1、抗原修復(fù)間接法不同修復(fù)時間的效果比較討論甲醛固定的標本，因抗原決定簇和醛的交聯(lián)作用而使抗原被封閉，在進展抗體標記前，要通過修復(fù)的方法盡量把抗原暴露出來?？乖迯?fù)的直接法是指將修復(fù)液直接放入高壓鍋內(nèi)對切片進展加熱修復(fù)，而間接法是指把修復(fù)液先放入容器內(nèi)再放入高壓鍋中，然后對容器里的切片進展加熱修復(fù)。本文通過不同修復(fù)時間的間接法和直接法比照實驗，討論適宜修復(fù)時間的間接法在免疫組化中的應(yīng)用。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 標本 選取我院病理科2021 年6月12 月已證實抗原表達呈陽性的腫瘤標本15 例，標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，厚4m。1.1.2 試劑 常用抗體 P

2、63、CD56、SY、ER、PR、C-erbB-2、CK-pan、CD34、Bcl-2、CD45、TTF-1、CK5/6、P504S、CD117、CD2 共 15 種。檸檬酸抗原修復(fù)液0.01 M，PH 6.0、EDTA 抗原修復(fù)液0.01 M，PH9.0、PBS緩沖液0.01 M，PH 7.4、即用型快捷免疫組化MaxvisionTM試劑盒。以上試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)。1.1.3 儀器 烤箱、電熱高壓鍋、培養(yǎng)箱等。1.2 方法1.2.1 直接法 高壓鍋法：取一定量檸檬酸抗原修復(fù)液( 1500 ml )放入高壓鍋中，加熱至沸騰，將置于耐高溫塑料架上的切片放入，蓋上鍋蓋扣上壓力閥，繼續(xù)加

3、熱2 min，翻開排氣閥，冷卻至室溫備用。煮沸法：取EDTA抗原修復(fù)液( 1500 mL )放入高壓鍋中，加熱至沸騰，將切片放入，蓋上鍋蓋不擰緊不扣壓力閥，繼續(xù)加熱20 min，冷卻至室溫備用。1.2.2 間接法 高壓鍋法：取一定量( 250 mL)檸檬酸抗原修復(fù)液于耐高溫塑料容器中，將容器放入盛水的高壓鍋中，加熱至沸騰，將切片放入容器內(nèi)，蓋上鍋蓋扣上壓力閥，繼續(xù)加熱，分別在2、3、5 min后，翻開排氣閥，測量容器內(nèi)外溫度，取出容器，冷卻至室溫備用。煮沸法：取EDTA抗原修復(fù)液( 250 ml )于耐高溫塑料容器中，將容器放入盛水的高壓鍋中，加熱至沸騰，將切片放入，蓋上鍋蓋不擰緊不扣壓力閥，

4、繼續(xù)加熱，分別在5、10、20、25、30 min后，測量容器內(nèi)外溫度，取出容器，冷卻至室溫備用。1.2.3 免疫組化染色 檢測步驟參照試劑盒操作說明進展，用PBS代替一抗作為陰性對照，每種抗體均用即用型抗體濃度進展實驗。染色結(jié)果判斷按陽性細胞百分數(shù)和染色強度計分：百分數(shù)為0計0 分，25%計1分，26%50%計2分，51%75%計3分，75%計4 分；染色強度無色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分。兩種計分相加，0 分為陰性-，23 分為陽性+，45分為陽性+，67分為陽性+，由2位病理醫(yī)師采用雙盲法進展評分。2 結(jié)果在高壓鍋間接法中，剛沸騰時容器內(nèi)外溫差相差較大14

5、，隨著時間的增加，3min后，容器內(nèi)外溫度接近9596；在煮沸間接法中，剛沸騰時容器內(nèi)外溫差相差14，時間增加至10min后，容器內(nèi)外溫度接近9596 。隨著時間增加，染色效果逐漸增強，在高壓鍋間接法中加熱5min后以及在煮沸間接法中加熱30min后，修復(fù)所經(jīng)歷的單位時間溫度95 2min、95 20min與直接法相當，染色效果接近。3 討論目前，免疫組化已成為臨床病理診斷必不可少的輔助手段，在鑒別診斷、預(yù)后評估和指導(dǎo)治療等方面起著非常重要的作用。染色過程中抗原修復(fù)是關(guān)鍵步驟，它能把甲醛固定的標本封閉的抗原決定簇中的交聯(lián)構(gòu)造打破，使抗原蛋白分子鏈脫離其它束縛或聯(lián)結(jié)，恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)，使抗

6、原不同程度重新暴露出來，更好地與相應(yīng)抗體反響，進步陽性表達率和表達強度，到達理想的標記效果，大多數(shù)標本都要經(jīng)過這一處理，是決定染色成敗的主要因素之一?？乖迯?fù)直接法的修復(fù)效果是肯定的，但對于小批量的染色修復(fù)液浪費過大。本實驗發(fā)現(xiàn)，用一樣的時間對同一抗原進展修復(fù)，間接法和直接法修復(fù)效果相差較大，但用不同的時間通過間接法對抗原進展修復(fù)，隨著時間的增加，修復(fù)效果逐漸增強。當容器內(nèi)外的溫度接近時，再用直接法一樣的時間繼續(xù)加熱，最終能到達與直接法相當?shù)男迯?fù)效果，說明選擇適宜的修復(fù)時間應(yīng)用間接法對抗原進展修復(fù)是可行的，與齊文娟等報道一致。在抗原修復(fù)間接法中，用檸檬酸抗原修復(fù)液進展高溫高壓修復(fù)時，加熱到3

7、min，容器內(nèi)外溫度接近，故筆者認為加熱時間選擇為5 min修復(fù)效果較好，因修復(fù)所經(jīng)歷的單位時間溫度95 、2 min及染色效果與直接法相當；用EDTA抗原修復(fù)液進展煮沸修復(fù)時，加熱到10 min時，容器內(nèi)外溫度接近，故加熱時間為30 min修復(fù)效果較好，修復(fù)所經(jīng)歷的單位時間溫度95 、20 min及染色效果與直接法相當。本間接法雖然增加了總?cè)旧珪r間，但節(jié)省了修復(fù)液，還防止了鍋體釋放金屬離子對修復(fù)的影響，對小批量的抗體標記染色比較實用，也適宜在標本量少的基層醫(yī)院推廣。由于加熱時間增加，脫片機率有所增加，除切片薄切外，玻片清潔徹底能抑制這一缺點，用廠家經(jīng)過系列處理的專用免疫組化染色玻片效果更好。容器外水位應(yīng)低于容器3 cm左右，以免沸水濺入容器而改變修復(fù)液濃度和pH值從而影響修復(fù)?？乖迯?fù)的完好機制還沒有完全弄清楚，有待于進一步研究。修復(fù)目前還未標準化，也沒有一種抗原修復(fù)方法能適宜各種抗體，抗原修復(fù)受標本固定液、蠟塊保存時間長短、修復(fù)液種