水仙素處理分身組織，阻礙分裂細(xì)胞紡錘絲的形成。.染色染色體工程：是人們按照一定的設(shè)計(jì)， 有計(jì)劃地削減、添加或代換同種或異種染色 體，從而達(dá)到定向改變遺傳性狀和選育新品種的一種技術(shù)。(廣義上講，染色體工程還包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)，因此也稱作染色體操作技術(shù)。).人工誘導(dǎo)多倍體的方法：(1)生物學(xué)方法：胚乳培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交、種間雜交。（2）物理學(xué)方法：溫度休克法、水靜壓法、高鹽高減法。 溫度休克法：冷（1-5C）、熱（30c左右）；關(guān)鍵：能否成功地阻止第二次 成熟或第二極體的排出。（3）化學(xué)方法：細(xì)胞松弛素 B

19、、秋水仙素。核體積測量法蛋白質(zhì)電泳r間接法 生化分析I形態(tài)學(xué)檢查.多倍體的鑒定方法：（染色體計(jì)數(shù)直接法* DNA含量測定.多倍體的應(yīng)用克服遠(yuǎn)緣雜交的不孕性?？朔h(yuǎn)緣雜交的不實(shí)性。創(chuàng)造種間雜交育種的中間親本：實(shí)質(zhì)是克服遠(yuǎn)緣雜交不育性。人工合成新物種、育成植物新類型，人工合成同源多倍體、異源多倍體。.單倍體：具有配子染色體數(shù)目的個體。.單倍體的優(yōu)點(diǎn)：只有一套染色體，每個基因都能得到表現(xiàn)， 較易發(fā)生突變，變異當(dāng)代便可表現(xiàn)出來， 便于早期識別選擇；快速得到純合體，縮短育種年限，提高育種效率；合成育種新材料。.單倍體產(chǎn)生的途徑孤雌生殖、無配子生殖：延遲花粉、輻射處理花粉、化學(xué)誘導(dǎo)、利用遠(yuǎn)緣花粉授粉。 染

20、色體有選擇地消失。 離體培養(yǎng)：花藥（花粉）培養(yǎng)；未授粉子房、胚珠培養(yǎng)。.花藥培養(yǎng)：是指未成熟的花藥接種在人工培養(yǎng)基上分化為植株的過程。（花藥是一個植株上的器官，屬于器官培養(yǎng)；花粉是一個單細(xì)胞，屬于細(xì)胞培養(yǎng)。）.雌核發(fā)育（gynogenesis）:俗稱假受精，意指精子雖然正常地鉆入和激活卵子，但精 子的細(xì)胞核并未參與卵球的發(fā)育，精子的染色體很快消失， 胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳的控制下進(jìn)行。.精子遺傳物質(zhì)的失活物理方法：丫射線、X射線（具有較高的穿通能力， 其主要作用是誘使染色體斷裂， 因而對精子的存活有一定影響）；紫外射線（誘使胸腺喀咤二聚化）?；瘜W(xué)方法：甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素、二甲基硫酸顯微手術(shù)法細(xì)

21、胞分裂的失活.雌核發(fā)育（androgenesis）:是指因經(jīng)過紫外線、x射線或丫射線處理的卵子與正常的 精子受精，再在適當(dāng)時間施以冷、熱或高壓等物理處理，抑制第一次卵裂，使進(jìn)入卵子內(nèi)的染色體加倍，而發(fā)育成為完全表現(xiàn)父本遺傳性狀的二倍體。.染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)：又稱為染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)，是指把同特性基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片 段轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞中，使之能得以表達(dá)，并能在細(xì)胞分裂中一代一代傳遞下去的技術(shù)。.主要方法：微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法，染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法。.微細(xì)胞：只有一條或幾條染色體和一層薄層細(xì)胞質(zhì)，外面包裹一層完整的細(xì)胞質(zhì)膜的核質(zhì)體。.染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法的基本步驟：使細(xì)胞分裂同步，阻斷細(xì)胞分裂于中期；破碎

22、細(xì)胞，離心收集中期染色體；通過適當(dāng)?shù)姆诸愞D(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中。.真核細(xì)胞的染色體的關(guān)鍵序列：著絲粒、端粒、自主復(fù)制序列。.微細(xì)胞的制備：利用秋水仙素處理， 將細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期， 在染色體周圍逐漸形 成核膜而成為眾多微核，然后用細(xì)胞松弛素 B處理微核突出細(xì)胞膜外，經(jīng)過離心獲得微 細(xì)胞。.微細(xì)胞融合：以微細(xì)胞做供體，通過與遺傳性完整的受體細(xì)胞融合，可以將微細(xì)胞內(nèi)所含有的幾條染色體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。六、植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn). 植物次生代謝物 (plant secondary metabolite ):是指植物生活細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)生的， 大多對生物體代謝沒有什么明顯功能，但卻對生物體具有選擇

23、性優(yōu)勢的一類化合物。.次生代謝物或次生產(chǎn)物是由糖類、脂肪、氨基酸等初級產(chǎn)物的代謝衍生出來的，一般儲藏在液泡或細(xì)胞壁中，為代謝的終產(chǎn)物，大多不參與代謝活動。.植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)：(1)細(xì)胞系的建立和選擇：懸浮細(xì)胞系-單細(xì)胞培養(yǎng)與篩選 f種細(xì)胞增殖(2)優(yōu)良細(xì)胞系的增殖培養(yǎng)(3)大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立：一步法逐漸放大(對于細(xì)胞生長與目的產(chǎn)物合成同步的類型)；兩步法。(4)提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑：明確植物細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成的關(guān)系：生長偶聯(lián)型(產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長成正比)；中間型(產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長下降時合成，細(xì)胞處于指數(shù)生長期或停止生長產(chǎn)物都不合成)；非生長偶聯(lián)型(產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長停止后)。選

24、擇適宜的起始材料。 選擇合適的培養(yǎng)基成分：一般來說，N、P、K能促進(jìn)細(xì)胞生長，則糖濃度有利于次生代謝產(chǎn)物的合成。激發(fā)子的應(yīng)用。a.激發(fā)子：也稱誘導(dǎo)子，是指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞代謝途徑或強(qiáng)度改變，并促使形成細(xì)胞特征自身防御反應(yīng)的分子。b.非生物激發(fā)子：作為植物細(xì)胞的脅迫因子，使植物通過生產(chǎn)特定的次生代謝途 徑或產(chǎn)物作出防御性應(yīng)答反應(yīng)。c.生物激發(fā)子：外源激發(fā)子，多來源于微生物；內(nèi)源激發(fā)子來源于植物本身的物 質(zhì)，如細(xì)胞碎片、寡聚糖等。.原生質(zhì)體培養(yǎng)：植物除去細(xì)胞壁后分離得到的裸露的球形細(xì)胞部分。利用原生質(zhì)體可以進(jìn)行細(xì)胞融合，攝取外源 DNA、細(xì)胞器、細(xì)菌或病毒顆粒。.原生質(zhì)體培養(yǎng)的特點(diǎn)及用途：(1)特

25、點(diǎn)：無細(xì)胞壁，可方便的進(jìn)行細(xì)胞膜和細(xì)胞器研究；同時也為植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化提供了有利條件。具有全能性，可通過原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。通過原生質(zhì)體融合可形成雜種細(xì)胞，為創(chuàng)造新品種集種質(zhì)資源材料提供了途徑。是體細(xì)胞誘變育種的良好材料。(2)用途提供相關(guān)生理生化研究的材料；利用原生質(zhì)體可以攝取病毒、細(xì)菌、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、核酸等外源物質(zhì)的特點(diǎn)，而被用作研究基因表達(dá)和調(diào)控、遺傳工程研究的材料；原生質(zhì)體融合可改變遺傳物質(zhì)，建立雜交品種；同時還可以用于研究染色體行為、 基因定位等；用于細(xì)胞器的分離，或進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞器的遺傳實(shí)驗(yàn)。.原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生：細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂愈傷組織或胚狀體的形成 植株的再生：

26、誘導(dǎo)胚狀體；愈傷組織誘導(dǎo).原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)技術(shù)路線：材料準(zhǔn)備一預(yù)處理一酶解一收集純化一活性檢測一培養(yǎng)一細(xì)胞壁再生一細(xì)胞團(tuán)一愈傷組織一愈傷分化一植物再生。七、原生質(zhì)體培養(yǎng).細(xì)胞融合(cell fusion ):是在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì)體 融合形成一個雜種細(xì)胞的技術(shù)。.細(xì)胞融合的意義：克服遠(yuǎn)緣有性雜交的不親和性：如馬鈴薯和番茄、甘藍(lán)和白菜。創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雜種：轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)控制的性狀，實(shí)現(xiàn)雙親細(xì)胞質(zhì)的融合。為攜帶外源遺傳物質(zhì)(信息)的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造條件。利用細(xì)胞融合技術(shù)觀察蛋白質(zhì)運(yùn)動，意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，擴(kuò)大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。.細(xì)

27、胞融合的主要方法及特點(diǎn)：(1)生物法一一仙臺病毒法：仙臺病毒使兩種不同的動物細(xì)胞之間發(fā)牛凝結(jié),進(jìn)而融合成一體。仙臺病毒促使細(xì)胞融合的因素與病毒被膜上的磷脂成分有關(guān)，而與病毒內(nèi)核酸的活性無關(guān)。(2)化學(xué)融合法：用化學(xué)物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑，促使原生質(zhì)體聚集、粘連和融合的方法。鹽類融合劑：硝酸鈉/鉀/鈣等。多聚物融合劑：多聚賴/鳥氨酸、聚乙二醇(PEG) : PEG促融效果好，而且對 原生質(zhì)體的傷害小。其他化合物：ATR ADP、葡萄糖硫酸鹽等。(3)物理法電融合法：交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠。高頻直流脈沖使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。與PEG比較：不

28、存在對細(xì)胞的毒害問題；融合效率高，技術(shù)操作簡便。.同核體：同源原生質(zhì)體的融合體。.異核體：非同源的原生質(zhì)體的融合體。.植物融合細(xì)胞篩選方式：(1)遺傳互補(bǔ)篩選法；利用每一親本貢獻(xiàn)一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，從而令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。(2)抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。(3)物理特性篩選法：根據(jù)親本原生質(zhì)體的大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率形成的 愈傷組織的差異等篩選雜種細(xì)胞。(4)生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。.動物細(xì)胞的篩選方式：(1)利用抗藥性篩選(2)營養(yǎng)互補(bǔ)篩選(3)溫度敏感突

29、變型雜種細(xì)胞的篩選.細(xì)胞融合技術(shù)的具體操作過程：植物原生質(zhì)體分離 一原生質(zhì)體純化 一原生質(zhì)體融合 一雜種細(xì)胞的篩選 一細(xì)胞壁再生一愈傷組織形成、器官分化 一雜種植物鑒定。.單克隆抗體生產(chǎn)：(1)抗原：外源性、結(jié)構(gòu)性、特異性(2)血清中的抗體是針對不同抗原決定簇的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。.單抗的制備過程：親本細(xì)胞的選擇細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)單抗的大規(guī)模生產(chǎn).細(xì)胞融合技術(shù)的進(jìn)展與展望：不對稱融合：利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。胞質(zhì)雜種：去掉核后的細(xì)胞質(zhì)與另外一個完整細(xì)胞融合形成的雜種。八、人工種子. 人工種子：狹義：指植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚

30、狀體(包括體細(xì)胞胚和性細(xì)胞胚)，包裹在含有養(yǎng)分和具有保護(hù)功能的物質(zhì)中，并在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體。 廣義：是在胚狀體或一塊組織(頂芽、腋芽)、一個器官(小鱗莖等)之外加上必 要的營養(yǎng)成分(人工胚乳后)，用具有一定通透性而無毒的材料將其包裹起來，形成的與天 然種子相似的顆粒體。.人工種子的結(jié)構(gòu)海藻酸鹽人工種皮：膠囊式結(jié)構(gòu)+Ca(NO3)2 J蟄合物體細(xì)胞胚人工胚乳：碳源、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、抗生素、親水劑、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。體細(xì)胞胚：由組織培養(yǎng)中獲得的體細(xì)胞及胚狀體、愈傷組織、原球莖、不定芽、頂 芽、腋芽、小鱗莖等繁殖體組成。.人工種子的分類：裸露的或休眠的繁殖體，人工種皮包被的繁殖體，水凝膠

31、包埋再包被人工種子的繁殖體。.人工種子的意義：在無性繁殖植株植物中，有可能建立一種高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品種的種性，又可以使之具有生苗的復(fù)壯效應(yīng)?？梢詫?yōu)異雜交種種子不通過有性制種而快速獲得大量種子，特別是對于那些制種困難的植物更具有主要的適用意義。對于一些不能正常產(chǎn)生種子的特殊植物材料，如三倍體、非整倍體、工程植物等， 有可能通過人工種子在短期內(nèi)加大繁殖應(yīng)用。與田間制種相比，可以節(jié)省制種用地，且不受季節(jié)限制，可以實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，同時還避免了種子攜帶病原菌的危險。與利用試管苗相比， 可以避免移栽困難， 且可以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化操作， 同時還便于儲藏 和運(yùn)輸。.人工種子的局限性：儲藏困難成本

32、較高體細(xì)胞無性系變異。.人工種子制備的技術(shù)要點(diǎn)：胚狀體的收集 胚狀體的同步化(過篩法、密度梯度離心法)營養(yǎng)液的配制 包埋劑的選擇(褐藻酸鈉、瓊脂糖等)種皮的制備胚狀體的包埋人工種子的保存.包埋的方法：液膠包埋法、干燥包埋法、水凝膠法。九、動物細(xì)胞工程概述.動物細(xì)胞： 無細(xì)胞壁倍增時間長，生長緩慢需氧量少，對攪拌敏感原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開始退化.動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。.優(yōu)點(diǎn)：理化環(huán)境可以控制。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后形成的細(xì)胞系和細(xì)胞株特征均一。培養(yǎng)物可直接被觀測。提供大量均一的

33、細(xì)胞供制備用。便于進(jìn)行人工篩選。可觀察細(xì)胞代謝活動和反應(yīng)。(7)廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、分化及發(fā)育、細(xì)胞毒理試驗(yàn)及生物技術(shù)等各個領(lǐng)域。.原代培養(yǎng)(primary culture ):又稱初代培養(yǎng)，是指將機(jī)取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)的過程。實(shí)效培養(yǎng)的細(xì)胞大約增值10代左右，這樣的細(xì)胞稱為原代培養(yǎng)。.傳代培養(yǎng)(passage culture ):從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。.細(xì)胞系：由初代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進(jìn)行無限次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞群稱作細(xì)胞系。.體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)形態(tài)特征及生長方式分為：貼附型細(xì)胞：細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合（成纖維細(xì)胞壁、上皮、游走、多形）非貼附型細(xì)胞：體外生

34、長不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長， 因此也叫懸浮型細(xì)胞。.懸浮培養(yǎng)（suspension culture ）:指的是一種在受到不斷攪動或搖動的液體培養(yǎng)基里， 培養(yǎng)單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)可在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行；大規(guī)模的需要利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)。懸浮培養(yǎng)分為兩種類型：分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。.體外培養(yǎng)細(xì)胞的特點(diǎn)：貼附接觸抑制密度抑制.接觸抑制：細(xì)胞從接種到長滿底物表面后，由于繁殖數(shù)量增多，相互接觸后不再增加。.細(xì)胞系的生長過程：原代培養(yǎng)期、傳代期、衰退期。.細(xì)胞株：細(xì)胞系經(jīng)過克隆或其他方法而得的單一類型的細(xì)胞群體。.每代細(xì)胞的生長過程：潛伏期、指數(shù)生長期、穩(wěn)定期、衰退期。.動物細(xì)胞培養(yǎng)必需的溶液：平衡鹽溶液（BSS :生理鹽水和葡萄糖制成。用途：洗滌組織細(xì)胞；配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液；維持滲透壓；提供緩沖系統(tǒng)；提供水分和無機(jī)鹽。大多數(shù)平衡鹽溶液內(nèi)附加的葡萄糖